热休克蛋白60在激活的小胶质细胞中的表达及基因调控

目的研究细菌脂多糖（LPS）激活的小胶质细胞中热休克蛋白60（HSP60）的表达情况及其基因调控。方法分离SD大鼠的小胶质细胞,经LPS激活后,应用Western-Blot方法检测细胞中HSP60蛋白的表达,real-time PCR法检测细胞中HSP60 mRNA的量,并进一步检测热休克因子1（HSF-1）表达的变化。结果在激活的小胶质细胞中,HSP60的蛋白及mRNA水平均显著升高,其转录因子HSF-1的水平也相应增高。结论在激活的小胶质细胞中,HSF-1蛋白表达显著提高,HSP60 mRNA及蛋白合成增强,参与细胞的应激反应。     

聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1对热休克蛋白60的抑制作用

目的 观察聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(PARP-1)对早产儿脑室周围白质软化(PVL)小鼠模型及体外培养的少突胶质前体细胞中的热休克蛋白60(HSP60)表达的调控作用.方法 建立未成熟小鼠野生型(Wild-type)和PARP-1基因缺失型小鼠脑白质损伤模型,术后取脑,冰冻切片,采用免疫荧光标记法对切片内HSP60进行染色,并在荧光显微镜下观察HSP60的表达.体外培养的少突胶质前体细胞经PARP-1的抑制剂3,4-dihydro-5-[4-(1-piperidinyl)butoxyl]-1(2H)-isoquinoline(DPQ)或激活剂Etopside预处理,再经IFN-r激活后,应用Western-blot方法检测细胞内HSP60的表达情况.结果 在PARP-1基因缺失型小鼠脑白质损伤模型脑中,HSP60的表达量明显高于Wild-type组(P＜0.05).PARP-1抑制剂DPQ能够明显增强HSP60的表达,而PARP-1激活剂Etopside可显著抑制HSP60的表达.结论 PARP-1对HSP60的基因表达具有负调控作用.     

重组人热休克蛋白70D的免疫佐剂样效应研究

目的：研究重组人热休克蛋白70D(rhHSP70D)蛋白的免疫佐剂样效应。方法：用rhHSP70D诱导体外培养的树突状细胞（DC），观察DC分泌前炎性细胞因子的水平、DC成熟及刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力；用rhHSP70D与OVA257-264体外交联的蛋白免疫C57BL/6小鼠，观察能否诱导产生抗原特异性免疫保护作用。结果：rhHSP70D可以明显刺激DC分泌IL-1β、IL-12p70、TNF-α等细胞因子，可以促进DC表达HLA-DR、CD86、CD40等膜分子，增强DC诱导同种异体T淋巴细胞增殖的能力；rhHSP70D-OVA257-264交联蛋白可诱导小鼠产生具有明显抗原特异性的免疫保护作用，而rhHSP70D或OVA257-264单独免疫小鼠均不能产生这种保护作用。结论：rhHSP70D能通过促进DC成熟、刺激前炎性细胞因子的分泌增强DC的免疫激发功能，rhHSP70D-抗原肽复合物免疫能够诱导产生抗原特异性的免疫保护作用，提示rhHSP70D有望作为一种新的佐剂应用于抗肿瘤及抗感染免疫治疗。     

人热休克蛋白70D的基因克隆、表达及蛋白纯化

目的：研究热休克蛋白70D(heat shock protein 70D，HSP70D)的基因克隆、重组表达及纯化。方法：采用RT-PCR方法从HeLa细胞中克隆HSP70D全长编码区cDNA序列，构建原核表达载体pET24a（ ）-HSP70D，经过DNA序列测定证实共序列正确。完成基因工程人HSP70D的高表达工程菌的筛选后，对其发酵、蛋白表达条件及重组蛋白的纯化条件进行优化。结果：重组表达载体经序列测定及酶切鉴定与理论推测结果相符，高表达工程菌经优化表达条件后rhHSP70D的表达量可占菌体总蛋白的20％以上。经过低浓度乙醇沉淀、DEAE阴离子交换、疏水柱层及S200凝胶过滤柱后，获得了纯度大于95％的rhHSP70D。结论：本研究为进一步开展以HSP70D为基础的肿瘤免疫治疗研究提供了实验基础。     

大麻素2型受体拮抗剂对激活态BV2小胶质细胞的免疫调节作用

目的观察大麻素2型受体(cannabinoid 2 receptor, CB2R)拮抗剂对BV2小胶质细胞免疫调节功能的影响。方法 使用适量浓度的IFN-γ刺激激活BV2小胶质细胞,建立模拟EAE炎性环境的细胞模型,比较静息态BV2细胞组、激活态BV2细胞组和大麻素2型受体拮抗剂SR144528A(SR2)干预组CB2R mRNA和蛋白的表达情况,用ELISA方法检测细胞因子和趋化因子的浓度,MTT法检测细胞增殖率。结果 IFN-γ激活的BV2小胶质细胞CB2R mRNA和蛋白的表达均高于静息组(P<0.05);使用SR2干预激活的BV2小胶质细胞,可降低其CB2R mRNA和蛋白的表达(P<0.05);SR2可显著上调激活态BV2细胞致炎因子IFN-γ、IL-17、IL-6和TNF-α的水平,促进BV2小胶质细胞增殖和NO的释放(P<0.05),同时显著下调IL-4和MCP-1的浓度,对IL-1β、IL-10、CX3CL1无调节作用。结论CB2R参与了小胶质细胞介导的炎症反应,CB2R在调节Th1/Th17/Th2细胞因子网络平衡中发挥了一定的作用。     

炎调方对巨噬细胞中HSP70表达及其效应的影响

目的:观察炎调方药物血清对离体巨噬细胞中热休克蛋白70(HSP70)及其他相关细胞因子的调控效应,以验证炎调方治疗脓毒症的作用途径和位点。方法:培养大鼠巨噬细胞RAW 264.7,将培养后的巨噬细胞RAW 264.7分为空白对照组(RAW 264.7+培养液)、正常血清组(RAW 264.7+正常大鼠血清)、炎调方药物血清组(RAW 264.7+炎调方药物血清),每组设4个平行孔。采用MTT比色法测定细胞增殖,确定炎调方药物血清的无毒性剂量范围;采用qRT-PCR方法检测细胞HSP70、核因子-κB(NF-κB)、肿瘤坏死因子(TNF)-α、白介素(IL)-1β、IL-8的mRNA表达;采用Western blot方法检测细胞HSP70、NF-κB蛋白表达,以ELISA方法检测细胞TNF-α、IL-1β、IL-8蛋白表达。结果:炎调方药物血清的无毒性浓度范围包括10%~30%,故后续实验选取20%浓度的炎调方药物血清进行。正常血清组的各项指标与空白对照组比较,其差异均无统计学意义(P0.05);与空白对照组和正常血清组比较,炎调方药物血清组RAW 264.7细胞的HSP70 mRNA和蛋白表达均明显升高(P0.01),NF-κB、TNF-α、IL-1β、IL-8的mRNA和蛋白表达均明显降低(P0.01)。结论:炎调方治疗脓毒症的作用机制可能是上调HSP70的表达,进而抑制NF-κB的活化和相关细胞因子的表达。     

大麻素1型受体拮抗剂对激活态小胶质细胞的免疫调节功能研究

目的 观察大麻素1型受体拮抗剂SR141716A(SR1)对BV2小胶质细胞免疫调节功能的影响.方法 使用致炎因子干扰素-γ(IFN-γ)刺激激活BV2小胶质细胞,建立模拟EAE炎性环境的细胞模型,比较静息态BV2细胞组、激活态BV2细胞组和SR1干预组CB1R mRNA和蛋白的表达情况,用ELISA方法检测细胞因子和趋化因子的浓度,Griess试剂法检测一氧化氮(NO)浓度,MTT法检测细胞增殖率.结果 激活态的BV2小胶质细胞CB1R mRNA和蛋白的表达均高于静息态BV2细胞组(P＜0.05);大麻素1型受体拮抗剂SR1可降低激活态的BV2细胞CB1R mRNA和蛋白的表达(P ＜0.05);SR1可显著上调IFN-γ、白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的水平,增加BV2小胶质细胞NO的释放(P＜0.05),而显著下调IL-4、IL-17和MCP-1的浓度,对IL-10、IL-1β和CX3CL1无调节作用.SR1对IFN-γ活化的BV2小胶质细胞增殖无影响(P＞0.05).结论 CB1R参与了小胶质细胞介导的炎症反应,CB1R在调节细胞因子网络平衡和NO分泌中发挥了一定的作用.     

HSP70在香烟诱导人类气道上皮细胞黏液高分泌中的作用

目的 研究热休克蛋白70(HSP70)在香烟提取物(CSE)诱导人类支气管上皮细胞(16-HBE)黏液高分泌中的作用.方法 建立CSE刺激16-HBE诱导黏液蛋白基因(MUC5AC)高表达模型,给予HSP70单抗阻断HSP70生物活性;提取细胞mRNA、蛋白,采用RT-PCR及Western blot等方法检测炎性细胞因子(TNF-α)、HSP70及MUC5AC的表达.结果 CSE刺激后细胞MUC5AC、TNF-α、HSP70 mRNA和HSP70蛋白表达较空白组(未予CSE刺激)增高(P<0.05).HSP70生物作用阻断后,MUC5AC和TNF-α mRNA的表达水平降低(P<0.05),同时表皮生长因子受体(EGFR)磷酸化水平也降低(P<0.05).结论 CSE可诱导16-HBE细胞MUC5AC基因表达增高,是重要的气道黏液刺激因子.HSP70参与了气道黏液分泌,其机制可能是通过上调TNF-α表达量,从而激活EGFR通路导致MUC5AC表达增加.     

急性冠状动脉综合征患者血清热休克蛋白60和肿瘤坏死因子-α检测

目的:检测急性冠状动脉综合征(ACS)患者外周血热休克蛋白60(HSP60)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平,并探讨2者的相关性.方法:选择稳定型心绞痛(SAP)患者36例,ACS患者23例,以健康成人20例作为对照,采用ELISA方法检测血清HSP60和TNF-α水平.结果:ACS组血清HSP60水平高于正常对照组和SAP组(P均＜0.001),SAP组和对照组间差异无统计学意义(P＞0.05).TNF-α水平在各组之间差异均无统计学意义(P均＞0.05).血清HSP60与TNF-α水平无相关性(r=-0.146,P＞0.05).结论:ACS患者血清HSP60水平升高,可反映患者体内的免疫状态.     

HPV16E6/E7重组体DNA免疫对小鼠脾细胞分泌活性的影响

目的研究人乳头状瘤病毒16型(HPV16)E6/E7蛋白与结核杆菌热休克蛋白70(HSP70)表达重组体DNA免疫对小鼠活化脾细胞分泌活性的影响。方法采用肌肉注射DNA的方法免疫小鼠,分离脾细胞,用ELISA检测细胞因子的表达水平及抗体的水平,用RT-PCR的方法检测细胞中细胞因子mRNA的水平。结果以HPV16E6/E7为基础的DNA免疫小鼠后,检测到的细胞因子IL-2,IFNγ的含量明显升高;与结核杆菌HSP70重组后,IL-2,IFNγ的含量较重组前明显升高。与结核杆菌HSP70重组后,IL-10及抗体水平没有明显变化。结论以HPV16E6/E7为基础的DNA免疫能增强小鼠的细胞免疫反应。与结核杆菌HSP70重组后能提高细胞免疫的效果,但对体液免疫几乎没有影响。     

鼻咽癌患者治疗前外周血Th1细胞因子浓度与远期生存的关系

目的评价治疗前血清Th1细胞因子（IL-2、TNF-α和IFN-γ）浓度在鼻咽癌放化疗中对患者远期生存的影响。方法使用流式细胞小球微阵列术检测80例鼻咽癌患者治疗前血清Th1细胞因子水平,使用Kaplan- Meier法绘制生存曲线,使用COX回归法分析细胞因子水平与患者总生存（OS）之间的关系。结果非角化性鼻咽癌上IFN-γ水平较角化性癌升高（P=0.012）;Th1细胞因子水平与患者放化疗治疗效果差异无统计学意义（P＞0.05）,治疗前TNF-α高浓度组患者预后明显不如低浓度组（P=0.015）,治疗前IL-2高浓度组患者预后明显好于低浓度组（P=0.048）。结论鼻咽癌患者治疗前TNF-α及IL-2水平是预后的独立预测因素。     

不同类型过敏性紫癜患儿血细胞因子水平的变化及意义

目的 探讨不同类型过敏性紫癜(HSP)患儿血中IL-6、IL-8、IL-17、IL-23、TNF-α和IFN-γ的变化及意义.方法 收集HSP疾病组180例和正常儿童组30例的血标本,疾病组包括HSP患儿腹型初发组的急性期和恢复期各30例,非腹型初发组的急性期与恢复期各30例,腹型复发组急性期30例,非腹型复发组急性期30例.用酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定血标本中的IL-6、IL-8、IL-17、IL-23、TNF-α和IFN-γ的水平并进行比较和分析.结果 IL-6、IL-8、IL-17、IL-23、TNF-α疾病组水平均高于正常组,且各型急性期水平高于恢复期水平,复发组水平高于初发组(P<0.05),腹型与非腹型间比较(P>0.05);IFN-γ疾病组水平均低于正常组,且各型急性期水平低于恢复期水平,复发组水平低于初发组(P<0.05),腹型与非腹型间比较异无统计学意义(P>0.05).结论 过敏性紫癜患儿血中IL-6、IL-8、IL-17、IL-23、TNF-α和IFN-γ出现明显变化,提示这些因子与过敏性紫癜的发病和转归过程有关.     

Role of myeloid differentiation factor 88 in HSP60 signal transduction in dendritic cells

Objective: To explore the role and mechanism of myeloid differentiation factor88 (MyD88) in HSP60 signal transduction in dendritic cells. Methods:Mouse DCs were cultured from murine bone marrow cells. The DC marker CD11c was detected by flow cytometry, then DCs were divided into control group, HSP60 groupand RNA interference group. Control group was cultured under normal condition, and HSP60 group was cultured with 10 μg/ml of HSP60. RNA interference group was first cultured with MyD88 siRNA forl2 hours and then HSP60 was added into the culture mixture. All groups were cultured for 48 hours. Immunochemistry was used to detect the concentration of MyD88 and NF- κB. Western blot was used to detect the concentration of MyD88. Flow cytometry and mixed lymphocyte reaction (MLR) were used to detect the phenotype and functional properties of DCs. ELISA was used to detect the concentration of TNF-α, IFN-γ and IL-12 in the supernatant. Results:The expression of CD11c in marine bone marrow DCs was 88.76%. HSP60 stimulation increased the expression of CD80, CD86, MHC-Ⅱ in DCs and TNF-α, IFN-γ, IL-12 secretion in the supematant. HSP60 stimulation also increased the level of MyD88 in the cytoplasm and promoted the shift of NF-κB to karyon and the proliferation of allogeneic T cells. MyD88 siRNA could decreaseMyD88 and inhibit these effects induced by HSP60. Conclusion:HSP60 activates DCs through MyD88-dependent pathway. MyD88 plays a critical role in HSP60 signal transduction. Inhibition of MyD88 may be a novel way for treating disease correlated with HSP60.     

ITP合并HBV感染患者TNF-α、IL-8、IFN-α变化的意义

目的通过研究感染乙型肝炎病毒（HBV）的特发性血小板减少性紫癜（ITP漶者在抗HBV治疗前后血小板数量、乙型肝炎病毒、白介素～8（IL一8）、肿瘤坏死因子仪（TNF-α）、γ干扰素（IFN一γ）量的变化,探讨HBV感染在ITP致病机制中所起的作用。方法选取2009年1月～2010年12月在我院血液科住院的ITP患者80例,其中合并HBV感染的50例,随机分为A、B两组,每组25例,30例HBV阴性的ITP患者为C组。选取30名健康体检者为D组。B、C组患者给予常规ITP治疗,A组患者在常规ITP治疗的同时给予抗HBV治疗,D组不给予任何治疗。检测治疗前后患者血清中血小板总数、IL一8、TNF—α、IFN一7的变化。结果与C、D组比较,A组同一时间（30d、60d）TNF—α、IFN—γ水平明显升高（P〈0．05）;与B组比较,A组同一时间（30d、60d）TNF—α、IFN一γ水平明显降低（P〈0．05）,A组同一时间（30d、60d、90d）血小板计数明显增加（P〈0．05）。结论HBV感染可能是部分慢性ITP发病的病因,抗HBV治疗对于辅助治疗合并感染HBV的ITP效果较好,故抗病毒治疗可能成为非免疫抑制疗法治疗ITP的一种新选择。     

肺炎支原体肺炎患儿血清炎症细胞因子的检测及临床意义

目的探讨血清炎症细胞因子（IL-2、IL-6、IL-10、TNF-α）在肺炎支原体肺炎（MPP）发病中的作用及临床价值。方法采用酶联免疫吸附试验方法测定60例MPP患儿和60例健康儿童血清IL-2、IL-6、IL-10、TNF—α水平。结果急性期患儿血清IL-2的水平与恢复期、对照组比较显著降低,有显著性差异（P〈0．05）;急性期患儿血清IL-6、IL-10、TNF-α的水平与恢复期、对照组比较显著上升,有显著性差异（P〈0．05）;恢复期和对照组炎症细胞因子水平差异无统计学意义（P〉0．05）。结论IL-2、IL-6、IL-10、TNF—α参与了MPP发生和疾病进展,检测上述炎症细胞因子变化对判定病情和预后有-定的临床应用价值。     

IL-6I、L-8、TNF-α在过敏性紫癜患儿免疫机制中的表达

目的探讨IL-6、IL-8、TNF-α在过敏性紫癜（HSP）患儿免疫机制中的表达及临床意义。方法 58例HSP患儿根据有无肾脏受累分为普通型HSP组32例、HSPN组26例。随机选择同期我院门诊体检的健康儿童20例作为正常对照组,采用双抗体夹心ELISA法测定血清IL-6、IL-8及TNF-α,并对不同类型、不同时期以及治疗前后IL-6、IL-8、TNF-α的变化水平进行对比分析。结果 HSPN组IL-6、IL-8、TNF-α均明显高于普通型HSP组、对照组。急性期HSP患儿血清IL-6、IL-8、TNF-α均明显高于缓解期及正常对照组。治疗后10 d HSP患儿IL-6、IL-8、TNF-α的表达水平明显低于治疗前,但明显高于正常对照组,治疗后3个月,HSP患儿IL-6、IL-8、TNF-α的表达水平较治疗前及治疗10 d后明显降低,虽高于正常对照组,但差异无统计学意义。HSP患儿血清TNF-α与IL-6水平呈正相关（r=0.524,P〈0.01）,血清TNF-α水平与IL-8呈正相关（r=0.673,P〈0.01）。结论通过检测过敏性紫癜患儿血清不同类型、不同时期以及治疗前后IL-6、IL-8、TNF-α的变化水平,为临床判断病情、估计预后及免疫治疗提供进一步的理论指导。     

TNF-α和IFN-γ与T-SPOT.TB相结合应用于鉴别结核现症感染与隐性感染

目的 评价细胞因子IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α和IFN-γ在结核患者,隐性感染者及健康者中的水平.以期找到能够区分结核现症感染,隐性感染的细胞因子指标,为临床诊断结核提供新的依据.方法采用流式微球阵列法(CBA)检测60例T细胞斑点试验阳性的肺结核患者,55例T细胞斑点试验阳性的隐性感染者,30例T细胞斑点试验阴性的健康者的6种细胞因子(IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α和IFN-γ)的水平.结果 结核病(菌阳)组的IL-2、IL-6、TNF-α、IFN-γ水平均升高.血清IL-10水平各组间差异有统计学意义(P<0.05),且结核杆菌活动性及病情严重程度逐渐增加.结核患者的TNF-α、IFN-γ较正常人、结核杆菌隐性感染者升高.血清IL-4水平无差异(P>0.05).结论 与T-SPOT.TB法结合,TNF-α、IFN-γ可在细胞因子水平区分结核现症感染与隐性感染,对辅助鉴别诊断结核现症感染和隐性感染有重要的意义.     

甲亢患者手术前后血清TNF-α和IL-6水平变化的临床观察

目的观察甲亢患者手术治疗前后血清TNF-α和IL-6含量的变化。方法用放射免疫法检测40例甲亢患者手术治疗前后血清TNF-α和IL-6的含量,并与40名正常人对比。结果手术治疗前甲亢患者血清TNF-α和IL-6的含量分别为(324.1±89.4)ng/mL和(201.3±64.0)pg/mL,均显著高于正常人组(216.4±81.5)ng/mL和(142.5±50.1)pg/mL,差异有统计学意义(均P<0.01)。手术治疗3个月后TNF-α和IL-6的含量分别为(224.8±84.7)ng/mL和(149.4±51.6)pg/mL,明显低于手术前(均P<0.05),但与正常人组比较无显著性差异(均P>0.05)。结论甲亢未治患者的TNF-α和IL-6较正常人高,手术可降低TNF-α和IL-6的水平。检测甲亢患者手术治疗前后TNF-α和IL-6含量的变化,对了解患者的病情和预后均具有重要的临床价值。     

过度惊恐型肾虚质大鼠血清细胞因子水平变化的实验研究

目的研究肾虚质大鼠血清IL-10I、L-6I、L-2、TNF-αI、FN-γ变化情况,探讨肾虚体质免疫稳态失衡的内在机理。方法采用惊恐方法,建立过度惊恐致肾虚质的动物模型,研究肾虚质大鼠血清IL-10I、L-6、IL-2、TNF-αI、FN-γ及补肾药的干预作用。结果模型组IL-10I、L-2I、FN-γ的含量低于空白组;IL-6、TNF-α含量高于空白组,其中IL-10I、FN-γ的降低有统计学意义(P<0.05)。用补肾中药干预后其血清其IL-10I、L-2I、FN-γ的含量有所升高I,L-6,TNF-α含量降低,其中IL-10的降低有统计学意义(P<0.05)。结论建立过度惊恐致肾虚质的动物模型,具有中医理论特色和操作的可行性。肾虚质大鼠免疫稳态失衡状态可能与细胞因子IL-10I、L-2I、FN-γI、L-6、TNF-α等的异常有关,而补肾中药可以在一定程度上改善肾虚质大鼠机体免疫功能的降低及紊乱。     

雾化吸入γ-干扰素对免疫低下大鼠某些细胞因子的影响

目的 研究雾化吸入γ-干扰素（IFN-γ）对免疫低下大鼠细胞因子的影响。方法 醋酸考的松皮下注射并气管内注射白色念珠菌复制大鼠免疫低下肺感染模型,检测雾化吸入IFN-γ1、3、7d的免疫低下大鼠和对照组大鼠肺泡巨噬细胞（AM）培养上清中TNF- α活性和IL-1β、IL-6水平,支气管肺泡灌洗液（BALF）IFN-γ、TNF-α活性,肺组织IFN-γ、TNF-α活性,肺组织IFN-γ、TNF-α、TNF-1β、IL-6表达,以及血清IFN-γ活性和IL-1β、IL-6水平,结果 吸入IFN-γ组大鼠AM培养上清中TNF-α的活性和IL-1β、IL-6水平显著高于对照组大鼠。吸入IFN-γ组大鼠BALF中IFN-γ、TNF-α活性高于对照组大鼠（第7天TNF-α除外）,吸入IFN-γ组大鼠血清IFN-γ活性和IL-1β的表达高于对照组,TNF-α表达低于对照组,IL-6表达二组无显著差异,吸入IFN-γ组大鼠血清IFN-γ活性和IL-1β、IL-6水平,除第3天IL-1β外,与免疫低下大鼠组相比差异不显著,结论 雾化吸入IFN-γ可明显提高肺内IFN-γ、TFN-α、IL-1β、IL-6水平,但对相应血清细胞因子无明显影响。