肠道病毒71型 VP1基因的扩增、克隆、表达及蛋白分析

目的：对肠道病毒71型 VP1基因片段进行扩增、克隆、生物信息学分析、原核表达、纯化,初步证实重组表达产物的生物学活性。方法根据 GenBank 中 EV71序列设计一对特异性引物,以 EV71患者咽拭子标本中提取病毒核糖核酸为模板, RT-PCR 扩增 EV71 VP1基因,酶切后插入表达载体 pET28a。构建 pET28a-EV71 VP1原核表达载体。转化 E．coli DH5α,IPTG诱导表达,使用 SDS-PAGE 及 Western blot 分析表达结果,利用软件对测序结果进行生物信息学分析。纯化蛋白并包被反应板,用 ELISA 分别检测 EV71阳性与 COX A16阳性患者 VP-1 IgG 抗体,进行统计学分析。结果目的基因经 BLAST 比对,同源性与 GenBank 登录号为 JQ766207．1 EV71 VP1一致性达99％。EV71 VP1蛋白相对分子质量约为32×10^3,主要以包涵体形式存在。生物信息学分析得出,EV71 VP1蛋白为亲水性蛋白,无跨膜区,不具有 N-端信号肽序列,存在三级结构。ELISA 结果显示EV71阳性患者 OD 值为（2．425±0．521）,COX A16阳性患者 OD 值为（1．205±0．314）,健康对照组 OD 值为（0．353±0．128）。EV71 VP1蛋白检测敏感性和特异性分别为84％和88％。结论成功构建了 pET28a-EV71 VP1表达载体;通过对手足口患者血清进行 ELISA 初步分析,得出目的蛋白有较高的敏感性和特异性,初步证实具有生物学活性,可进一步用于 EV71诊断及疫苗的相关研究。     

肠道病毒71型VP1蛋白原核表达及初步鉴定

目的采用分子克隆技术,构建肠道病毒71型(EV71)VP1全长基因大肠杆菌原核系统表达载体,诱导重组VP1融合蛋白表达。方法自EV71感染患者血清中提取病毒总RNA,进行一步法RT-PCR,扩增编码VP1蛋白的全长基因片段(891 bp),以pET32(a)为表达载体,构建重组表达质粒pET32(a)-VP1,转化E.coli.Rosseta感受态细胞,获得重组工程菌株。经诱导培养,SDS-PAGE电泳,免疫印迹鉴定表达产物。结果获得了含重组表达质粒pET32(a)-VP1的正相阳性工程菌株,经IPTG诱导能高效表达VP1融合蛋白。结论重组工程菌可表达VP1融合蛋白,对研究EV71发病机制及疫苗研制具有重要意义。     

重组日本血吸虫亲环素B的克隆、表达及免疫分析

目的克隆、表达日本血吸虫亲环素B(SjCyPB)基因,鉴定并分析重组蛋白的免疫性。方法根据Genbank中日本血吸虫序列设计一对特异性引物,以日本血吸虫cDNA为模板扩增SjCyPB基因,酶切后连接到表达载体pET28,构建pET28a(+)-SjCyPB重组质粒,转化入感受态大肠杆菌BL21/DE3后对质粒进行双酶切和测序鉴定。IPTG诱导表达后,经亲和层析纯化重组蛋白。采用Western Blotting分析鉴定重组蛋白的抗原性。将纯化的重组蛋白免疫大鼠,获得免疫血清,ELISA检测抗SjCyPB特异性抗体滴度。结果构建的pET28a(+)-SjCyPB重组质粒经双酶切和测序鉴定证实SjCyPB基因成功连接到pET28a(+)质粒中。经原核表达后获得纯化的重组蛋白,Western Blotting结果显示,该重组蛋白可与感染日本血吸虫的兔血清结合形成明显的条带。采用ELISA检测重组蛋白免疫后大鼠免疫血清的特异性IgG抗体滴度为1∶51 200。结论成功克隆了日本血吸虫CyPB基因,并获得大量纯化的重组蛋白,重组SjCyPB具有免疫原性和抗原性。     

戊型肝炎病毒ORF3蛋白的表达及其多克隆抗体制备

[目的]原核表达戊型肝炎病毒ORF3蛋白,探讨其抗原性,并制备特异性多克隆抗体。[方法]PCR扩增ORF3全长基因,将其克隆到原核表达载体pET32b中,诱导表达目的蛋白,并用戊型肝炎病毒阳性血清鉴定其抗原性。蛋白纯化后免疫小鼠制备多克隆抗体,ELISA检测抗体效价,western blot检测抗体特异性。[结果]成功构建原核表达载体pET32b—ORF3,在大肠杆菌中高效表达分子量约为32kDa的融合蛋白,ELISA分析表明其具有良好的抗原性。纯化的表达蛋白制备的多克隆抗体具有较强的特异性,效价达到1：32000。[结论]重组表达蛋白ORF3具有良好的抗原性,可用于戊型肝炎诊断试剂盒研制,制备的多克隆抗体特异性强效价高,为进一步研究戊型肝炎病毒奠定了实验基础。     

靶向克隆法构建PEP-1-VP3基因的原核表达载体

目的 利用PCR 产物靶向克隆法构建细胞穿透肽-凋亡素(PEP-1-VP3)的原核表达载体.方法 以PGEX-6P-1/TAT-VP3 质粒为模板,PCR 扩增VP3 基因的366 bp 片段,应用靶向克隆酶,将VP3 基因插入到线性pET15b-PEP-1,得到重组表达质粒pET15b-PEP-1-VP3,经过筛选,挑选出阳性克隆进行Nde Ⅰ和BamHⅠ双酶切图谱分析和重组质粒核苷酸序列分析以鉴定所构建的原核表达载体.结果 PCR产物经过电泳可见366 bp 特征性的VP3 片段,重组的质粒经过双酶切获得了一个大小为440 bp 的特征性PEP-1-VP3 片段,重组质粒测序证实VP3 cDNA 编码区成功地克隆入了pET15b-PEP-1,且其序列与GeneBank 中VP3 cDNA 序列完全一致.结论 靶向克隆法可快速、高效地构建PEP-1-VP3 基因的原核表达载体,为制备PEP-1-VP3 融合蛋白奠定基础.     

A组轮状病毒VP7基因表达及ELISA检测的方法研究

目的纯化原核系统中表达的A组轮状病毒VP7基因,建立间接ELISA方法,为进一步大量表达VP7基因,构建基因工程疫苗和建立快速临床检测奠定基础。方法反转录并扩增VP7基因,连接到载体中,转换乳酸杆菌,诱导并纯化重组蛋白。将纯化蛋白免疫家兔制备抗血清,并建立间接ELISA方法。结果成功获得VP7基因的扩增片段,筛选阳性克隆,得到大小为28 kD的大量表达蛋白。确定了间接ELISA法的最佳反应条件和工作浓度。结论构建的重组乳酸杆菌能够大量表达VP7蛋白,纯化的VP7蛋白有很好的免疫原性,制备的抗血清用于ELISA方法能够得到准确的检测结果。     

一种新的肿瘤相关蛋白-OVA12和抗体制备及其初步应用

目的　制备原核表达的OVA12纯化蛋白 ,研究正常人与肿瘤患者血清中抗OVA12抗体水平的差异。方法　克隆OVA12的cDNA至pGEMT载体中 ,经测序确证后 ,将该基因插入原核表达载体pET32a( )中 ,并转化至E .coli表达菌BL2 1(DE3)中 ,诱导 6×His融合蛋白表达 ,经Ni2 亲和层析及胶回收技术纯化蛋白 ,并将蛋白免疫动物制备兔抗OVA12蛋白抗体 ;采用ELISA、Dotblot、Westernblot法比较正常人及肿瘤患者血清中抗体水平的差异。结果　获得纯化OVA12蛋白及高滴度的兔抗血清 ;ELISA法测定显示 ,正常人组OD均值为 0 17± 0 0 7,肿瘤患者组OD均值为0 32± 0 15 ,两组之间有显著性差异 (P <0 0 0 0 1) ,并选择其中样本经Westernblot、Dotblot加以进一步证实。结论　成功克隆OVA12基因 ,并获得纯OVA12蛋白和高滴度的兔抗血清 ;ELISA等方法测定肿瘤患者与正常人血清中OVA12抗体水平有明显差异 ,为临床检测的应用奠定基础。     

GⅡ型诺如病毒衣壳蛋白抗原表位预测及单克隆抗体的制备

目的原核表达诺如病毒衣壳蛋白VP1,制备抗诺如病毒衣壳蛋白VP1的单克隆抗体,并研究其抗原表位特性。方法 PCR扩增GⅡ型湖州株诺如病毒VP1蛋白基因,将目的基因克隆至载体pET28a(+),转化至大肠埃希菌原核表达。纯化表达产物免疫BALB/c小鼠,将成功免疫的小鼠脾细胞与骨髓瘤SP2/0细胞融合。用Modeller9.9为诺如病毒GⅡ型湖州株VP1蛋白构建三维模型,构建好的三维模型提交到SEPPA在线B-cell空间表位预测软件,对GⅡ型湖州株VP1蛋白进行空间表位预测。用预测的表位序列来筛选阳性克隆,得到对应这些表位的单克隆抗体。结果成功构建重组表达载体pET28a(+)-Noro-VP1并在大肠埃希菌中获得表达,重组蛋白免疫的BALB/c小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合,用预测的抗原表位多肽筛选,获得10株杂交瘤细胞株。与重组蛋白的ELISA结果显示1E8、1P10、2C15和2L16四株反应性最强,其他几株反应性较弱。Western blotting结果显示只有2K10、1K16、1E8三株能与重组蛋白很好的结合。结论成功制备了抗GⅡ型湖州株诺如病毒VP1蛋白的单克隆抗体,抗原表位位于衣壳蛋白的P2区,为制备诺如病毒快速免疫诊断试剂盒及抗原表位的研究提供基础。     

结核分枝杆菌Rv3872基因的克隆、表达和纯化

目的原核表达并纯化结核分枝杆菌Rv3872蛋白。方法聚合酶链反应（PCR）技术从结核分枝杆菌标准株H37Rv全基因组中扩增出的表达Rv3872基因序列，将其克隆到pMD18-T载体后，测序分析。亚克隆该目的基因到pET28a表达载体，最终转化至大肠杆菌BL21（DE3），获得正确的阳性克隆子后大量表达重组Rv3872蛋白，再经纯化、定量后，通过Western blot分析其抗原性。结果扩增Rv3872基因经序列测定与GenBank公布的序列完全一致，表达蛋白经SDS-PAGE分析，在约15000kD处有表达条带，纯化后的重组蛋白占总蛋白的90％以上。免疫印迹分析显示重组的Rv3872蛋白具有抗原性。结论成功表达结核分枝杆菌的Rv3872蛋白，为结核病血清学诊断候选抗原筛选和开发应用打下基础。     

穿膜肽-TDRGl重组蛋白原核表达载体的构建

构建穿膜肽TAT与TDRG1融合蛋白的原核表达载体。以p YD5-TDRG1载体为模板,设计N端和C端含有flag序列和不同酶切位点的引物,利用PCR技术扩增TDRG1基因片段。同时利用内切酶对已构建好的载体pET28aTAT-EGFP和pET28a-EGFP-TAT进行酶切处理,再把扩增产物插入已处理好的线性载体pET28a(含有TAT)中,构建成重组质粒pET28a-TAT-TDRG1和pET28a-TDRG1-TAT,热激转化到E.coli感受态细胞TOP10中,菌检PCR筛选,送测序比对验证。PCR扩增出TDRG1基因片段,目的插入片段长约344bp,产物行限制性内切酶酶切后连接到预先酶切处理好的线性载体pET28a上,并成功转化到E.coli感受态细胞TOP10中,菌检PCR筛选后挑选阳性克隆抽质粒送测序,测序比对序列完全一致。成功构建了原核表达载体pET28a-TAT-TDRG1和pET28a-TDRG1-TAT。     

NGAL原核表达及多克隆抗体的制备

目的构建人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)的原核表达载体,制备兔抗人NGAL多克隆抗体。方法利用DNA重组技术构建原核表达载体pET28a-NGAL,诱导表达NGAL融合蛋白,分离该融合蛋白后,注射入免疫家兔制备多克隆抗体。结果成功获得NGAL,免疫动物所得抗血清效价为1∶4000,该抗体能够识别原核表达的NGAL。结论成功克隆NGAL基因并制备了特异性的兔抗人NGAL多克隆抗体。     

人偏肺病毒F1、F2亚单位原核表达系统的构建及多克隆抗体制备

目的 构建人偏肺病毒融合蛋白亚单位F1、F2原核表达系统,初步获得抗F1、F2重组蛋白的多克隆抗体,为相关疫苗的研究奠定基础。 方法 聚合酶链反应(PCR)法扩增F1、F2基因片段,经T-A克隆确保其准确性,双酶切后插入原核表达载体pET32a(+)中,转化大肠埃希菌BL21(DE3),按优化后条件大量诱导表达,纯化后经Western Blot检测特异性。取纯化蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,ELISA法检测效价,间接免疫荧光法(IFA)检测多克隆抗体是否能与人偏肺病毒发生特异性反应。 结果 F1、F2基因均正确插入pET32a(+)中,并具有正确的读码框架。0.5 mmol/L IPTG 37 ℃诱导培养5 h可获得大量带His标签的重组蛋白,纯化后浓度分别达到200 g/ml和300 g/ml。Western Blot结果显示,重组蛋白可被抗His标签抗体特异识别;免疫小鼠获得多克隆抗体效价分别为抗pET32a-F1最高1 : 640,抗pET32a-F2最高1 : 40 960。IFA显示抗pET32a-F1、抗pET32a-F2多克隆抗体均可与人偏肺病毒作用产生特异性荧光。 结论 成功构建了F1、F2的原核表达质粒, 并在大肠埃希菌中获得高效表达,该蛋白具有良好的抗原性;免疫小鼠获得特异性多克隆抗体,有利于人偏肺病毒的深入研究。     

兔抗人KiSS-1抗体的制备与鉴定

目的 制备兔抗人KiSS-1多克隆抗体.方法 聚合酶链反应（PCR）法扩增出KiSS-1基因,将其克隆入原核表达载体pET28中,转化大肠埃希菌BL21（DE3）.采用异丙基-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导重组蛋白的表达,采用镍离子螯合琼脂糖凝胶（Ni^2＋-NTA）亲和层析法纯化重组蛋白,以之为免疫原免疫家兔,制备多克隆抗体,并用酶联免疫吸附测定（ELISA）、Western blot及免疫组织化学法检测抗体.结果 成功构建了KiSS-1原核表达载体pET28/ KiSS-1,高效表达并纯化KiSS-1蛋白,间接ELISA检测所制备抗体的效价为1：6 400.Western blot鉴定制备的抗体与KiSS-1蛋白能特异性结合,免疫组织化学法检测结果表明该抗体识别人卵巢癌组织中的天然KiSS-1.结论 成功制备了效价高、特异性较强的兔抗人KiSS-1抗体,为进一步探讨KiSS-1在卵巢癌的发生、发展过程中的作用奠定了基础.     

重组大鼠肝再生增强因子原核表达载体构建及多克隆抗体制备

背景:国外有1篇文献报道了肝再生增强因子在中枢神经系统内的分布与表达.由于关于重组大鼠肝再生增强因子蛋白多克隆抗体制备、鉴定及原核表达载体如何构建的相关文献较少,国内对于其在中枢神经系统的研究目前未见报道.目的:利用大肠杆菌BL21表达大鼠肝再生增强因子融合蛋白,并制备和鉴定其多克隆抗体.方法:提取SD大鼠海马组织RNA,构建原核表达重组质粒pET28a-ALR并转化到宿主菌BL21中,经异丙基-β-D-硫代 半乳糖苷诱导表达目的融合蛋白,经Ni2+亲和层析纯化回收,4次免疫日本大耳白兔后,心脏取血,吸取血清作为多克隆抗体,以ELISA测定抗体血清效价,Western-blotting检测抗体的特异性和亲和性.观察:①原核表达重组质粒pET28a-ALR构建.②pET28a-ALR重组体酶切鉴定.③ELISA及Western-blotting检测结果.结果与结论:双酶切电泳检测结果显示得到了预期条带,其大小分别为5.3 kb和0,4 kb,经核苷酸序列分析证明成功构建了pET28a-ALR原核表达载体.成功获得分子质量约为19 ku纯化的融合蛋白.ELISA测定显示多克隆抗体效价可达到1:2 000,说明抗体与纯化的重组肝再生增强因子蛋白具有良好的反应性,有较高的效价,可满足实验的要求.通过Western-blotting检测证明该抗体可以特异性识别肝再生增强因子蛋白.实验成功地利用原核表达体系表达了肝再生增强因子融合蛋白,并制备、纯化了抗肝再生增强因子蛋白的多克隆抗体,经鉴定能够满足针对肝再生增强因子免疫印迹检测的实验要求.     

乙型脑炎病毒NS1基因片段的克隆、表达及鉴定

目的 构建乙型脑炎病毒NS1基因的重组原核表达质粒,诱导重组蛋白表达及免疫学鉴定. 方法 以乙型脑炎病毒基因组为模板,RT-PCR扩增NS1基因片段,构建其重组原核表达载体,并采用Western Blot方法初步鉴定该蛋白的特异性. 结果 成功扩增出乙型脑炎病毒NS1基因片段,该基因在大肠杆菌表达系统中得到表达,并且特...     

白念珠菌果糖二磷酸醛缩酶重组蛋白的制备及鉴定

摘要：目的：制备有免疫原性的白念珠菌果糖二磷酸醛缩酶（fructosebisphosphate aldolase, Fba1)重组蛋白。 方法：以白念珠菌C1标准株基因组DNA为模板,用PCR法扩增Fba1 DNA序列,与克隆载体pMD18-T连接、测序,再与原核表达载体pET28a(+)连接,构建成重组表达质粒pET28a(+)/Fba1,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导重组融合蛋白表达,亲和层析柱纯化重组蛋白。用抗His标签的单克隆抗体鉴定融合蛋白,并用确诊为侵袭性白念珠菌病（ICAI）、且抗白念珠菌烯醇化酶抗体阳性的患者血清进行抗原性鉴定。 结果：Fba1 DNA序列与GenBank中的序列一致。在大肠埃希菌中获得白念珠菌Fab1重组蛋白的高效表达,表达产物以可溶性蛋白为主,最终蛋白质得率为7.6 mg/g湿菌。经免疫印迹鉴定,重组蛋白与抗His标签的单克隆抗体和确诊ICAI患者血清呈特异性反应,显示出良好的抗原反应性。 结论：成功制备了具有良好抗原反应性的重组蛋白,为建立特异性诊断ICAI的新方法打下基础。     

肠道病毒71型2A蛋白酶通过切割宿主蛋白泛素特异性蛋白酶4促进病毒的复制

目的探讨肠道病毒71型(EV71)2A蛋白酶与宿主蛋白泛素特异性蛋白酶4(USP4)在EV71感染中的作用。方法实时荧光定量PCR检测EV71感染人横纹肌肉瘤细胞(RD)后USP4 mRNA表达水平,western blot检测VP1及USP4蛋白;通过敲减宿主细胞USP4,观察VP1 mRNA的表达和病毒滴度水平;通过过表达2A蛋白酶,研究宿主细胞USP4蛋白的切割原因。结果荧光定量PCR结果表明,EV71感染8 h时USP4 mRNA的表达水平开始降低(0 h、8 h分别为1.03±0.04和0.83±0.02,t=4.50,P<0.05);western blot结果表明,EV71感染8 h时USP4的蛋白质表达水平降低(0 h、8 h分别为1.25±0.01和0.51±0.02,t=57.32,P<0.05)并出现切割条带;敲除宿主细胞USP48 h后,与对照组(1.48±0.08)相比,实验组VP1 mRNA表达水平(3.66±0.08)明显升高(t=17.51,P<0.05);病毒滴度检测结果发现,与对照组病毒滴度[(8.20±0.17)×105 PFU/mL]比较,siRNA1敲除组病毒滴度[(10.55±0.29)×105 PFU/mL]升高,差异有统计学意义(t=6.98,P<0.05)。过表达2A蛋白酶,宿主蛋白USP4出现切割条带。结论USP4参与抗病毒免疫反应,可能正向调节抗病毒信号通路;EV71可通过2A蛋白酶切割宿主细胞蛋白USP4从而逃逸免疫应答,促进病毒的复制。     

HBoV VP1-U蛋白抗原的表达纯化

目的人博卡病毒（HBoV）是近几年发现的一种导致人支气管炎的病原体,本研究旨在表达纯化其VP1衣壳蛋白独有区（VP1-U）抗原,为免疫学诊断治疗奠定基础。方法优化HBoV VP1-U DNA密码子,以适应大肠杆菌原核表达密码子亲嗜性。将密码子优化改造的DNA序列克隆到pET30a（＋）原核表达载体,C末端融合表达组氨酸亲和纯化标签。LB培养基增菌,IPTG诱导表达。采用自行设计的纯化缓冲液体系,镍株亲和纯化,超滤浓缩。结果VP1-U蛋白表达效率约为50%,纯化活性蛋白浓度为3.3mg/ml。结论经过密码子优化,合理设计工艺流程,原核表达系统可以高效表达纯化VP1-U活性蛋白抗原。     

抗CD133单链抗体/白喉毒素DAB389融合蛋白的基因构建、表达、纯化及鉴定

目的构建抗CD133单链抗体(scFV)/白喉毒素DAB389融合蛋白,在大肠杆菌里表达,并鉴定及纯化。方法采用PCR的方法,扩增融合基因DAB389-Linker-CD133(scFV),并插入到原核表达载体pET28a中,构建了重组表达载体pET28a-DAB389-CD133,融合蛋白在BL21(DE3)中表达,表达产物经SDS-PAGE鉴定,通过Ni柱纯化目的蛋白,获得了纯度达95%的DAB389-Linker--CD133(scFV)融合蛋白。Western blot鉴定蛋白活性。流式细胞仪检测能否与CD133抗原特异性结合。结果扩增的片段与理论值一致,序列分析正确;纯化得到纯度为95%的重组蛋白。Western blot分析能特异性地与抗白喉抗体结合。流式细胞仪检测能与CD133抗原特异性结合。结论成功构建了抗CD133单链抗体(scFV)/白喉毒素DAB389融合蛋白,具有结合抗原和免疫毒素双重活性,为进一步靶向治疗奠定了基础。     

心肌特异表达基因p93的原核表达及鸡卵黄抗体的制备

目的在大肠杆菌中高效表达心肌特异表达基因p93，以此作为抗原免疫产蛋母鸡，制备抗p93蛋白鸡卵黄抗体（IgY）。方法将p93基因分别插入原核表达载体pGEX-5X-1、pBV220、pET28a（＋）中，选取表达量最高的载体进行表达纯化，其产物免疫产蛋母鸡。结果插入pET28a（＋）中N端带有His标签的p93表达水平最高，且以包涵体形式存在，从含有pET28a-p93质粒的1L培养的菌液中可获得3mg纯化的p93蛋白。免疫产蛋母鸡，末次免疫后其卵黄抗体最高滴度达到1：64000，Western blot结果显示该抗体具有高度特异性。结论此抗体的制备为新基因p93的检测提供了良好的工具。