大鼠细小病毒H-1株和KRV株双重PCR检测方法的建立及应用

目的 建立大鼠细小病毒H-1和KRV株双重PCR方法并对方法进行初步应用。 方法 根据NCBI发表的H-1(NC_001358)和KRV(U790330)基因组序列分别设计特异引物, 以H-1和KRV 病毒DNA为模板建立双重PCR方法, 对方法进行优化后验证方法的敏感性和特异性;经口感染大鼠, 分为H-1和KRV单独感染组和混合感染组, 感染后第2, 4, 6, 8, 10天采集大鼠粪便, 第10天处死所有大鼠, 采集心、肝、脾、肺、肾和盲肠内容物等组织, 用建立的方法对粪便和组织样本进行检测。结果 建立的双重PCR方法以H-1和KRV为模板能够分别扩增出183 bp和302 bp 2个条带, 敏感性验证显示能够检测到的最低H-1量为3.8 pg/mL, 最低KRV量为0.73 pg/mL;在以小鼠微小病毒、犬细小病毒和猫细小病毒为模板时无任何条带扩增出, 特异性良好。感染第2天在所有大鼠粪便中均检测到病毒核酸, 感染大鼠均无明显临床症状, 感染第10天采集组织, H-1在各组织的检出率分别是心50%(4/8), 肝50%(4/8), 脾62.5%(5/8), 肺50%(4/8), 肾37.5%(3/8), 盲肠内容物62.5%(5/8), 且单独感染组检出率高于混合感染组;KRV在各组织的检出率分别是心0(0/8), 肝25%(2/8), 脾87.5%(7/8), 肺12.5%(1/8), 肾25%(2/8), 盲肠内容物62.5%(5/8), 混合感染组检出率高于单独感染组。结论 建立的H-1和KRV双重PCR方法能够高效的检测大鼠粪便及组织中的病毒感染, 可作为实验动物国家标准的有力补充。     

H-1细小病毒抗体ELISA检测方法的建立与应用

目的建立H-1细小病毒抗体的ELISA检测方法,并进行初步应用。方法采用大鼠神经胶质瘤细胞C6培养大鼠H-1细小病毒,制备包被抗原,采用纯化后抗原建立该病毒的ELISA检测方法;将建立的方法与国外同类试剂盒进行比对,考察该方法的特异性和灵敏度。同时,应用该方法对35份大鼠血清进行检测。结果所建立的方法可检测出稀释1280倍的阳性血清;与犬细小病毒、小鼠微小病毒和猪细小病毒阳性血清均无交叉反应;与大鼠细小KRV病毒有交叉反应;对35份大鼠血清进行检测,结果均为阴性,与国外同类试剂盒结果一致。结论所建立的H-1细小病毒ELISA检测方法具有良好的种属特异性和灵敏度,可用于大鼠血清中H-1细小病毒抗体检测。     

双重实时荧光PCR在手足口病快速检测中的应用

目的 探讨双重实时荧光PCR 技术检测手足口病肠道病毒的应用效果.方法 用单一实时荧光PCR先检测标本中的肠道病毒通用病毒核酸,肠道病毒通用病毒核酸阳性再分别用双重实时荧光PCR及单一实时荧光PCR检测CoxA16型和EV71型特异性核酸,比较两种方法检测结果.结果 240份标本中肠道病毒通用型核酸阳性157份,双重实时荧光PCR法CoxA16阳性111份,EV71阳性1份,其他肠道病毒45份,单一实时荧光PCR法CoxA16阳性109份,EV71阳性1份,CoxA16+EV71阳性2份,其他肠道病毒45份.EV71和其他肠道病毒符合率为100%.结论 双重实时荧光PCR 检测技术可以准确检测手足口病肠道病毒,且特异性强、灵敏度高,又可以快速得到检测结果,是一种快速检测手足口病病毒的方法.     

多重PCR技术检测病毒性肝炎相关病毒的研究

目的建立一种快速、特异的可同时检测血中多种病毒性肝炎相关病毒的多重PCR方法。方法参照各病毒特异性核酸序列,按多重PCR引物设计的特殊要求设计引物,以核酸测序确证扩增产物,用标准病毒株及临床阳性血清样本DNA、RNA为模板优化PCR反应体系和反应条件,建立病毒性肝炎相关病毒多重PCR检测方法。应用建立的多重检测方法对120例ALT升高的血清标本进行多重检测,并将检测结果与单一PCR检测结果进行比较。结果采用多重PCR技术可同时对EBV、TTV、HBV、HSV 4种DNA病毒进行扩增;采用多重RT-PCR技术可同时对Cox-V、HEV、HCV 3种RNA病毒进行扩增。各病原体单一及多重扩增条带均清晰、均一,无非特异性扩增条带,片段长度与理论值一致;核酸测序证实各扩增产物属各病原体特异性基因片段。临床标本检测多重感染率为19.2%,与单一检测结果一致。结论建立的多重PCR检测方法稳定可靠,敏感度、特异度好,适用于病毒性肝炎相关病毒的实验室诊断与临床筛查。     

HIV-1前病毒基因扩增诊断早期HIV感染的研究

目的 建立HIV前病毒核酸的检测方法，并探讨其早期诊断断HIV-1感染的效果。方法从HIV1 2蛋白印迹法确定HIV抗体阳性、并经病毒载量检测阳性的HIV感染者血浆中提取基因组DNA，应用合成HIV-1基因组gag区九条引物随机组合RT-PCR扩增HIVgag区核酸片断，筛选扩增灵敏度最高的三个扩增片断。其引物组合扩增样本核酸PCR产物经凝胶电泳观察判断结果。结果该方法的敏感性为94．17％，特异性为100％，三个片断扩增灵敏度分别为76．67％、87．5％、69．17％。结论PCR扩增HIV前病毒保守区多个基因片断，具有较高的灵敏度和特异度，方法简单，可以应用到HIV感染的早期诊断中。     

登革热病毒多重荧光PCR检测及基因分型方法的研究

目的 建立一种登革热病毒双靶基因多重荧光PCR检测方法,用于登革热病毒的实验室诊断和基因分型.方法 选取登革热病毒Ⅰ-Ⅳ型病毒保守区设计型特异性引物探针和通用型引物探针,评估多重荧光PCR检测方法的特异性、重复性和检测限;并对20份阳性样本进行检测.结果 20个登革热阳性核酸标本在通用型检测全部为阳性,特异性型别检测发现登革热病毒Ⅰ型10例、登革热病毒Ⅱ型3例、登革热病毒Ⅲ型3例、登革热病毒Ⅳ型4例;20名正常无症状人群标本提取的核酸和HIV、HCV和HEV通用型和特异性型别检测全部为阴性.梯度检测的变异系数均小于5％.对登革热Ⅰ-Ⅳ型病毒检测最低检测限达103 copies/ml.结论 本研究建立的登革热病毒双靶基因多重荧光PCR检测及分型方法具有特异性好、重复性好、快速易操作等优点,可用于登革热病毒的快速检测和基因分型鉴定.     

小鼠多瘤病毒荧光PCR检测方法的建立及其在裸鼹鼠感染情况调查中的应用

目的建立多瘤病毒荧光定量PCR检测方法,并对裸鼹鼠中多瘤病毒感染情况进行调查。方法比较NCBI中小鼠多瘤病毒(Genbank:NC_001515)的核酸序列,选择保守区域设计引物和探针,建立多瘤病毒的荧光定量PCR方法,对方法的敏感性和特异性进行验证。人工感染9只1日龄KM乳鼠,21 d后采集心、肝、脾、肺、肾、脑、胸腺、盲肠内容物和血液等组织脏器,用建立的荧光PCR方法进行检测,验证方法在应用中的有效性,最后用该方法检测62份裸鼹鼠的盲肠内容物样本。结果建立的检测方法特异性好,在以多瘤病毒为模板时出现明显的荧光信号,以猴空泡病毒、小鼠K病毒、小鼠微小病毒和大鼠细小病毒H-1株为模板时无荧光信号出现;方法的最低检出限为100 copies/μL;人工感染小鼠的心、肝、脾、肺、肾和盲肠内容物中均检测到多瘤病毒核酸,其中肺组织中含量最高,脑、胸腺和血液中未检出;62份裸鼹鼠的盲肠内容物样本经检测多瘤病毒为阴性。结论建立的多瘤病毒荧光定量PCR方法可有效检测动物组织中的多瘤病毒,对裸鼹鼠自然感染多瘤病毒的调查为实验用裸鼹鼠微生物标准的制定提供了参考。     

实验动物疾病Ⅲ.啮齿类动物的主要中枢神经系统疾病

一、大鼠潜在病毒(KRV)与托兰氏H-1病毒病 1.病史:Kilham等于1959年从野生大鼠肝脏囊尾蚴吸虫的包囊分离出一株病毒——Kilham ratvirus,这种病毒可能与绦虫幼虫协同而在大鼠体内引起肿瘤。托兰于1960年用大鼠进行人类肿瘤细胞的传代过程中分离了托兰氏H-1病毒。 2.病原:大鼠潜在病毒属于细小病毒科的细小病毒属。H-1病毒和细小病毒有亲缘关系,皆为单股DNA病毒。其大小为18～30 nm,能凝集豚鼠的红细胞。这两株病毒对温度有显著的抵抗力,能耐受80℃达2小时,在40℃可耐受60天以上。也可耐受pH2～11,以及氯仿、乙醚和酒精。 3.生态学:KRV和H-1病毒通常可对实验和野     

猫疱疹病毒Ⅰ型PCR检测方法的建立及初步应用

目的建立猫疱疹病毒Ⅰ型（FHV-1）PCR检测方法,应用于临床样品中FHV-1的快速检测。方法根据已发表的FHV-1TK基因序列设计合成引物,并以此建立FHV-1的PCR检测方法,并对方法的特异性、敏感性、稳定性等进行验证。用建立的方法对15份猫临床样品进行检测。结果建立的FHV-1PCR检测方法与单纯疱疹病毒Ⅰ型（HSV-1）、犬疱疹病毒（CHV）、猪伪狂犬病毒（PRV）、猫细小病毒（FPV）均无交叉反应;可检测病毒最小滴度为7lg TCID50/ml,相应的DNA模板浓度为1.46×102拷贝/ml;FHV-1DNA在-30℃冰箱放置12个月仍可检测出目的条带。应用该方法从15份猫临床样本中检测出10份FHV-1核酸阳性。结论建立的FHV-1PCR检测方法具有特异、敏感及稳定的特点,适合于临床FHV-1的感染检测。     

树鼩巴尔通体PCR方法的建立及初步应用

目的建立有效的树鼩巴尔通体PCR检测方法,并进行初步应用。方法针对NCBI公布的巴尔通体序列设计3对引物,通过对我国主要流行菌株的扩增实验来确定1对引物,并进行体系优化、特异性和敏感性测试;运用该PCR方法对60份树鼩样品进行检测,阳性样本进行序列测定。结果所建树鼩巴尔通体PCR检测方法特异性良好,灵敏度较高(2.0×10-5μg/mL),60份树鼩样本中有15份阳性样本,通过序列测定证实树鼩巴尔通体感染率为25%,与扩增结果完全相符,验证了该方法的可行性。结论该方法的建立为树鼩巴尔通体的检测奠定了基础。     

猴副流感病毒SV5的PCR检测方法建立及初步应用

[目的]建立检测SV5的PCR方法并加以初步应用。[方法]根据Genbank中报道的SV5序列,针对其中的SH基因设计引物进行PCR反应,扩增产物进行测序并用BLAST软件进行同源性比对,同时利用限制性内切酶的酶切反应以证实此PCR反应的特异性。在此基础上设计巢式PCR提高此方法的灵敏度。利用此方法对20份猴肾源细胞培养物和40份血清标本进行检测。[结果]利用设计的引物扩增出的序列测序结果证实与报道的SV5SH基因相对位置的序列一致。AccIII限制性内切酶可对PCR产物进行特异性酶切。巢式PCR比一次PCR的敏感度有所提高。用此方法检测的20份猴肾源细胞培养物和40份血清标本结果为阴性。[结论]本文首次初步建立了检测SV5病毒的PCR方法,排除实验室用20份猴肾源细胞培养物和40份血清标本SV5的污染。     

聚合酶链反应快速检测加德纳菌的方法和应用

目的 建立聚合酶链反应快速检测加德纳菌方法,用于细菌性阴道病的诊断和治疗。方法 根据加德纳菌基因序列中IIS-23srRNA基因区设计并合成特异性引物,应用聚合酶链反应扩增阴道或宫颈分泌物中的加德纳菌,并与革兰染色和分离培养进行对照检测。结果 经对阴道加德纳菌和5种常见的阴道感染病原体检测,证实所用引物具有较高的特异性;敏感性实验结果10^2可扩增出明显的区带;在50例宫颈分泌物标本中,革兰染色阳性检出率为18%（9/50）、分离培养阳性检出率为16%（8/50）,聚合酶链反应阳性率为28%（14/50）。结论 采用聚合酶链反应检测阴道分泌物中的加德钠菌,用于细菌性阴道病的快速诊断,有可能成为细菌性阴道病实验室诊断的主要检测方法。     

细小病毒B19诊断芯片探针的制备

目的 制备细小病毒B19诊断芯片探针。方法 利用Primer Premier5．0软件针对细小病毒B19基因保守区域设计PCR引物，纯化扩增产物，克隆鉴定。结果 序列分析表明，扩增片段均为细小病毒B19特异基因。结论 利用PCR扩增产物可制备细小病毒B19诊断芯片探针。     

非人灵长类结核病的诊断方法及进展

目前非人灵长类结核病的诊断方法单一,给饲养和管理带来影响。通过总结和讨论人的结核病诊断技术,结合非人灵长类的实际情况,指出在结核病检疫中,虽然结核菌素是经典的早期诊断的方法,但血清抗体的检测是结核菌素试验的有效辅助手段,尤其对无反应猴群的结核病检测具有独特的优势。然而,IFNγ的检测有望替代结核菌素试验,实现体外检测结核病。传统的结核菌培养技术时间长,假阴性多,污染率高,给猴的结核病的确诊带来困难。原位PCR技术,能加快诊断速度,提高检出率,特别有利于对小病灶区的病源诊断。虽然目前该技术还不能替代细菌学诊断技术,但两种方法的有效结合将有利于提高非人灵长类的结核病的病源诊断。     

多重聚合酶链反应检测结核菌耐异烟肼相关基因

目的：建立耐异烟肼(isoniazid,INH)结核分枝杆菌(M.tuberclasis,MTB)多重聚合酶链反应(multiple PCR,multi-PCR)检测系统，在一次扩增中快速，特异地同时检出aphC启动子，inhA和kagG基因，用于快速初步诊断结核分枝杆菌对INH的耐药性．方法：根据结核分枝杆菌的aphC启动子，inhA和kagG序列，分别设计出3对特异性寡聚核苷酸引物，采用multi—PCR技术，同时检出对结核分枝杆菌耐INH起作用的3个基因．结果：应用multi—PCR反应体系，对引物的相关性实验结果表明引物之间不会因相互干扰而出现假阳性结果；multi—PCR扩增的预期结果为：单基因引物出现一条特异性扩增区带，多重基因引物出现2或3条特异性扩增区带，经实验达到预期的扩增结果；对H37Rv标准株、INH敏感株及INH耐药株分别采用常规PCR和multi—PCR进行同时扩增，结果两种扩增方法均能扩增出预期的目的片段，符合率达100％．结论：multi—PCR能有效地为多基因耐药的临床病原体的诊断提供快速、准确的诊断手段，更能提高检验效率。     

应用RT-PCR技术检测啮齿类动物冠状病毒

为了检测啮齿类动物冠状病毒，设计了特异性引物，建立RT—PCR检测方法，并用于检测。在基因文库中查找了啮齿类动物冠状病毒和SARS病毒的基因序列，从N基因片段中，利用计算机软件设计了一对特异性引物，通过确定反应混合物的浓度和反应条件，并建立了一整套从病毒。RNA抽提、反转录到PCR反应的快速检测啮齿类动物冠状病毒的方法，扩增出了148bp的目的片段。并已用于啮齿类动物中检测各组织和拭子中的冠状病毒。该方法对啮齿类动物冠状病毒的早期诊断和与SARS病毒区别有重要意义。     

A study on detecting and identifying enteric pathogens with PCR

Objective To develop a rapid and definite diagnostic test of bacterial enteritis caused by pathogenic enterobacteria, the most frequent etiologic agent of infectious enteritis in the world.Methods A set of conventional PCR assays were applied to detect and identify salmonella, shigella,and E. coli O157:H7 directly from pure culture and fecal samples.The general primers of pathogenic enterobacteria were located on the uidA gene, which were found not only in E. coli nuclear acid, but also in Shigella and salmonella genes.Shigella primer was from ipaH gene whose coded invasive plasmid relative antigen existed both in plasmid and in genome.The primers of salmonella were designed from the 16SrRNA sequence.The primer of E.coli O157:H7 was taken from eaeA gene.Five random primers were selected for RAPD. The detection system included common PCR,semi-nested PCR and RAPD. Results This method was more sensitive, specific and efficient and its processing was rapid and simple. For example, the method could be used to specifically detect and identify salmonella, shigella, and E. coli O157:H7,and its sensitivity ranged from 3 to 50CFU, and its detection time was 4 hours. Conclusion This PCR method, therefore, can serve as a routine and practical protocol for detecting and identifying pathogenic microorganisms from clinical samples.     

细小病毒B19的芯片检测方法构建

 目的   运用基因芯片技术构建快速简便检测B19 细小病毒的方法,用于B19 病毒的大规模筛查和早期诊断。方法  利用Oligo6.0和primer5.0 软件分别设计出5 对引物（其中每对引物中的1 个用Cy5 标记）和6 个探针,将探针固定在特制的醛基检测芯片上。分别提取B19 病毒全基因组质粒、患者组血清、正常组血清的DNA,进行不对称扩增,产物与芯片杂交,观察结果;DNA测序验证芯片检测结果的准确性;观察等倍稀释不对称PCR 扩增产物杂交信号的强度变化,检测芯片的灵敏度。结果  电泳结果表明PCR扩增获得的DNA片段和预期表达片段大小一致。芯片杂交结果和DNA测序验证结果完全吻合,芯片杂交信号的强弱会随着DNA浓度的降低而减弱。结论  本研究建立了细小病毒B19的芯片检测方法,该方法并具有较高的灵敏度和特异性。