肿瘤转移抑制因子CD63/ME491基因在小鼠子宫内膜表达的动态观察

目的 了解小鼠动情周期和早孕子宫中CD63/ME491 mRNA和蛋白的表达规律,探讨CD63/ME491在胚胎着床过程中的作用.方法 应用RT-PCR和免疫组化技术分别观察CD63/ME491 mRNA和蛋白的表达.结果 在整个动情周期中,CD63/ME491 mRNA在动情间期表达最多,而在动情期表达最少,但蛋白质却是在动情前期和间期表达最丰富,子宫内膜上皮和基质细胞均呈阳性.早孕的小鼠子宫组织均有CD63/ME491 mRNA表达,且在胚胎开始植入的第4天表达最多,以后维持在较高的表达水平.CD63/ME491蛋白在妊娠第1～6天子宫内膜腔上皮细胞和腺上皮细胞呈阳性表达.但在基质细胞表达的量和范围却不同:妊娠第1天,无CD63/ME491蛋白的表达;妊娠第2天,子宫内膜基质细胞出现微弱阳性表达;以后CD63/ME491蛋白在基质细胞的表达量和表达范围逐渐增强.结论 在胚胎着床过程中,CD63/ME491 在小鼠子宫中呈动态表达,提示它可能参与了子宫内膜对滋养层细胞有限侵袭的调控.     

瘦素在着床前小鼠胚胎中的表达及其对胚胎发育的影响

目的 探讨瘦素(leptin)在围着床期小鼠胚胎中的表达规律和分布情况以及leptin抗体对小鼠胚胎体外发育的影响.方法 雌性NIH小鼠超排后与雄鼠交配,分别在妊~4 d上午从输卵管或子宫角冲取相应时期的胚胎,用于以下实验:①分别提取总RNA,检测胚胎中leptin mRNA表达情况.②采用免疫荧光技术,观察leptin蛋白在囊胚的表达和分布情况.③将8-细胞小鼠胚胎培养于含不同浓度leptin抗体的培养液中,观察囊胚形成及脱透明带的情况.结果 leptin mRNA仅在囊胚期特异性表达,其余各时期胚胎未见表达;leptin蛋白在囊胚的滋养层细胞和内细胞团的细胞质和细胞膜呈阳性表达,而在细胞核无表达.一定浓度的leptin抗体可明显降低囊胚的形成率(1∶400, P<0.05) 和脱带率(1∶1 600, P<0.05),且随着抗体浓度的增加,这种抑制作用更明显.结论 leptin能促进着床前胚胎发育,同时也可能参与了胚胎着床过程.     

甲氧滴滴涕对小鼠着床期子宫钙结合蛋白D9k基因表达的影响

目的：研究甲氧滴滴涕（MXC）对小鼠着床期子宫钙结合蛋白D9k（Calbindin-D9k）基因表达的影响。方法：将真孕及假孕小鼠于孕1-3d（发现阴栓为孕0日）每日给予不同剂量的MXC（0,100,250,500mg／kg）灌胃,对照组（MXC 0mg／kg）只给芝麻油溶剂。采用RT-PCR检测各组孕鼠子宫Calbindin-D9k基因mRNA的表达;免疫组化染色和图像分析技术检测Calbindin-D9k蛋白表达。结果：①孕鼠经MXC染毒3d后,250,500mg／kg MXC组孕鼠子宫Calbindin-D9k mRNA的表达量与对照组相比有显著降低（P〈0.05）,然而,100mg／kg MXC组Calbindin-D9k mRNA的表达与对照组相比虽有所减低,但无统计学意义（P〉0.05）;②Calbindin-D9k蛋白在孕5日主要表达在子宫内膜上皮细胞和腺上皮细胞。与mRNA的表达水平一致,250,500mg／kgMXC组孕鼠子宫Calbindin-D9k蛋白的表达量与对照组相比显著降低（P〈0.05）,而100mg／kg MXC组Calbindin-D9k蛋白的表达与对照组相比无明显差异（P〉0.05）。结论：MXC可以降低小鼠着床期子宫Calbindin-D9k基因的表达,这可能是其干扰胚胎着床的一个毒性机制。     

Dicer基因在早孕小鼠子宫内膜中的表达

目的：检测Dicer基因在早孕小鼠子宫内膜组织中的表达规律,为阐明其在胚胎着床中的作用打下基础。方法：利用实时荧光定量PCR、免疫组化和Western blot分别检测未孕、假孕及孕d1~d7小鼠子宫内膜中Dicer基因mRNA和蛋白质的表达。结果：在小鼠着床窗期及着床后（d4～d7）,小鼠子宫内膜中Dicer基因mRNA和蛋白质表达均明显升高,d5达到高峰（PmRNA=0.000,P蛋白= 0.000）;且Dicer表达主要定位于子宫内膜基质细胞。结论：Dicer基因在早孕小鼠子宫内膜组织中的表达存在时间与空间差异,这种规律性表达所调控的细胞生长、增殖和分化可能是胚胎正常着床的分子机制之一。     

TACE在着床窗口期小鼠子宫内膜上皮细胞中的表达及其抗体对胚泡粘附的影响

目的:通过检测肿瘤坏死因子α转换酶(Tumor necrosis factor α convening enzyme,TACE)在小鼠子宫内膜上皮细胞中的表达及其在体外着床模型中对胚泡粘附的影响,初步探讨TACE在小鼠生殖中的作用以及其与胚胎着床的关系.方法:体外培养孕4d(d4)小鼠子宫内膜上皮细胞和胚泡,构建胚泡体外着床模型;通过细胞免疫组化鉴定小鼠子宫内膜上皮细胞;运用RT-PCR和细胞免疫组化分别检测小鼠子宫内膜上皮细胞中TACE mRNA和蛋白的表达;向体外着床模型中添加不同浓度的TACE抗体,观察对胚泡体外着床的影响,并用细胞免疫化学检测抗体干预后各培养体系中TACE蛋白质的表达情况.结果:原代培养小鼠子宫内膜上皮细胞生长旺盛,鉴定结果显示:上皮细胞对角蛋白抗体有棕黄色阳性表达,对波形蛋白抗体为阴性表达.PCR结果显示TACE mRNA在共培养体系中有高表达,免疫组化结果与RT-PCR结果相一致;小鼠胚泡体外共培养具有较高的粘附率,添加TACE抗体后胚泡帖附率均显著低于对照组帖附率(P<0.05),且随着抗体浓度的降低胚泡粘附率随之升高,免疫化学检测结果也显示随着抗体浓度的降低TACE的表达量随之升高.结论:TACE可能参与了胚泡着床过程,有利于小鼠胚胎粘附、扩展,为胚胎的着床做准备.     

组蛋白甲基化酶MLL1在小鼠围着床期子宫内膜的表达

目的:探讨组蛋白甲基化酶MLL1在小鼠围着床期子宫内膜的表达规律及对胚胎着床的作用。方法:收集妊娠小鼠(D0、D1、D4、D5、D6、D8)子宫内膜,分别采用RT-PCR和Western Blot检测小鼠内膜MLL1 mRNA和蛋白的表达情况,利用免疫组化检测MLL1蛋白的定位;宫角注射MLL1抑制剂进行干预。结果:①MLL1、HOXA10 mRNA的表达量在妊娠后随天数逐渐上升,且在D4达到高峰(P<0. 05),而后逐渐下降;②免疫印迹发现MLL1蛋白,与mRNA表达趋势相同,在小鼠妊娠后上调,D4表达最强(P<0. 05),而后下降;免疫组化发现在D0和D1、D4,MLL1蛋白主要表达于子宫内膜腔上皮和腺上皮;妊娠D5,MLL1主要表达于子宫基质细胞中,妊娠D6、D8主要表达于蜕膜化细胞中;③宫角注射MLL1抑制剂后,与空白组相比,抑制组胚胎着床数量明显减少,并且MLL1 mRNA和蛋白的表达水平低于溶剂组和空白对照组。结论:组蛋白甲基化酶MLL1可能参与了子宫内膜容受性的建立和胚胎植入的过程;还可能参与了胚胎植入后的子宫内膜蜕膜化反应。     

整合素αvβ3拮抗剂SB-273005抗小鼠胚胎着床的作用

【目的】探讨整合素αvβ3拮抗剂SB-273005对小鼠胚胎着床的影响。【方法】雌雄小鼠2：1合笼,次晨检查阴栓,阳性者定为妊娠第1天．记为D1。步骤①取D3小鼠40只,随机分为2组,每组20只,实验组连续2d上午灌胃给SB-273005,于D4下午观察囊胚发育情况。②取D3小鼠80只．随机分为4组．每组20只,A、B、C组为实验组,连续3d分别灌胃给SB-2730050．3、1、3mg&#183;kg^-1&#183;d^-1,于D8观察胚胎着床数及统计妊娠率。③取D4小鼠40只,随机分为两组,每组20只,实验组双侧宫角注射SB-273005,于D8观察胚胎着床数及统计妊娠率。④各对照组用与其相应实验组同方法给同体积二甲亚枫（DMSO）。取上述D8处死各组小鼠子宫,观察内膜组织学及D4处死小鼠内膜免疫组化变化。【结果】步骤①中实验组与对照组囊胚发育率分别为64．7％和84．5％（P〈0．01）。步骤②中A、B、C、D组妊娠率分别55％、40％、35％、88％（P〈0．05）。步骤③中实验组妊娠率为15％,对照组妊娠率为70％,两者相比差异有显著性（P〈0．01）。说明SB-273005能降低囊胚发育率、小鼠胚胎着床数及妊娠率。组织学及免疫组化结果表明．SB-273005能引起蜕膜细胞退化解体,抑制整合素αvβ3在蜕膜组织中的表达。【结论】整合素αvβ3拮抗剂SB-273005对小鼠胚胎着床有抑制作用。     

肿瘤转移抑制因子CD82/KAI1在延迟着床小鼠子宫内膜组织的表达

目的:研究肿瘤转移抑制因子CD82/KAI1在延迟着床小鼠子宫中的表达规律。方法:RT-PCR及免疫组化法检测CD82/KAI1蛋白质及mRNA在延迟着床小鼠子宫的表达。结果:延迟着床小鼠子宫CD82/KAI1蛋白含量在延迟着床第5天较少,第6~8天无表达,E2激活后则明显增多。CD82/KAI1 mRNA表达从妊娠第4~8天呈下降趋势,雌二醇(E2)激活后mRNA表达显著上升(P<0.05)。结论:CD82/KAI1参与了小鼠胚胎着床过程,其表达可能受雌激素调节。     

整合素avβ3拮抗剂SB-273005抗小鼠胚胎着床的作用

[目的]探讨整合素avβ3拮抗剂SB-273005对小鼠胚胎着床的影响.[方法]雌雄小鼠2：1合笼,次晨检查阴栓,阳性者定为妊娠第1天,记为D1.步骤[1]取D3小鼠40只,随机分为2组,每组20只,实验组连续2 d上午灌胃给SB-273005,于D4下午观察囊胚发育情况.②取D3小鼠80只,随机分为4组,每组20只,A、B、C组为实验组,连续3 d分别灌胃给SB-273005 0．3、1、3 mg·kg-1·d-1,于D8观察胚胎着床数及统计妊娠率.③取D4小鼠40只,随机分为两组,每组20只,实验组双侧宫角注射SB-273005,于D8观察胚胎着床数及统计妊娠率.[4]各对照组用与其相应实验组同方法给同体积二甲亚枫(DMSO).取上述D8处死各组小鼠子宫,观察内膜组织学及D4处死小鼠内膜免疫组化变化.[结果]步骤[1]中实验组与对照组囊胚发育率分别为64．7%和84．5%(P＜0．01).步骤[2]中A、B、C、D组妊娠率分别55%、40%、35%、88%(P＜0．05).步骤[3]中实验组妊娠率为15%．对照组妊娠率为70%,两者相比差异有显著性(P＜0．01).说明SB-273005能降低囊胚发育率、小鼠胚胎着床数及妊娠率.组织学及免疫组化结果表明,SB-273005能引起蜕膜细胞退化解体,抑制整合素avβ3在蜕膜组织中的表达.[结论]整合素avβ3拮抗剂SB-273005对小鼠胚胎着床有抑制作用.     

在小鼠着床前胚胎中c-myc的表达

目的: 观察小鼠着床前胚胎细胞中c-myc基因的表达, 了解其对早期胚胎发育可能影响的作用. 方法: 采用原位杂交及免疫组织化学ABC法,分别检测小鼠着床前胚胎细胞中c-myc mRNA及c-myc蛋白. 结果: 在小鼠2细胞、4细胞、6细胞、8细胞和囊胚期胚细胞中均检测到原癌基因c-myc转录产物的表达,c-myc mRNA分布于胚细胞的胞质和胞核. 免疫组织化学方法也发现,2细胞至囊胚期胚胎细胞的 c-myc蛋白均呈免疫反应阳性, 阳性物质分布于胞质和胞核中, 胚胎透明带则呈阴性反应. 结论: 小鼠早期胚胎有c-myc基因表达,c-myc基因对小鼠着床前胚胎发育可能起重要调节作用.     

p38丝裂原活化蛋白激酶在小鼠早期胚胎及围植入期子宫内膜的表达

目的检测p38MAPK在小鼠不同发育阶段胚胎和围植入期子宫内膜的表达。方法取小鼠早期胚胎、动情期未孕、真孕及假孕1～8d小鼠子宫，利用免疫组织化学染色及图像分析法，检测p38MAPK在不同发育阶段早胚及围植入期子宫内膜中的表达和变化规律。结果① p38MAPK在小鼠胚植入前各细胞期均呈阳性表达,随着妊娠进展,其表达逐渐加强;② 真孕组孕3d,小鼠子宫内膜腔上皮p38MAPK呈阳性表达,孕4d呈强阳性表达，此后腔上皮表达逐渐减弱；腺上皮p38MAPK的表达一直维持在阳性水平，而蜕膜细胞的表达从孕5d开始逐渐增强。假孕组只有孕4?d呈弱阳性表达。结论① p38MAPK可能参与了小鼠植入前胚的发育分化。② p38MAPK参与胚泡植入过程，并可能参与子宫内膜的蜕膜化反应。③ p38MAPK 在子宫内膜中的表达不仅受母体因素调控，还与胚泡的刺激有关。     

p38丝裂原活化蛋白激酶特异性抑制剂对小鼠早胚发育及植入的影响

目的观察p38丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）特异性抑制剂SB203580对小鼠早胚发育及植入的影响。方法①采用体外胚胎培养技术,将孕2?d小鼠早胚随机分组,接种到添加不同浓度抑制剂的培养液内进行培养,以观察p38MAPK特异性抑制剂对早胚发育的影响;②体内宫腔注射：取孕4?d小鼠,由子宫角注射不同浓度的SB203580,于孕8?d检查胚胎植入数,同时取子宫,观察内膜的组织学变化。结果①添加抑制剂组的早胚不能发育为胚泡,停滞在8～16细胞阶段。但去除抑制剂后继续培养,幼胚仍能发育到胚泡阶段;②注射SB203580组的小鼠,胚胎植入数明显少于对照组（P＜0.01）。镜下可见,其胚胎组织呈退化坏死状态,胚胎周围蜕膜细胞呈明显的空泡样变性,蜕膜及胚胎中均见大量血细胞浸润。结论①p38MAPK在小鼠植入前胚胎发育过程中起作用;②p38MAPK特异性抑制剂SB203580可抑制在体小鼠胚泡植入及植入后胚胎和蜕膜细胞的发育。     

缺血性脑卒中患者阿司匹林抵抗与血小板膜糖蛋白CD62pCD63及GPⅡb Ⅲa的相关性研究

目的:探讨缺血性脑卒中患者体内血小板膜糖蛋白CD62p、CD63及GPⅡb/Ⅲa的变化与阿司匹林抵抗的关系.方法:随机选取2009年1月至2010年12月期间我院缺血性脑卒中患者60例以及同期体检健康人30例,采用FCM测定人群体内CD62p、CD63及GPⅡb/Ⅲa表达的阳性率,60例缺血性脑卒中患者接受阿司匹林(1...     

不同时期胚胎线粒体拷贝数与胚胎自身形态学分型的关系研究

目的:探讨人类不同形态学分型的卵裂期胚胎和囊胚与自身线粒体拷贝数的关系。方法:选择在生殖中心因女性双侧输卵管梗阻行体外受精-胚胎移植（IVF-ET）助孕顺利娩出健康胎儿后,自愿丢弃冷冻的卵裂期胚胎和囊胚用于科学研究。将冷冻的胚胎解冻复苏后,依据胚胎发育的时期,将所有胚胎分为卵裂期胚胎冷冻组（D3冷冻胚胎组,n=63）和囊胚冷冻组（D5冷冻胚胎,n=82）,再根据冷冻胚胎的形态学评分标准,将冷冻卵裂期胚胎分为优质胚胎组（n=38）和较差胚胎组（n=25）,将冷冻囊胚分为优质囊胚组（n=52）和较差囊胚组（n=30）。采用实时PCR检测胚胎线粒体拷贝数,比较不同阶段胚胎和相同阶段不同质量的胚胎与自身线粒体拷贝数的差异。结果:D3冷冻胚胎组线粒体拷贝数明显低于D5冷冻胚胎组（t=9.34,P<0.02）,D3冷冻胚组中优质胚胎mtDNA拷贝数高于质量较差胚胎组（t=6.62,P<0.01）,D5冷冻胚组中优质胚胎mt DNA拷贝数明显高于质量较差胚胎组（t=8.03,P<0.04）。结论:不同时期胚胎mt DNA拷贝数对胚胎的发育潜能有重要影响,mtDNA拷贝数越高,胚胎质量越好。     

sp3111RNAi转基因小鼠模型的评价以及sp3111下调表达对受精及早胚发育的影响

目的 评价sp3111 RNAi转基因小鼠模型的应用价值以及探讨SP3111蛋白降低表达对受精及早期胚胎发育的影响.方法 ①采用Real-Time PCR方法分别检测F1代和F4代转基因RNAi小鼠中sp3111 mRNA的表达变化,并比较2代间干扰效率的差异.②将精子分为实验组（F4代小鼠精子组）和对照组（野生小鼠精子组）,进行体外授精实验,观察受精率及碎裂胚胎的发生率.结果 ①F1代和F4代小鼠中干扰效率的差异无统计学意义（P〉0.05）.②实验组的正常胚胎与碎裂胚胎的形成率分别为34.48%和46.21%,与对照组相比均有显著差异（P〈0.05）.结论 ①RNAi转基因小鼠中RNAi诱导的转录沉默可稳定遗传至F4代.②SP3111下调表达对小鼠受精及早期胚胎发育有明显的影响.     

小鼠体外受精、胚胎培养及胚胎快速冷冻的研究

目的　为扩大胚胎来源并获取特定胚龄胚胎 ,建立小鼠冷冻胚胎库。方法　运用超数排卵、体外受精与胚胎培养及胚胎冷冻技术系统研究了小鼠受精卵的体内发育与运行规律。卵母细胞的体外成熟与受精、单细胞胚胎培养及胚胎快速冷冻。结果　 (1)注射hCG后 12～ 2 0h受精卵发育至原核期 ,4 2～ 4 8h为 2 细胞期 ,4 8～ 6 0h为 4 细胞期 ,6 0～ 6 8h为 8 细胞期 ,以上各期受精卵均处于输卵管中 ;75～ 78h为桑椹胚 ,78～ 80h为致密桑椹胚 ,90～ 92h为早期囊胚 ,92～ 96h为囊胚 ,以上各期均处于子宫角中。 (2 )培养液中添加促性腺激素 (FSH与hCG) ,能显著提高卵母细胞的体外受精率 ,添加FCS和激素组的体外受精率又显著高于单独添加激素组 ,FCS还能显著提高胚胎发育。 (3)在培养液中添加EDTA ,能有效克服小鼠胚胎的 2 细胞阻断 ,其 2 细胞胚的发育率达 10 0 % ,8 细胞胚发育率达 5 5 %以上 ;牛、羊上皮细胞培养液上清也能有效克服 2 细胞阻断。添加乳酸钠和丙酮酸钠可使 2细胞与 8细胞期胚的发育率显著提高。 (4)以D PBS +甘油 +蔗糖为冷冻液 ,以D PBS +蔗糖为稀释液 ,对小鼠胚胎进行快速冷冻 ,桑椹胚的存活率为 6 9 3% ,早期囊胚的存活率为 6 0 4 %。结论　研究为将生物技术应用于小鼠 ,扩大卵子和胚胎来源     

胚胎因素对冷冻胚胎移植周期结局的影响

目的:探讨影响冷冻胚胎复苏率和移植成功率的胚胎因素。方法:回顾性分析149个冷冻胚胎移植(frozen-thawed embryo transfer,FET)周期的临床资料,按胚胎发育时间、冷冻前胚胎质量、复苏后胚胎损伤情况分别进行分组,比较不同分类各组间的胚胎复苏情况和(或)临床妊娠率的差异。结果:受精第二天冷冻组与第三天冷冻组的胚胎复苏存活率和临床妊娠率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。冷冻胚胎中有优质胚胎者的种植率和临床妊娠率均显著高于无优质胚胎者(P<0.05)。全部移植完整存活胚胎和混合移植组的临床妊娠率和种植率均显著高于全部移植受损胚胎者(P<0.05)。结论:冷冻前胚胎质量和复苏后胚胎卵裂球损伤程度是影响临床妊娠率的重要因素。     

应用组织芯片技术检测结直肠癌组织中KAI1/CD82和ME491/CD63的表达

目的 研究结直肠癌组织中KAI1/CD82和ME491/CD63的表达水平及其临床病理意义.方法 应用组织芯片和免疫组织化学技术检测232例结直肠癌组织中KAI1/CD82和ME491/CD63的表达,并运用统计学方法分析KAI1/CD82和ME491/CD63的表达与结直肠癌各种临床病理特征的关系及两者的相关性.结果 KAI1/CD82在结直肠癌组织中的表达与肿瘤的分化程度和Dukes分期有关(P＜0.05),与患者的性别、年龄、浸润深度、淋巴结转移无关(P＞0.05).未发现ME491/CD63表达与结直肠癌病理资料之间差异有统计学意义(P＞0.05).KAI1/CD82和ME491/CD63的表达差异有统计学意义(P＜0.05).结论 KAI1/CD82在结直肠癌组织中的表达与肿瘤临床病理特征密切相关,可作为结直肠癌的预后因子.KAI1/CD82和ME491/CD63的表达相关.     

舒降之与赖诺普利对冠心病相关因子HCY的影响

目的：观察冠心病（coronary heart disease,CHD）患者血浆同型半胱氨酸（homocysteine,HCY）水平在舒降之与赖诺普利作用下的变化情况。方法：①选择我科门诊及住院稳定型心绞痛患者385例,抽取空腹静脉血检测HCY。②血浆HCY〉15μmol/L的140例患者随机分为4组：A组常规组：阿司匹林＋硝酸酯类药;B组舒降之组：舒降之（10 mg,1次/d）＋常规治疗。C组赖诺普利组：赖诺普利（5 mg,1次/d）＋常规治疗。D组联合组：舒降之（10 mg,1次/d）＋赖诺普利（5 mg,1次/d）＋常规治疗。治疗4周后再次检测HCY。结果：①385例老年稳定型心绞痛患者中血浆HCY〉15μmol/L者165例,约占42.86%。②A组治疗前后差异无统计学意义（P〉0.05）。B、C、D组治疗后血浆HCY水平显著降低,差异有统计学意义（P〈0.01）。③B组与C组比较差异无统计学意义（P=0.994）。④D组与B、C组比较差异有统计学意义（D组与B组比较,P=0.043;D组与C组比较,P=0.042）。结论：①冠心病患者血浆HCY水平升高;②舒降之与赖诺普利均可降低老年稳定型心绞痛患者血浆HCY水平,且二者具有协同作用。