自噬对粒细胞样髓源性抑制细胞生存与功能的影响

目的: 初步探索自噬对Lewis肺癌移植瘤小鼠脾脏中粒细胞样髓源性抑制细胞（granulocytic myeloid derived suppressor cells,G-MDSCs）体外存活能力与抑制性功能分子的影响。方法: Lewis肺癌细胞系体外培养后,构建小鼠Lewis肺癌皮下移植瘤模型,通过免疫磁珠分选方法获得脾脏G-MDSCs,与荧光抗体（Ly-6C-FITC/Ly-6G-PE/CD11b-PE/CY5）孵育后,流式细胞术检测G-MDSCs细胞纯度;瑞吉染色后观察其形态特征;采用雷帕霉素和氯喹处理后,通过蛋白质印迹法和流式细胞术检测自噬标志性分子微管相关蛋白1-轻链3 Ⅱ（microtubule-associated protein 1 light chain 3 Ⅱ,LC3-Ⅱ）蛋白的表达水平。培养体系中加入雷帕霉素和自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-methy-ladenine,3-MA）,7-AAD染色检测自噬对G-MDSCs生存的影响;提取细胞总蛋白后检测胞内精氨酸酶的水平。结果： 通过磁珠分选的方法可从小鼠脾脏中获得纯度较高的G-MDSCs,其细胞核呈环状或分叶状。雷帕霉素处理G-MDSCs后LC3-Ⅱ表达水平上调,3-MA抑制自噬作用后,G-MDSCs存活率降低, 精氨酸酶活性下降。结论： 自噬能够促进G-MDSCs体外存活并上调抑制性效应分子精氨酸酶的表达,提示自噬是调控G-MDSCs生物学功能的重要因素。     

Compound K 对小鼠CT26结肠肿瘤模型中髓系抑制细胞的抑制作用

目的探讨人参皂苷Compound K（C-K）对髓系抑制性细胞（myeloid derived suppressor cell, MDSC）凋亡、免疫抑制及促
炎症细胞因子分泌的影响。方法流式细胞术分选得到CT26 肿瘤小鼠骨髓MDSCs,分别用C-K或PBS处理后,Annexin V/
7-AAD检测细胞凋亡;qRT-PCR检测Cox-2 和Arg-1 的mRNA表达水平;ELISA技术检测细胞培养上清中IL-1β、IL-6和IL-17
的水平。体内实验中,C-K 或对照PBS处理的MDSCs和结肠癌细胞系CT26共同皮下免疫Balb/c小鼠,21 d后,对两组小鼠肿
瘤的大小以及组织形态学进行鉴定。结果C-K促进了体外培养的MDSC的凋亡,表现为早期细胞凋亡率及晚期凋亡细胞或
坏死率均增加（P<0.01,P<0.05）;并显著下调了MDSC中免疫抑制作用相关基因Cox-2及Arg-1的表达（P<0.05,P<0.01）;同时
抑制了MDSC中促炎症细胞因子IL-1β、IL-6和IL-17的分泌（P<0.05,P<0.001,P<0.05）。与对照组比较,C-K 处理后的MDSCs
在体内促进肿瘤细胞的增殖作用明显减弱（P<0.01）。结论C-K 能促进体外培养的MDSC细胞凋亡并拮抗其免疫抑制功能,
从而抑制肿瘤细胞的生长与增殖。
     

荷瘤小鼠MDSCs中TRIM25和PTEN的表达

目的: 探讨荷瘤小鼠肿瘤组织来源的髓源抑制性细胞（myeloid derived suppressor cells, MDSCs）中三基序蛋白25（tripartite motif containing 25, TRIM25）和人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因（phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome ten, PTEN）的表达水平及其意义。方法: 构建小鼠CT26结肠癌移植瘤模型,采用实时荧光定量PCR（real time fluorescene quantitative PCR, qRT PCR）技术检测荷瘤小鼠肿瘤组织来源MDSCs和野生型小鼠脾脏来源MDSCs中TRIM25、PTEN的表达情况。结果： 在小鼠CT26结肠癌移植瘤模型中,与野生型小鼠脾脏来源的MDSCs相比,荷瘤小鼠肿瘤组织来源MDSCs中TRIM25表达水平明显升高（P<0.001）,PTEN表达水平显著下降（P<0.001）。结论： 荷瘤小鼠肿瘤组织来源MDSCs中TRIM25的表达升高,PTEN表达下降,提示两者或许参与调控MDSCs。     

人纤溶酶原K5体内抑制Lewis肺癌肿瘤生长与转移

【目的】通过体内实验探讨人纤溶酶原Kringle 5（K5）对小鼠Lewis肺癌移植瘤生长与转移的抑制作用。【方法】采用腋下接种肿瘤细胞的方法建立Lewis肺癌细胞皮下种植瘤小鼠模型,分为PBS对照组和K5治疗组,观察各组肿瘤生长情况,测量肿瘤大小,制备小鼠体质量-时间曲线和肿瘤体积-时间曲线;采用皮下种植瘤剔除术建立Lewis肺癌自发性肺转移模型,术后分为PBS对照组和K5治疗组,观察各组小鼠肺组织转移瘤数量,取肺组织进行病理学分析。【结果】在皮下种植瘤模型中,与对照组相比,K5治疗组小鼠肿瘤体积-时间曲线变化平缓,肿块增长缓慢,肿瘤质量明显降低[分别为（4.57&#177;0.79）g和（1.15&#177;0.31）g,P=0.006];在Lewis肺癌转移瘤模型中,K5治疗组小鼠肺表面转移瘤结节数[分别为（15.75&#177;9.79）个和（6.60&#177;3.39）个,P=0.029]以及肺湿质量明显少于对照组,高倍镜下治疗组肺微转移灶数目亦较少。【结论】人纤溶酶原K5能显著抑制小鼠Lewis肺癌移植瘤的生长,并能明显抑制Lewis肺癌细胞转移。     

小鼠肺部肿瘤集聚髓源性抑制细胞实验研究

目的观察髓源性抑制细胞（MDSCs）在荷瘤小鼠肺部组织的表达情况。方法取12只C57BL/6小鼠随机分为实验组和对照组,每组6只。实验组：将体外培养的3LL细胞（0.3×106个）注射入小鼠尾静脉,成瘤后3周取小鼠肺组织,酶消化肺组织,制备肺组织单细胞悬液,采用流式细胞术检测MDSCs（GR1-FITC、CD11b-PE双染阳性）的表达量。对照组：在小鼠尾静脉注射PBS,其余步骤同实验组。结果实验组小鼠肺部组织高表达免疫抑制细胞MDSCs（GR＋CD11b＋双阳性）,表达量为（19.92±6.08）%;对照组MDSCs表达量为（7.06±2.67）%,两组比较差异有统计学意义（P〈0.001）。结论肺癌小鼠的肺组织高表达免疫抑制细胞MDSCs。     

白藜芦醇通过诱导G MDSCs凋亡和M MDSCs分化延缓Lewis荷瘤小鼠肿瘤生长

目的: 探讨白藜芦醇对髓源抑制性细胞(myeloid derived suppressor cells, MDSCs)的影响及其抗肿瘤免疫的作用。方法: 建立小鼠Lewis肺癌移植瘤模型,用白藜芦醇(白藜芦醇组,n=6)和PBS(对照组,n=6)分别灌胃处理,测量肿瘤体积和重量;用流式细胞术检测小鼠体内各群MDSCs细胞比率;用免疫磁珠分选技术分离出荷瘤小鼠脾脏粒系MDSCs(G MDSCs)及单核系MDSCs(M MDSCs),经白藜芦醇分别刺激12 h后,流式细胞术检测G MDSCs凋亡及M MDSCs分化情况。结果： 与对照组比较,白藜芦醇组荷瘤小鼠肿瘤体积显著减小(P<0.05),肿瘤重量减轻(P<0.01),脾脏中总MDSCs、M MDSCs比率无明显变化,G MDSCs比率下调;肿瘤组织中总MDSCs和G MDSCs比率均显著减少（P均<0.05）,M MDSCs比率无显著差异。白藜芦醇分别处理G MDSCs、M MDSCs后,早期和晚期凋亡的G MDSCs总数明显高于对照组,M MDSCs表面CD11c和F4/80的表达显著上调。 结论： 白藜芦醇可通过促进G MDSCs凋亡和M MDSCs分化抑制肿瘤生长。     

小鼠肺肾两虚型肺癌模型的建立

目的建立小鼠肺肾两虚型肺癌模型。方法24只C57BL／6雄性小鼠随机分为正常组、Lewis肺癌细胞皮下移植瘤模型组（简称模型组）和肺’肾两虚型Lewis肺癌细胞移植瘤组（简称复合模型组）,每组8只。将40只同品系小鼠随机分为Lewis肺癌细胞皮下移植瘤模型组（简称模型组）、肺肾两虚型Lewis肺癌细胞移植瘤组（简称复合模型组）,每组20只,以观察生存期。采用烟熏刺激法连续14d建立肺气虚模型,采用皮下注射氢化可的松25mg／kg,1次／日,连续给药14d建立肾虚模型,将Lewis肺癌细胞（2×106个）注射于小鼠右腋部皮下,建立Lewis肺癌细胞移植瘤模型。观察小鼠的一般状况、饲料消耗量、体质量、生存时间、去瘤体重与移植瘤重量、脾脏指数、胸腺指数、肺脏组织病理学改变,并检测各组小鼠胸腺、脾脏和移植瘤CD4＋CD25~Treg细胞的含量、Foxp3 mRNA的表达水平等评价肺’肾两虚型肺癌模型的情况。结果与模型组比较,复合模型组小鼠出现活动减少、睡眠时间缩短、蜷曲、毛发脱落、摄食减少、体质量下降、呼吸浅快、小便量多等肺肾两虚证的表现;其中位数生存时间（19d）显著缩短,生存期范围离散程度较模型组小（P〈0．01）;脾脏指数显著降低（P〈0．01）;小鼠胸腺和脾脏CD4＋CD25＋Treg细胞的含量明显增多,Foxp3 mRNA的表达水平上调（P〈0．01）。结论建立了小鼠Lewis肺肾两虚型肺癌动物模型,为研究中医药抗肺癌提供科学的实验工具。     

STAT4基因缺失增强髓系抑制性细胞动员促进小鼠炎症相关肠癌的发生

目的探索信号转导与转录因子4（STAT4）对髓系抑制性细胞（MDSCs）动员和分化的调控及其在结肠癌发生发展中的作用。方法应用信号转导与转录激活因子4基因敲除（STAT4-/-）小鼠建立炎症相关肠癌模型,STAT4-/-小鼠通过腹腔注射氧化偶氮甲烷（AOM）和饮用含DSS水诱发急性肠炎,建立炎症相关结肠肿瘤模型并鉴定;应用流式细胞技术分析STAT4基因缺失对免疫细胞亚群分化和动员的影响。结果 STAT4-/-小鼠表现为明显的结肠肿瘤病变,而野生型（WT）对照组在结肠的中下段和肛门处只有炎性病变和上皮组织增生;CD11b＋Gr-1＋MDSCs在STAT4-/-小鼠的外周血、脾脏和骨髓内的百分率较WT对照组小鼠显著增加（P〈0.05）。结论 STAT4缺失能促进小鼠结肠肿瘤的发生,其机制可能与STAT4信号通路抑制导致CD11b＋Gr-1＋MDSCs的异常分化和动员有关。     

辣椒素抑制Lewis 肺癌小鼠血管生成的实验研究

目的 观察辣椒素对Lewis 肺癌小鼠血管生成的影响,并探讨其可能的机制。方法 复制Lewis肺癌小鼠模型,随机分为模型组,辣椒素低、中、高剂量组,以及阳性对照组5 组,每组9 只。各组连续用药20 d,于末次给药后处死全部小鼠,比较各组小鼠瘤体积、瘤重、抑瘤率及微血管密度（MVD）。采用免疫组织化学法检测CD34 阳性细胞率;采用Western blot 和实时荧光定量聚合酶链反应检测缺氧诱导因子1α（HIF-1α）、血管内皮生长因子（VEGF）蛋白和mRNA 表达的变化。结果 与模型组比较,辣椒素抑制Lewis 肺癌小鼠瘤体积、瘤重、MVD 和CD34 阳性细胞率（P <0.05）;与模型组比较,辣椒素抑制Lewis 肺癌小鼠HIF-1α、VEGF 蛋白和mRNA 的表达（P <0.05）。结论 辣椒素抑制Lewis 肺癌小鼠肿瘤生长和血管生成,其机制可能与抑制HIF-1α 和VEGF 的表达有关。     

细胞因子信号转导抑制分子3与肿瘤关系的研究进展

细胞因子与相应的受体结合可导致信号传导通路的活化,而将细胞因子的信号由胞膜传到胞浆并最终传至胞核,并引起目的基因的表达.已经发现的10余条细胞因子信号传导通路[1-3],其中Janus激酶/信号转导和转录激活子(JAK/STAT)系统涉及细胞因子的范围较为广泛.过去研究细胞因子信号的传人较多,较少观察这些信号是如何中止或衰减.细胞因子信号转导抑制分子(suppressor of cytokine signaling,SOCS)系统由3个实验室用不同方法同时发现[4-6],正好解释了JAK/STAT信号系统的负调节机制.现已明确,JAK/STAT信号转导通路的激活与多种恶性肿瘤的发生、发展密切相关,SOCS分子主要通过对该通路的负性调节而抑制信号转导,其激活及表达具有潜在抑瘤作用.     

类风湿关节炎患者外周血中糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体相关基因及其配体的表达和意义

目的:研究糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体家族相关基因(GITR)与其配体(GITRL)在类风湿关节炎(RA)患者外周血中的表达及其与临床指标的相关性,探讨GITR/GITRL 在RA中的意义.方法:采用实时荧光定量PCR法检测RA组(n=53)、骨关节炎(OA)组(n=35)及正常对照组(n=35)外周血GITR/GITRL mRNA含量,同时利用流式细胞仪检测上述三组患者的GITR在CD4+CD25+ T细胞的表达,并研究GITR mRNA与RA患者DAS28评分、抗环瓜氨酸(CCP)抗体、C反应蛋白(CRP)、红细胞沉降率(ESR)及类风湿因子(RF)的关系.结果:RA患者外周血GITR mRNA水平和GITRL mRNA水平(分别为12.38±5.72,16.41±10.16)明显高于正常对照组(分别为8.75±3.78,11.99±8.42)及OA组(分别为9.59±5.87,12.09±7.53;均P＜0.05).RA患者与OA组及正常对照组比较,外周血CD4+CD25+GITR+T细胞的比例也明显增高[分别为(28.12±16.85)%,(21.01±14.42)%,(19.98±9.40)%,均P＜0.05].RA患者GITR mRNA表达水平与DAS28评分及ESR呈明显正相关(r值分别为0.361和0.427,P＜0.01).结论:RA患者GITR/GITRL表达增多,与RA发病及疾病活动度有关.     

慢性鼻窦炎伴鼻息肉患者外周血中髓源性抑制细胞的变化及临床意义

目的: 研究慢性鼻窦炎伴鼻息肉（chronic sinusitis with nasal polyps,CRSwNP）患者外周血中髓源性抑制细胞（myeloid-derived suppressor cells,MDSCs）及其亚群比例和功能的变化,探讨MDSCs对CRSwNP疾病进展的影响。方法: 采用流式细胞术检测CRSwNP组（31例）及对照组（36例）外周血中HLA-DR^-CD11b⁺CD33⁺MDSCs,HLA-DR^-CD11b⁺CD33⁺CD14^-CD15⁺粒细胞性MDSCs（PMN-MDSCs）和HLA-DR^-CD11b⁺CD33⁺CD14⁺CD15^-单核细胞性MDSCs（M-MDSCs）的比例和功能分子精氨酸酶-1（arginase-1,ARG-1）的表达情况,同时采用ELISA检测血浆中IL-6的浓度。结果: CRSwNP患者外周血总MDSCs比例明显高于对照组,差异有统计学意义（P<0.01）;与对照组比较,CRSwNP组PMN-MDSCs比例明显升高（P<0.05）,而M-MDSCs比例下降（P<0.05）。CRSwNP组总MDSCs中ARG-1的平均荧光强度升高（P<0.05）,血浆IL-6浓度增加（P<0.05）。结论: CRSwNP患者中总MDSCs的表达升高且以PMN-MDSCs为主,其功能分子ARG-1表达增强,提示MDSCs可能参与了慢性鼻窦炎的发病过程。     

玄胡索散通过下调粒细胞集落刺激因子抑制脾脏髓源抑制细胞分化发挥抗乳腺癌作用

目的:探讨玄胡索散抑制乳腺癌小鼠脾脏髓源抑制细胞(MDSC)分化的作用机制。方法:4～5周龄BALB/c雌性小鼠48只,其中6只为正常对照组,其他42只采用小鼠左侧第二对乳腺皮下脂肪垫接种4T1细胞构建乳腺癌荷瘤小鼠模型,分为粒细胞集落刺激因子(G-CSF)对照组、G-CSF敲减组、模型对照组、玄胡索散小剂量组、玄胡索散中剂量组、玄胡索散大剂量组和环磷酰胺组,每组6只。其中G-CSF对照组和G-CSF敲减组分别采用shRNA慢病毒转染联合嘌呤霉素构建相应4T1稳转细胞模型。各组造模48 h后,玄胡索散小剂量组、玄胡索散中剂量组、玄胡索散大剂量组分别按2、4、8 g·kg^-1·d^-1玄胡索散灌胃,每天一次;环磷酰胺组按30 mg/kg腹腔注射环磷酰胺,隔天一次;其他组给予等体积0.5%羟甲基纤维素纳。各组连续给药25 d。苏木精-伊红染色观察脾脏组织病理学改变,流式细胞术测定脾脏MDSC亚群比例,免疫荧光法检测脾脏CD11b、Ly6G共表达,酶联免疫吸附测定外周血G-CSF浓度。在体外,建立荷瘤小鼠脾脏与4T1稳转株共培养体系,玄胡索散(30μ...     

丹参-人参配伍调控MDSCs重塑黑色素瘤免疫微环境的研究

  目的  研究丹参-人参配伍对鼠源黑色素瘤细胞株B16F10体内外免疫微环境的影响及其干预B16F10血行转移的作用机制。  方法  体外构建T淋巴细胞-B16F10共培养体系, 流式细胞术检测丹参-人参配伍体外能否增强T淋巴细胞对B16F10的杀伤能力; 构建B16F10小鼠尾静脉血行转移模型, 利用动物活体成像技术、HE染色法观察丹参-人参体内对B16F10肺转移的作用。利用流式细胞术、免疫组化及免疫荧光技术检测荷瘤小鼠体内CD4+、CD8+T细胞、骨髓源性抑制细胞(MDSCs)等免疫细胞数量, 利用qPCR技术检测MDSCs增殖的相关mRNA表达水平。  结果  丹参-人参配伍体外可增强T淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤能力, 在体可有效抑制小鼠B16F10肺转移, 增强CD4+、CD8+T细胞浸润, 通过抑制MDSCs增殖的相关mRNA表达水平, 进而抑制转移灶MDSCs的表达。  结论  丹参-人参配伍可通过调控MDSCs重塑黑色素瘤免疫微环境, 达到抑制肿瘤转移的目的。研究为丹参-人参配伍的临床抗肿瘤转移应用奠定基础。      

血管内皮抑素协同肿瘤特异性DC-T细胞的抗肿瘤效应

目的 探讨血管内皮抑素联合肿瘤特异性DC-T细胞对Lewis肺癌小鼠的抗肿瘤效应。方法 建立Lewis肺癌C57BL/6鼠移植瘤模型, 培养小鼠来源肿瘤特异性DC-T细胞, 随机分为A组(PBS对照组)、B组(DC-T组)及C组(DC-T+血管内皮抑素组)。测量小鼠的体质量及肿瘤组织质量和体积, Western blotting检测各组肿瘤组织内血管内皮生长因子(VEGF)和乏氧诱导因子-1α(HIF-1α)蛋白的表达, 流式细胞术检测肿瘤组织细胞悬液内髓源抑制性细胞(MDSC)、肿瘤相关巨噬细胞(TAM, M1/M2)、成熟的树突状细胞(mDC)和CD8⁺T细胞的比例。结果 与A组比较,B组(P<0.05)、C组(P<0.01)肿瘤生长明显受到抑制;相较于A组, B组VEGF表达下降, 且HIF-1α表达增加(P<0.05), C组VEGF表达明显下降, 且HIF-1α表达明显增加(P<0.01);与A组比较, B组(P<0.05)、C组(P<0.01)的MDSC和M2型TAM比例下降, M1型TAM升高, 肿瘤组织内mDC和CD8⁺T细胞比例增加。结论 血管内皮抑素联合肿瘤特异性DC-T细胞治疗明显减缓肿瘤生长, 有效逆转了肿瘤微环境的免疫抑制, 从而发挥了协同抗肿瘤效应。