如何快速鉴定临床标本中的粪肠球菌和屎肠球菌

目的建立荧光原位杂交法,快速鉴定临床标本中的粪肠球菌和屎肠球菌。方法将荧光同位素标记的粪肠球菌或屎肠球菌的核糖体16SrRNA及23SrRNA序列互补的寡核苷酸探针,在同一张玻片上杂交30min～1h,用杂交缓冲液洗涤10min,干燥后置显微镜下观察。结果探针的特异性金标准菌株证实,对163例临床标本测试结果与培养法结果比较,2种探针的特异性和敏感性均为100%。结论荧光原位杂交法适宜于临床标本中粪肠球菌和屎肠球菌的快速鉴定。     

原位杂交技术的应用及操作体会

原位杂交技术的原理是依据核酸碱基互补配对原则,利用标记的特定序列探针与待测样本中的原位检测目的基因互补核酸序列杂交,经信号放大显色后镜下观察结果.该方法具有2 个特点:①基因水平的检测,即直接检测DNA 或RNA ;②可以明确定位,在保存组织结构同时揭示组织细胞的异质性,细胞基因表达的异质性和细胞器中的区别定位[1].现根据我科目前开展的DNA 原位杂交人乳头状病毒(HPV)的检测,在日常操作中的方法及体会介绍如下.     

荧光原位杂交法在检测硫酸盐还原菌中的应用

目的 探讨荧光原位杂交法在检测淡水湖泊沉积物硫酸盐还原菌检测中的应用.方法 建立荧光原位杂交方法 并应用该法进行洱海沉积物硫酸盐还原菌含量分析,所用寡核酸苷酸探针为依据硫酸盐还原菌16SrRNA特异性区域而设计的SRB385.结果 荧光显微镜下标本中可见发特异性红色荧光的硫酸盐还原菌菌体.经荧光原为杂交分析,洱海沉积物前18cm硫酸盐还原菌含量为(0.08-8.50)×103个/g,平均为(1.91±2.51)×103个/g.硫酸盐还原菌含量在空间分布上表现为悬浮层、5和8cm深度有较小谷值,3、6和11cm深度有较高的峰值,其中11cm深度形成的峰较宽.结论 荧光原位杂交法具有快速准确、检测信号强、杂交特异性高的特点,可以进行淡水湖泊沉积物硫酸盐还原菌含量的检测.洱海沉积物硫酸盐还原茵含量丰富且不同深度的沉积物中硫酸盐还原菌含量分布是不均一的.     

荧光原位杂交技术在快速诊断胎儿染色体数目异常中的应用

目的 探讨荧光原位杂交（FISH）技术在快速产前诊断胎儿染色体数目异常中的价值.方法 采用13、18、21、X和Y染色体特异性DNA探针,对123例高危孕妇的羊水间期细胞进行FISH检测,同时行常规染色体核型分析平行诊断,以此监测对比荧光原位杂交结果的准确性.结果 所测123份标本的13、18、21、X、Y染色体数目均与常规染色体核型分析的结果相符,其中,检测结果显示染色体数目正常的为120例,染色体数目异常的为3例,分别为21-三体2例,18-三体1例;正、异常与常规染色体核型分析结果符合率均为100%.结论 荧光原位杂交技术检测过程简单、快捷,特异性较强,且灵敏度较高,是一种可用于临床的快速产前诊断方法.     

应用改良的原位杂交方法分析Pax3基因在鸡胚脊髓中的表达

目的改良传统的原位杂交方法,提高其信号强度和特异性;应用改良的原位杂交方法分析Pax3基因在鸡胚脊髓中的表达情况。方法分子克隆Pax3 cDNA进入pCR-TopoII质粒,使用sp6 RNA聚合酶体外合成Pax3 cRNA反义探针,组织原位杂交分析Pax3(pairedbox3)mRNA在鸡胚脊髓内分布。结果获得高质量的Pax3 cRNA探针,通过改进的原位杂交方法发现Pax3 mRNA在鸡胚脊髓内呈区域状特异分布。结论改进的原位杂交方法显著提高了杂交信号特异性,Pax3在鸡胚脊髓内区域状表达显示Pax3基因在脊髓发育过程中扮演一定角色。     

荧光原位杂交技术在宫颈癌及癌前病变的检测进展

荧光原位杂交技术(FISH)是一种具有高度灵敏度和特异性的染色体和基因分析技术,该文介绍了FISH的原理、FISH技术的优点和缺点、FISH的临床应用进展,认为FISH是早期发现宫颈癌及癌前病变及判断预后有效的检测手段.     

HPV核酸原位杂交技术的应用体会

尖锐湿疣是与人类乳头瘤病毒（HPV）感染有关的性传播疾病。据报道女性生殖道尖锐湿疣HPV6／11的阳性表达占96．4％。仅凭H—E切片形态难以进行判断。HPV免疫组化阳性率很低。特异性不强，核酸原位杂交具有较高的敏感性和特异性。我室于1995年开始用原位杂交的方法鉴定HPV以确诊尖锐湿疣。反复实验对地高辛标记的探针在应用技术有了新的认识和体会。     

影响地戈辛标记cDNA探针检测prET—1mRNA原位杂交效果的因素探讨

影响地戈辛标记ｃＤＮＡ探针检测ｐｒＥＴ－１ｍＲＮＡ原位杂交效果的因素探讨①华西医科大学附属第一医院（６１００４１）陈明②黄颂敏刘聪地戈辛标记探针的原位杂交是利用地戈辛配基作为标记物，非放射性检测特异性ＤＮＡ或ＲＮＡ序列的一种分子生物学技术，可特异判别...     

检测鼠痘组织原位杂交法的建立

目的：建立用组织原位杂交检测鼠痘的方法。方法：利用已知引物序列,以从感染鼠痘的陈旧组织中提取的病毒DNA做模板,在进行PCR扩增的同时用地高辛进行标记,将扩增的DNA片段作为探针用于组织原位杂交,结果：血清学检查确诊为鼠痘的标本中出现蓝紫色杂交阳性信号,阴性及特异性对照中未出现阳性信号,结论：组织原位杂交是一种适合基层病理检测单位的快速诊断方法。     

丙型肝炎干扰素治疗前后外周血单个核细胞中HCV RNA检测研究

丙肝病毒(HCV)是引起非甲非乙型肝炎常见的病原体,HCV感染的病原学诊断,检测血清中特异性抗体采用ELISA或RIB-A和用PCR法检测血清中HCV RNA已有大量报道,但是应用非同位素原位杂交技术检测患者外周血单个核细胞中HCV RNA报告甚少.本文采用地高辛标记的HCV531bp正链和负链(中间复制体),RNA探针,应用原位杂交的方法检测20例慢性丙肝患者用干扰素治疗前和治疗以后的外周血单个核细胞中HCV RNA.旨在探讨干扰素对丙型肝炎的疗效以及丙肝病毒复制情况,现报告如下.     

PCR技术在快速筛选DNA文库中的应用

目的探讨运用PCR(polymerase chain reaction)方法快速筛选DNA文库的可行性.方法以猪α-1,3GT cDNA片段为探针,用cDNA上的特异性序列合成的引物,采用噬菌斑原位杂交和PCR相结合的方法,对猪的gDNA文库进行α-1,3GT基因筛选,经酶切、Southern Blot、测序和荧光原位杂交定位.结果经过两次杂交和一次PCR即得信号很强的7个阳性单克隆,插入子均在8kb以上,且包含第三内含子,其中3个片段测序证实含第三、第四外显子;荧光原位杂交证实该基因位于染色体1q2.10-q2.11.结论PCR可以应用于快速筛选DNA文库.     

Polycomb家族基因Nspcl在斑马鱼早期发育的表达

目的 探讨Polycomb家族基因Nspel在模式生物斑马鱼发育早期的表达模式.方法 根据GenBank中斑马鱼Nspcl的cDNA序列设计Nspcl原位杂交探针片断,并制备地高辛标记的探针.收取单细胞期、双细胞期、胚芽期及不同时间点的体节期斑马鱼胚胎,用制备好的探针作原位杂交,显微镜下拍照,获得信号适当的杂交结果.结果 在斑马鱼体节期前,Nspcl在全身表达;从体节期开始,其表达逐渐表现出特异性,主要在头部的神经系统中表达.结论 Nspcl在模式生物斑马鱼的早期发育、尤其是神经系统发育的过程中可能扮演重要角色.     

优化整体原位杂交方法检测基因在幼鼠大脑中的表达

目的 优化整体原位杂交方法,用于检测基因在幼鼠大脑中的时空表达分布。方法 通过摸索最佳蛋白酶K的消化时间,改良杂交缓冲液成分,并延长杂交时间和漂洗时间,对整体原位杂交方法进行优化,并用优化的方法检测了Cdh6、Bhlhb5和Lmo4mRNA在出生后7天的小鼠大脑中的整体表达分布。结果 采用优化的整体原位杂交方法成功地检测了3种mRNA在幼鼠全脑的区域性表达特征,特异性杂交信号强,非特异性背景低。结论 成功优化了幼鼠全脑原位杂交方法,为开展后续的研究打下基础。     

鸡胚心肌内移植入人干细胞的动物模型的建立

目的　建立人干细胞移植到鸡胚心肌中的动物模型。方法　通过显微注射的方法 ,将Hoechsst 332 5 8标记的人胚胎生殖嵴细胞 (humanprimordialgermcells ,hPGC)注射到孵化 3～ 4d的鸡胚心脏中 ,先运用人特异性的DNA探针对活鸡胚心脏切片进行原位杂交 ,以检测心肌中移植细胞的存在 ,再运用人心肌特异性抗体肌钙蛋白T(cTnT)对相邻的心肌切片进行免疫组织化学染色 ,以观察有无人心肌细胞分化 ,并统计移植成功率。结果　原位杂交显示 ,在术后 10d鸡胚的心肌中观察到有人的细胞 ,呈心肌纤维样并与鸡胚心肌细胞发生嵌合。免疫组织化学观察到鸡胚心肌中有人心肌特异性的标记物cTnT表达。移植成功率为 15 .3%± 2 .4 %。结论　在鸡胚的心肌内建立一个人干细胞移植的模型是可行的。     

应用3种方法诊断弓形虫淋巴结炎

目的探讨研究弓形虫淋巴结炎的病理诊断。方法应用免疫组化、原位杂交及间接原位PCR技术,检测71例（均来自可疑弓形虫感染者）经病理诊断为慢性非特异性淋巴结炎（淋巴结反应性增生）病人组织切片中的弓形虫。结果发现在71例中弓形虫阳性病例分别为17例（23．94％）、35例（49．30％）、41例（57．75％）,免疫组化与原位杂交、间接原位PCR结果差异有统计学意义（P〈0．005）。结论在病理诊断为慢性非特异性淋巴结炎（淋巴结反应性增生）的病人中,部分为漏诊的弓形虫淋巴结炎病例。免疫组化、原位杂交及间接原位PCR均能显示淋巴结组织切片中的弓形虫,但弓形虫检测结果阳性率从高到低依次为间接原位PCR、原位杂交及免疫组化。     

原位杂交检测肝组织中的TTV

选取非甲-非庚型肝炎后肝病死亡患者肝组织,制备地高辛标记的特异性TTV DNA探讨,应用原位杂交方法检测肝组织中TTV,观察TTV对肝组织感染的形态学特点,为TTV的致病性研究提供依据。通过本研究建立了可靠而稳定的TTV原位杂交检测方法,8例肝组织标本中4例原位杂交阳性,TTV阳性杂交信号呈核型,阳性细胞在肝组织中散在分布,部分肝小叶可有较密集的阳性细胞,提示TTV可能是一种致肝病的病毒。     

RNA干扰技术及应用

RNA干扰(RNAinference,RNAi)是指双链RNA(dsRNA)在细胞内特异性的诱导与之同源互补的mRNA降解,使相应基因的表达关闭,从而引发基因转录后水平沉默的现象.近年来,RNAi因其具有特异性、高效性等特点已经成为科研领域的新手段,它在反向基因组学、基因治疗、抗病毒、抗肿瘤、抗遗传疾病以及胚胎干细胞的研究中显示了巨大的潜力.     

荧光原位杂交检测龈下菌斑中未获培养微生物

目的 在龈下菌斑中观察一种未获培养的牙周可疑致病微生物AU126.方法 针对AU126设计并评估特异性探针.使用激光共聚焦显微镜,通过与包含插入子克隆的原位杂交,定量分析荧光信号强度研判杂交严谨度.在严谨度分析获得的特定条件下,将慢性牙周炎患者的龈下菌斑标本与AU126探针进行杂交,运用共聚焦显微镜寻找AU126.结果 AU126探针理想杂交是在10%甲酰胺中进行.通过对细菌轮廓荧光强度均值的判断,证实龈下菌斑中存在ROX-126标记的阳性细菌.细胞呈杆状,长4.0～5.4 μm,宽0.64～0.84 μm.结论 在评估了AU126探针的特异性以及确定理想杂交严谨度的条件下,运用荧光原位杂交结合激光共聚焦显微镜技术,成功观察到人类龈下菌斑中的一种未获培养微生物AU126.     

~3H标记DNA探针进行染色体原位杂交

近年来,由于重组DNA技术在医学科学上的应用,使遗传病的诊断从表型水平、蛋白质水平及染色体水平跨入核酸水平,从而形成了基因诊断的新领域。染色体原位杂交是一种简便、直接、精确的染色体基因定位方法。我们用~3H标记人Y染色体特异性DNA探针(PY3·4)进行染色体原位杂交。     

经典H-2分子mRNA探针的制备及在C57小鼠中枢神经系统原位杂交中的应用

目的:研究经典H-2基因在C57小鼠中枢神经系统中的表达谱,设计合成地高辛标记的经典H-2 mRNA探针.方法:利用PCR扩增出针对经典H-2分子的特异性保守片段,然后将PCR产物纯化后与pGEM-T Easy载体连接,转化到大肠杆菌DH5α中.测序后获得目的基因的单克隆,扩增并提取质粒,采用体外转录的方法合成地高辛标记的经典H-2 mRNA的正、反义RNA探针.运用原位杂交方法分析经典H-2基因在C57小鼠中枢神经系统中的表达情况.结果:成功构建了321 bp经典H-2 mRNA的正、反义探针,原位杂交方法检测到经典H-2 mRNA在出生后15 d小鼠中枢神经系统中反义探针有杂交信号,正义探针无杂交信号.结论:正义探针无杂交信号表明合成的321 bp经典H-2 mRNA反义探针具有特异性.