刺老苞根皮黄酮类化合物对MC31E-E1成骨细胞OPG和RANKL mRNA基因表达影响的实验研究

目的:探讨刺老苞根皮黄酮类化合物对MC3T3-E1成骨细胞骨保护素(OPG)和核因子κB受体激活因子配体(RANKL)mRNA基因表达的影响.方法:体外培养MC313-E1成骨细胞,分别加入含0mol·L-1、10-8mol·L-1、10-7mol·L-1、10-6mol·L-1刺老苞根皮黄酮类化合物的培养液,48h及96h后分别提取细胞总mRNA,用RT-PCR方法分析OPG/RANKL的mRNA的表达,进行半定量分析.结果:培养48h后,与对照组比较,刺老苞根皮黄酮类化合物增强了OPGmRNA的表达,有显著性差异(P<0.05或P<0.01),VOPG/VRANKL比值增大;96h后,刺老苞根皮黄酮类化合物明显增强了OPG mRNA的表达,各浓度组与对照组相比,均有显著性差异(P<0.05或P<0.01),各浓度组VOPG/VRANKL比值增大,有显著性差异(P<0.05或P<0.01).结论:刺老苞根皮黄酮类化合物可能通过增加成骨细胞OPG的表达来抑制破骨细胞的分化和成熟,从而抑制骨吸收,达到治疗骨质疏松症的目的.     

淫羊藿总黄酮对大鼠成骨细胞代谢调控的机制研究

目的：探讨淫羊藿总黄酮对大鼠成骨细胞代谢调控的影响。方法:取新生SD大鼠的颅骨,胶原酶法培养成骨细胞。应用MTT法、对硝基苯磷酸盐法(PNPP)和RT-PCR方法观察淫羊藿总黄酮对体外培养成骨细胞的增殖、碱性磷酸酶活性和OPG mRNA,RANKL mRNA表达的影响。结果:淫羊藿总黄酮能刺激成骨细胞增殖,提高碱性磷酸酶活性,增强OPG mRNA的表达（P<0.05或P<0.01）。结论:淫羊藿总黄酮能促进成骨细胞的增殖、分化,增加OPG mRNA的表达,对RANKL的表达无明显影响。     

淫羊藿总黄酮含药血清对成骨细胞OPG/OPGL基因表达的影响

目的研究淫羊藿总黄酮含药血清对体外培养成骨细胞骨保护素(OPG)和骨保护素配体(OPGL)基因表达的影响,进一步揭示淫羊藿"补肾壮阳,益精健骨"的作用机制。方法采用中药血清药理学方法制备含淫羊藿总黄酮大鼠血清;用多次酶消化法体外培养成骨细胞;将含淫羊藿总黄酮大鼠血清(SRAT)以5%的质量浓度加入新生大鼠颅骨成骨细胞培养液中,研究它们对OPG/OPGL基因表达水平的影响。OPG/OPGL基因表达水平用RT-PCR法检测。结果半定量RT-PCR显示5%含淫羊藿总黄酮大鼠血清干预成骨细胞时,存在OPG mRNA的转录,在此浓度下,随着时间的延长转录水平逐渐增加,而OPGL mRNA水平随着时间的延长转录水平逐渐减弱。结论淫羊藿总黄酮代谢产物能上调成骨细胞中OPG mRNA的表达、抑制OPGL mRNA的表达,说明淫羊藿总黄酮代谢产物具有促进骨形成活性。     

淫羊藿苷、黄芩苷和大黄素联合作用对牙周炎大鼠牙周组织中RANKL和OPG表达的影响

目的研究淫羊藿苷、黄芩苷和大黄素联合作用对牙周炎大鼠牙周组织中RANKL表达的影响。方法牙周组织局部注射大肠杆菌内毒素制造牙周炎动物模型,将淫羊藿苷、黄芩苷和大黄素联合作用于实验动物,用原位杂交法检测用药前后牙周组织中RANKL的表达。结果空白对照组大鼠牙周组织中RANKL表达上升(P<0.01),OPG表达降低(P<0.05),RANKL/OPG比值上升(P<0.01);实验组RANKL表达量明显较空白对照组低(P<0.05),虽然OPG表达量与空白对照组相比无统计学意义(P>0.05),但RANKL/OPG比值明显低于空白对照组(P<0.05)。结论淫羊藿苷、黄芩苷和大黄素联合作用能够抑制牙周炎大鼠牙周组织中RANKL的表达。     

从ERα/RANK通路探讨淫羊藿苷抑制破骨细胞分化作用

目的:通过检测淫羊藿苷对破骨细胞诱导分化过程中雌激素受体α(estrogen receptorα,ERα),核转录因子-κB受体(receptor activator of nuclear factor-κB,RANK)mRNA表达的影响,探讨淫羊藿苷抑制破骨细胞分化作用机制。方法:50μg·L~(-1)核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor-κB ligand,RANKL)体外诱导RAW264.7细胞分化成破骨细胞,利用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色和骨吸收陷窝对破骨细胞进行鉴定。用不同浓度的淫羊藿苷(1×10-5,1×10-6,1×10-7mol·L~(-1))分别处理5 d和9 d后,进行TRAP染色和骨吸收陷窝分析,处理6 d后,利用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测基质金属蛋白酶-9(MMP-9),组织蛋白酶K(cathepsin-K,CK),TRAP,ERα,RANK mRNA表达水平,用雌激素受体阻断剂ICI182780阻断雌激素受体通路验证淫羊藿苷对ERα/RANK通路的调节作用。结果:与RANKL诱导组比较,淫羊藿苷可以显著抑制破骨细胞形成数量和骨吸收陷窝数(P0.05,P0.01),同时显著下调破骨细胞MMP-9,CK,TRAP,RANK mRNA表达水平(P0.05,P0.01),上调ERαmRNA表达水平(P0.05)。ICI182780可抑制淫羊藿苷上调破骨细胞的ERαmRNA表达水平和下调RANK mRNA表达水平的作用(P0.05)。结论:淫羊藿苷能抑制RANKL诱导RAW264.7向破骨细胞分化和骨吸收活性,该作用可能通过上调破骨细胞的ERαmRNA表达进而下调RANK mRNA表达实现的。     

Influence of total flavonoids of epimedium on the oxidative stress and the expression of peroxisome proliferators activated receptor gamma in hyperlipemia rats

目的 探讨淫羊藿总黄酮对高脂血症大鼠体内过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARγ)表达水平和氧化应激水平的影响.方法 将健康SD雄性大鼠35只随机分为普通饲料组9只和高脂饮食组26只.高脂饮食组给予高脂饲料喂养12周后复制高脂血症大鼠模型.造模成功后随机分为模型对照组8只、淫羊藿大剂量组(200 mg/d)9只及淫羊藿小剂量组(100 mg/d)9只,干预4周后观察各组大鼠血脂水平,检测各组大鼠的超氧化物歧化酶(SOD)活性、血清丙二醛(MDA)水平及PPARγ的表达水平.结果 模型对照组甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)水平均明显高于普通饲料组(P＜0.01).淫羊藿总黄酮大、小剂量组TG、TC水平均明显低于模型对照组(P＜0.05,P＜0.01),且淫羊藿总黄酮大剂量组对TG、TC水平的改善较淫羊藿总黄酮小剂量组更为明显(P＜0.05).淫羊藿总黄酮大、小剂量组对高密度脂蛋白胆固醇( HDL - C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平的影响无统计学意义(P＞0.05).模型对照组大鼠干预后SOD活性较普通饲料组降低(P＜0.01),MDA水平升高(P＜0.01).淫羊藿总黄酮大、小剂量组SOD活性均较模型对照组升高(P＜0.01),MDA水平降低(P＜0.01),且淫羊藿总黄酮大剂量组较淫羊藿总黄酮小剂量组更能明显增加SOD活性(P＜0.01)和降低MDA水平(P＜0.01).模型对照组大鼠干预后PPARγ表达水平较普通饲料组明显降低(P＜0.05).淫羊藿总黄酮大、小剂量组大鼠PPARγ表达水平均较模型对照组明显升高(P＜0.01),且淫羊藿总黄酮大剂量组升高明显(P＜0.01).结论 淫羊藿总黄酮能够提高高脂血症大鼠血清SOD水平,降低MDA水平,改善氧化应激,对内皮有保护作用,其机制可能是上调体内PPARγ的表达水平.     

淫羊藿苷对Ⅱ型胶原诱导型关节炎大鼠骨破坏及血清RANKL/OPG的干预作用

目的 观察淫羊藿苷对Ⅱ型胶原诱导型关节炎（collagen-induced arthritis,CIA）大鼠血清破骨细胞分化因子（receptor activator of NFκB-ligand,RANKL）和护骨素（osteoprotegerin,OPG）的影响及对骨破坏的保护作用。方法 除正常组（8只）外,其余大鼠用牛Ⅱ型胶原和完全弗氏佐剂注射诱导建立CIA大鼠模型。选取关节炎指数（arthritis index,AI）≥6分的CIA大鼠24只,根据其AI评分分为模型组、甲氨喋呤组和淫羊藿苷组,每组8只。正常组和模型组给予生理盐水灌胃,甲氨喋呤组给予甲氨喋呤每周 5 mg/kg灌胃,淫羊藿苷组给予淫羊藿苷20 mg/（kg?d）灌胃,均连续给药4周。每周记录大鼠AI评分。给药结束后,HE染色观察踝关节组织形态学变化;X射线检查足趾骨质破坏与骨质疏松情况;ELISA法测定血清RANKL、OPG水平。结果 给药4周后,与模型组比较,淫羊藿苷组AI评分、Larsen评分、血清RANKL水平及RANKL/OPG比值明显降低,OPG水平明显升高,差异均有统计学意义（P<0.05,P<0.01）;甲氨喋呤组上述指标均降低,差异无统计学意义（P>0.05）。HE染色示淫羊藿苷组关节滑膜增生、炎症细胞浸润与软骨面破坏程度明显减轻。结论 淫羊藿苷能缓解或减轻CIA大鼠骨破坏程度,其作用机制可能与降低CIA大鼠血清RANKL水平,提高OPG浓度进而降低RANKL/OPG比例有关。     

补肾强督方含药血清对强直性脊柱炎OPG/RANKL通路的作用

目的探讨补肾强督方对强直性脊椎炎(ankylosing spondylitis,AS)骨保护素和核转录因子-κB受体活化因子配基(osteoprotegerin receptor activator for nuclear factorκB ligand,OPG/RANKL)通路的作用机制。方法选取2009年1-5月卫生部中日友好医院中医风湿病科门诊和住院活动期AS患者30例,予补肾强督方,每天1剂,早晚分两次口服,连续3个月;另选取健康志愿者30名。采集治疗前后患者血清及健康人血清。将成骨细胞hFOB1.19分为患者治疗前组、治疗后组及健康人组(对照组)。各组细胞分别于含相应血清的基础培养基中进行培养。取成骨细胞培养上清液,采用ELISA法检测成骨细胞OPG/RANKL含量及mRNA表达,采用RT-PCR检测OPG/RANKL蛋白表达。结果与对照组比较,治疗前组成骨细胞OPG含量、OPG mRNA及蛋白表达、OPG/RANKL mRNA及蛋白表达均降低,RANKL mRNA表达升高,差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01);与治疗前组比较,治疗后组OPG含量、OPGmRNA及蛋白表达、OPG/RANKL mRNA及蛋白表达升高,RANKL mRNA表达降低,差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。结论 AS患者血清能直接抑制成骨细胞OPG表达、促进RANKL表达、下调OPG与RANKL比率,补肾强督方治疗后的血清能直接促进成骨细胞表达OPG,抑制表达RANKL,上调OPG与RANKL比率,补肾强督方可能是通过直接上调成骨细胞OPG/RANKL而抑制破骨细胞分化和功能,达到促进骨生成,抑制骨吸收。     

新疆马鹿角提取物对MC3T3-E1成骨细胞RANKL/OPGmRNA表达的影响

目的 研究新疆马鹿角提取物对MC3T3-E1成骨细胞核因子-kβ受体活化因子配体(RANKL)/护骨素(OPG)mRNA表达的影响.方法 体外培养MC3T3-E1成骨细胞,分别加入含不同剂量新疆马鹿角提取物的培养液,72 h后分别提取细胞总RNA,用RT-PCR方法检测RANKL/OPG mRNA表达.结果 培养72 h后RANKL/OPG mRNA表达的灰度值(0.312±0.0710),与对照组(2.017±0.1320)比较,新疆马鹿角提取物呈浓度依赖性降低RANKL mRNA的表达,增加OPG mRNA的表达,各剂量组RANKL/OPG mRNA吸光度比值降低.结论 新疆马鹿角提取物可能通过调节成骨细胞RANKL/OPG的基因表达,而抑制破骨细胞介导的骨吸收.     

淫羊藿总黄酮及其含药血清对成骨细胞增殖及相关基因表达的影响

目的:研究淫羊藿总黄酮(total flavonoids of herba ep im ed ii,HEF)及其大鼠含药血清(HEF-S)、去蛋白含药血清(NP-HEF-S)对体外培养鼠颅骨成骨细胞增殖及骨钙素(osteocalc in,OC)、骨桥蛋白(osteopontin,OP)和Ⅰ型胶原(typeⅠcollagen,COLⅠ)mRNA表达的影响,以了解淫羊藿治疗骨质疏松的可能物质基础,及其对成骨相关蛋白基因表达的作用。方法:HEF及其HEF-S、NP-HEF-S的冻干样品的稀释液分别与鼠颅骨成骨细胞共培养,MTT法测定其增殖率;将NP-HEF-S与鼠颅骨成骨细胞共培养,RT-PCR测定细胞OC、OP和COLⅠmRNA的表达。结果:HEF对细胞增殖无明显影响,且在终浓度为1mg/m l时产生抑制作用;HEF-S在各实验浓度(100~0.1倍原血药浓度)下均能显著促进成骨细胞增殖,且呈一定的剂量依赖关系;NP-HEF-S的作用相似但作用强度略低;10倍量的NP-HEF-S可使OC mRNA表达量明显提高,定量分析表明其表达量近5倍于空白对照组,但对OP和COLⅠmR-NA表达影响甚微。结论:淫羊藿治疗骨质疏松的直接物质基础可能并非HEF,而与其经口给予后吸收入血的HEF代谢产物及其诱生物有关。血清中的HEF代谢产物不仅可促进细胞的分化增殖,且促进其OC mRNA表达。     

去卵巢骨质疏松大鼠骨组织OPG/RANKLmRNA动态表达研究

目的:建立去卵巢大鼠骨质疏松症动物模型,检测造模成功后不同时期大鼠胫骨OPG/RANKLmRNA表达量及血清雌二醇水平,分析OPG/RANKLmRNA表达变化规律。方法:选取3月龄雌性SD大鼠60只随机分为2组即去卵巢组与对照组,每组30只。去卵巢组去除双侧卵巢,对照组仅去除腹腔少许脂肪。分别在造模12周后0个月、6个月、12个月每组随机处死10只,检测不同时期大鼠胫骨OPG/RANKLmRNA表达量及血清雌二醇水平。采用SPSS 17.0软件进行统计,分析数据,得出结论。结果:与对照组相比,去卵巢组胫骨OPGmRNA表达量、血清雌二醇浓度在各时间点上均显著降低(P<0.05),RANKLmRNA表达量则显著增高(P<0.05);去卵巢组0个月与6个月、6个月与12个月比较,胫骨OPGmRNA表达量及血清雌二醇浓度下降,差异具有统计学意义(P<0.05),RANKLmRNA表达量增高,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:造模成功后12个月内,去卵巢大鼠胫骨骨组织OPGmRNA表达量持续减少,血清雌二醇浓度均持续降低,RANKLmRNA持续高表达,OPG/RANKL比值缩小。     

灯盏花对成骨细胞及破骨前体细胞OPG/RANKL/RANK表达的影响

目的 研究不同浓度和不同作用时间的灯盏花对体外培养的成骨细胞和破骨前体细胞中OPG/RANKL/RANK mRNA及蛋白表达的影响,初步探讨灯盏花对骨改建的作用及其机制。方法 体外培养人MG63细胞和小鼠RAW264.7细胞,分别取第三代细胞分为对照组和不同的实验组,分别应用不同浓度的灯盏花（0、0.001、0.01、0.1、1 mg/mL）干预48 h后提取总RNA和蛋白质,同时单独对0、1 mg组设12、24、48 h时间点提取蛋白质,采用半定量RT PCR方法检测MG63细胞OPG mRNA和RANKL mRNA的表达以及RAW264.7细胞RANK mRNA的表达,采用Western blot法检测MG63细胞OPG蛋白和RANKL蛋白的表达以及RAW264.7细胞RANK蛋白的表达。结果 灯盏花随浓度（0、0.001、0.01、0.1、1 mg/mL）增高,干预48 h后MG63细胞OPG mRNA和蛋白表达逐步降低（P〈0.05）;MG63细胞RANKL mRNA和蛋白表达逐步增加（P〈0.05）;RAW264.7细胞RANK mRNA表达增加（P〈0.05）,但0.1 mg/mL组较0.01 mg/mL组 mRNA表达稍降低,RANK蛋白表达逐步增加（P〈0.05）。1 mg/mL灯盏花干预12、24、48 h后MG63细胞OPG蛋白表达随时间逐步降低（P〈0.05）、RANKL蛋白表达随时间逐步增加（P〈0.05）;RAW264.7细胞RANK蛋白表达随时间逐步增加（P〈0.05）。结论 灯盏花大致上呈剂量和时间依赖性抑制成骨细胞OPG表达,促进成骨细胞RANKL的表达和破骨前体细胞RANK的表达,灯盏花可能有促进骨吸收的作用。     

薯蓣皂苷元对大鼠成骨细胞增殖、分化及OPG/RANKL mRNA表达的影响

目的:研究薯蓣皂苷元对体外培养的大鼠成骨细胞增殖、分化及护骨素/核因子κB受体活化因子配基(OPG/RANKL) mRNA的影响,探讨薯蓣皂苷元预防与治疗骨质疏松的作用机制。方法:在体外培养的大鼠成骨细胞培养基中分别加入不同浓度的薯蓣皂苷元作用不同时间,用MTT法检测药物对成骨细胞增殖的影响,检测成骨细胞内ALP活性分析药物对成骨细胞分化的影响,用半定量RT-PCR检测成骨细胞内OPG/RANKL mRNA的表达量,分析药物对破骨细胞重要信号传导通路OPG/RANKL/RANK系统的影响。结果:3.64×10-8-3.64×10-7mol/L的薯蓣皂苷元作用于大鼠成骨细胞3d,可促进成骨细胞的增殖(P<0.01),上调成骨细胞内OPG/RANKL mRNA的比值(P<0.01);作用7d,可提高成骨细胞内ALP活性(P<0.05或P<0.01)。结论:适量浓度薯蓣皂苷元可促进成骨细胞的增殖、分化及抑制破骨细胞的形成。     

两种杜仲黄酮类化合物对成骨细胞OPG/RANKL及成骨相关转录因子的影响

目的:研究杜仲黄酮类化合物紫云英苷和黄芩素对成骨细胞特异性转录因子Osterix及破骨细胞抑制因子与核因子κB受体活化因子配体比值(OPG/RANKL)的影响。方法:采用MC3T3-E1 Subclone 14成骨细胞,不同浓度紫云英苷和黄芩素和维生素D3组加入质量浓度为30 mg·L-1作用细胞24 h后,用MTT法检测细胞增殖情况,成骨细胞接种于24孔板后,空白组加入培养基,给药组分别加入质量浓度为80 mg·L-1(高浓度),40 mg·L-1(中浓度),7.5 mg·L-1(低浓度)的含紫云英苷或黄芩素,作用24 h后,ELISA法检测钙离子活性,蛋白免疫印迹法检测Osterix,OPG以及RANKL的蛋白表达水平。结果:与空白组相比,紫云英苷和黄芩素可后明显促进MC3T3-E1 Subclone 14成骨细胞的增殖(P<0.05);明显上调OPG和Osterix的表达(P<0.05),同时能降低RANKL的表达(P<0.05)。结论:杜仲黄酮类化合物紫云英苷和黄芩素能促进MC3T3-E1Subclone 14成骨细胞增殖,并上调Osterix和OPG/RANKL。     

脱氢表雄酮对成骨细胞ERβ的上调节作用

 目的研究脱氢表雄酮(DHEA)对成骨细胞雌激素受体(ER)亚型的调节及防治绝经后骨质疏松的作用机制。方法取新生2～4 d BALB/c小鼠颅骨,用酶消化法进行成骨细胞原代培养并鉴定。取原代培养的成骨细胞,模仿雌激素撤退现象后,给予不同时间1×10^-7mol·L^-1的DHEA培养,透射电镜观察细胞器的变化,RT-PCR分析成骨细胞护骨素(OPG)/破骨细胞分化因子(RANKL),ER亚型的表达;同时分析ER亚型与OPG生成的相关性。结果1×10^-7mol·L^-1的DHEA使成骨细胞的细胞器更为丰富,糖原减少,高尔基体发达且分层增多;对成骨细胞ERα的表达无明显影响,却增高OPG/RANKL,ERβ的表达(均为P<0.01),二者的表达水平呈明显正相关(P<0.01)。结论DHEA能够增高OPG/RANKL的表达,从而抑制骨的吸收;其作用机制与ERβ的上调有关。     

薯蓣皂苷片对类风湿性关节炎大鼠血清OPG/RANKL水平表达的干预作用

目的观察薯蓣皂苷片对类风湿性关节炎模型大鼠血清骨保护素(OPG)、核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)表达水平的影响。方法 SD大鼠,随机分为6组,每组10只,其中选取10只作为正常组,其余大鼠采用弗氏完全佐剂复制类风湿性关节炎动物模型,并将造模成功的类风湿性关节炎大鼠随机分为模型组、阳性组(甲氨蝶呤组,3.8mg·kg~(-1))、薯蓣皂苷片高、中、低剂量组(10 mg·mL~(-1)、20 mg·mL~(-1)、30mg·mL~(-1)),连续灌胃给药治疗24 d后处死,采用ELISA法检测血清OPG、RANKL水平。结果薯蓣皂苷片各剂量组大鼠血清OPG、RANKL水平分别为(95.27±4.24)、(76.44±4.09)、(69.26±5.63)pmol·L~(-1)和(96.07±4.94)、(85.41±3.75)、(67.53±2.23)pmol·L~(-1),与模型组((53.92±2.83)pmol·L~(-1)和(116.18±3.02)pmol·L~(-1))相比均有显著性差异(P0.05);OPG/RANKL比值显著高于模型组。结论薯蓣皂苷片可能通过调整OPG/RANKL动态平衡而对破骨细胞功能产生影响,从而防止骨破坏。