Galectin-7多克隆抗体的制备与鉴定

目的 制备鼠抗重组半乳糖凝集素7(Galectin-7)多克隆抗体及其在膀胱癌组织中特异性鉴定。方法 PCR法从人包皮组织中扩增Galectin-7基因,并构建到pET28a表达载体中,使用IPTG诱导重组蛋白的表达,通过镍柱亲和层析纯化获得Galectin-7蛋白。以纯化的Galectin-7蛋白混合福氏完全佐剂免疫Balb/C小鼠制备抗体,并用ELISA,Western blot及免疫组织化学法检测抗体。结果 成功表达、纯化了Galectin-7重组蛋白,ELISA检测Galectin-7蛋白免疫的小鼠血清效价为1:32 000,Western blot显示该抗体能与天然的Galectin-7特异结合,免疫组织化学法检测结果表明该抗体识别人膀胱肿瘤组织的天然Galectin-7。结论 通过制备重组Galectin-7蛋白为免疫原,免疫家兔,成功地制备了效价高、特异性好的抗Galectin-7多克隆抗体。     

抗人S100A7抗体的制备

目的 制备兔抗人S100A7（hS100A7）多克隆抗体。方法制备原核表达重组人S100A7,用纯化的hs100A7为免疫原免疫新西兰大白兔,制备兔抗人S100A7抗体,并以问接ELISA测定抗体效价,以Westernblot和免疫组织化学法鉴定抗体的特异性。结果成功制备了重组人S100A7及其抗体,ELISA结果显示抗体效价达1：16000,Western blot和组织化学法分析表明该抗体能特异结合hS100A7。结论以纯化的重组人S100A7为免疫原,成功地制备了效价高、特异性强的兔抗人S100A7抗体。     

登革病毒1型E蛋白的原核细胞表达及多克隆抗体的制备

目的构建登革病毒1型（DENV-1）E蛋白的原核细胞表达载体并进行原核细胞表达,并制备其多克隆抗体。方法利用聚合酶链反应（PCR）扩增DENV-1E蛋白序列,经酶切后将其插入原核细胞表达载体pET-32a（＋）,构建重组质粒pET-32-D1-E。重组质粒转化E.Coli Rosetta（DE3）感受态细胞,目的蛋白经异丙基-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达,纯化后采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）初步分析蛋白表达情况,并用纯化后的表达蛋白免疫家兔,制备该蛋白的多克隆抗血清,用间接酶联免疫吸附测定（ELISA）检测抗体的效价,Western blot检测抗体的特异性。结果成功构建了pET-32-D1-E原核细胞表达重组质粒,DENV-1E蛋白获得高效表达;纯化后的重组蛋白免疫家兔获得的特异性抗血清效价为1∶25 600,Western blot证实其特异性良好。结论成功构建了DENV-1E蛋白的原核细胞表达载体,并制备了可用于DENV快速检测的高效多克隆抗体。     

1种改良的高效单特异性兔多克隆抗体的制备方法

目的建立1种改良的高效单特异性兔多克隆抗体的制备方法。方法用RT-PCR方法获得bax保守N端1～123位氨基酸基因片段,并将其插入pET42a原核表达载体,诱导表达的Bax融合蛋白组合应用GST、His亲和层析技术获得免疫原(pET42a/Bax融合蛋白),HPLC鉴定纯度达95%。利用改良快速免疫法获得人Bax兔多克隆抗体,并经蛋白A柱亲和层析技术,抗原亲和纯化技术获得高效价高特异性的抗体。间接ELISA检测抗体滴度、Western blot和免疫组化试验检测抗体特异性,并与商业化抗体进行对比。结果通过快速免疫法得到人Bax兔多克隆抗体,经过Protein A柱纯化,再经抗原亲和纯化后,间接ELISA证明,抗体效价均达1:51 200;Western blot显示,只有经过抗原亲和纯化后的抗体特异性高,无其他杂带;免疫组化证明,在原发性肝癌组织中,人Bax兔多克隆抗体能特异地和内源性Bax结合,其高效高特异性已达国外Santa Cruse公司Bax商业化抗体水平。结论快速免疫法与抗原亲和纯化相结合,获得人Bax高效单特异性兔多克隆抗体,建立了1种改良的高效单特异性兔多克隆抗体的制备方法。     

戊型肝炎病毒ORF3蛋白的表达及其多克隆抗体制备

[目的]原核表达戊型肝炎病毒ORF3蛋白,探讨其抗原性,并制备特异性多克隆抗体。[方法]PCR扩增ORF3全长基因,将其克隆到原核表达载体pET32b中,诱导表达目的蛋白,并用戊型肝炎病毒阳性血清鉴定其抗原性。蛋白纯化后免疫小鼠制备多克隆抗体,ELISA检测抗体效价,western blot检测抗体特异性。[结果]成功构建原核表达载体pET32b—ORF3,在大肠杆菌中高效表达分子量约为32kDa的融合蛋白,ELISA分析表明其具有良好的抗原性。纯化的表达蛋白制备的多克隆抗体具有较强的特异性,效价达到1：32000。[结论]重组表达蛋白ORF3具有良好的抗原性,可用于戊型肝炎诊断试剂盒研制,制备的多克隆抗体特异性强效价高,为进一步研究戊型肝炎病毒奠定了实验基础。     

a-N-乙酰半乳糖胺酶多克隆抗体的制备及特异性鉴定

目的制备a-N-乙酰半乳糖胺酶(NAGA)的高效价高特异性的兔多克隆抗体。方法利用pET22b-NA-GA/BL21(DE3)工程菌株表达NAGA,经Ni2+Sepharose 6 FF亲合层析,Phenyl Sepharose 6 FF疏水层析两步纯化,得到纯度95%的NAGA作为抗原免疫新西兰白兔,获得NAGA的兔抗血清,并经HiTrap rProtein A柱纯化获得高效价高特异性的抗体;用间接ELISA法检测抗体效价,用Western blotting评价抗体特异性。结果制备得到的NAGA兔多克隆抗体血清效价为1×106,经过rProtein A柱纯化后抗体蛋白纯度95%,效价为1×105;Western blotting显示:该NAGA兔多克隆抗体只与NAGA发生特异性反应。结论获得了NAGA的高效价高特异性的兔多克隆抗体。     

抗热休克蛋白72多克隆抗体血清的制备和检测

目的 探讨在大肠杆菌中表达人热休克蛋白72（hHSP72）与组氨酸（His）的融合蛋白并制备其抗体血清的方法。方法 将hHSP72片断插入His融合表达载体pPROEX-1^TM，重组载体酶切鉴定后，在大肠杆菌中经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达获得His-hHSP72融合蛋白。采用纯化后的HSP72免疫新西兰白兔，制备抗血清；蛋白质免疫印迹法（Western blot）检测重组抗原的免疫活性。结果 重组质粒酶切鉴定结果表明，hHSP72基因已正确插入到pPROEX-1^TM中，经IPTG诱导后，表达出分子质量约为73ku的蛋白，获得了效价为1：100000的多克隆抗体。Western blot检测证明，所制备的多克隆抗体可以与hHSP72特异性结合，其效价高于市售的单克隆抗体。结论 用hHSP72片断在大肠杆菌中能成功表达，并能制备得到多克隆抗体；这种多克隆抗体是一种新的高特异性和高灵敏度的试剂。     

重组人胱抑素C及其多克隆抗体的制备

目的探讨重组人胱抑素C（Cys C）及其多克隆抗体的制备。方法根据大肠埃希菌编码蛋白的特性设计Cys C编码基因序列,人工合成目的基因,并将其在大肠埃希菌中表达,目的蛋白经亲和层析纯化后免疫新西兰大白兔;采用Western blot和酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测兔血清重组人Cys C及其多克隆抗体。结果制备的重组人Cys C纯度达90%以上,抗重组人Cys C抗体具有很好的结合效价和特异性。结论制备的重组人Cys C及其抗体可用于进一步的实验研究和临床应用。     

重组人tumstatin的原核生物表达和多克隆抗体制备

目的原核生物表达可溶性的tumstatin抗原并制备相应的多克隆抗体。方法利用原核表达载体pMAL-tumstatin在大肠埃希菌BL21中表达tumstatin,经Amylose Resin亲和层析柱和Q Sepharose Fast Flow柱纯化tumstatin,以纯化蛋白免疫新西兰兔,获得抗tumstatin多克隆抗体。利用western blot和ELISA法对多克隆抗体进行特异性和效价检测。结果tumstatin蛋白表达成功。SDS-PAGE分析表明其为可溶性表达。成功获得了tumstatin纯品及兔抗tumstatin多克隆抗体。ELISA法表明多克隆抗体效价>5 000。western blot检测证明多克隆抗体的特异性良好。结论成功表达、纯化tumstatin蛋白,并获得高特异性、高效价兔抗tumstatin多克隆抗体,为其在临床免疫学检测应用奠定了基础。     

肺炎嗜衣原体Cpn 0147重组蛋白的免疫学活性研究

目的 研究Cpn 0147重组蛋白的免疫学活性及其应用于肺炎嗜衣原体(Cpn) 感染临床诊断中的价值.方法 采用GST琼脂糖凝胶纯化目的 蛋白,将Cpn 0147重组蛋白免疫新西兰兔,分别应用Western blot、ELISA法检测其免疫反应性及免疫原性,同时通过检测临床标本以评估其诊断价值.结果 成功表达并纯化了相对分子质量约41×103的重组蛋白GST-Cpn 0147;Western blot和ELISA结果显示,该重组蛋白具有良好的免疫反应性,动物实验结果表明该重组蛋白具有较好的免疫原性,ELISA结果显示该重组蛋白免疫新西兰兔血清抗体效价为1∶12 800.结论 Cpn 0147重组蛋白具有较好免疫学活性和特异性,可为Cpn感染的确诊、预防研究奠定基础.     

白念珠菌CDRl和CDR2多克隆抗体制备及鉴定

目的：制备特异性白念珠菌外排泵（CaCDRl和CaCDR2）的多克隆抗体,为研究CaCDRl和CaCDR2在介导白念珠菌耐药中的作用奠定基础。方法：利用Pfam网络预测程序和Blastn、Blastx程序设计引物．采用PCR法获得白念珠菌SC5314基因组上486bp长度的CDRl和CDR2目的基因,并将其克隆入pET-28a（＋）质粒,构建重组表达质粒后,转化人大肠埃希菌BL21宿主菌内,在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导下表达6xHis融合蛋白;经镍柱纯化蛋白后,免疫新西兰兔,制备兔抗多克隆抗体。用ELISA及蛋白印迹法检测该抗体的效价和特异性。结果：ELISA法检测所制备抗体的效价最终定为1：12800,工作浓度定为1：800;蛋白印迹法检测结果显示,抗体能与CaCDRl及CaCDR2蛋白特异性结合。结论：成功获得具有较高效价和良好特异性的CaCDRl、CaCDR2多克隆抗体．可用于白念珠菌CaCDRl、CaCDR2蛋白水平的鉴定。     

MR-1S融合蛋白的表达、纯化与保存及其抗血清的制备

目的通过人肌纤生成调节因子1(hMR-1S)基因重组表达获得MR-1S-His融合蛋白,纯化后制备抗MR-1S抗血清;同时确定该蛋白保存的稳定体系,为研究MR-1S蛋白理化性质及其功能提供关键的原料。方法利用原核表达载体pET21a(+),构建pET21a-MR-1S重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导MR-1S-His融合蛋白表达,亲和纯化后Western blot鉴定;进一步用该融合蛋白免疫新西兰兔,制备抗MR-1S的多克隆抗体。同时通过在不同温度条件下,对4种不同的稳定体系中保存后蛋白活性测定进行比较,确定最合适的稳定保存体系及条件。结果构建了重组质粒pET21a-MR-1S,并在BL21中进行可溶性表达,经Western blot鉴定确认;免疫新西兰兔获得了抗MR-1S抗血清;确定了合适的稳定体系及保存条件。结论在非变性条件下实现了可溶性MR-1S融合蛋白的表达和稳定保存,进一步制备的抗MR-1S抗血清为研究MR-1S的性质及功能奠定了基础。     

小鼠OC-STAMP蛋白表达、纯化、抗体制备及鉴定

目的 OC-STAMP蛋白是一种功能尚不明确的六次跨膜蛋白,通过制备多克隆抗体来为进一步研究其功能奠定基础.方法 采用PCR技术扩增出目的基因,将其克隆到pGEX-4T-1原核表达载体中.经IPTG诱导后,重组质粒pGEX-4T-1/OC-STAMP表达含重组谷胱甘肽转移酶（GST）的融合蛋白GST-OC-STAMP.GST-OC-STAMP融合蛋白经纯化后免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体.此后应用ELISA及Western blot方法鉴定该抗体.结果 pGEX-4T-1/OC-STAMP重组质粒构建成功,并通过原核表达获得达到免疫要求的融合蛋白.免疫所得抗体血清经间接ELISA法、Western blot检测,确定获得了高效价的小鼠OC-STAMP多克隆抗体.结论 成功制备了小鼠OC-STAMP抗体,为进一步研究基因功能奠定了基础.     

鼠抗人肥大细胞类糜蛋白酶N端片段抗体的制备与鉴定

目的:在大肠杆菌中表达人肥大细胞类糜蛋白酶(hMCC)N端片段(hMCC-N),并制备其鼠源性多克隆抗体。方法:通过PCR法扩增hMCC-N端基因片段,将其克隆至pMAL-c2x原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导重组蛋白的表达,通过Amylose树脂亲和层析纯化目的蛋白,以纯化的重组蛋白免疫小鼠,制备鼠抗hMCC-N端片段多克隆抗体,并以间接ELISA测定抗体效价,以Westernblot鉴定抗体的特异性。结果:PCR扩增得到360bp的hMCC-N端基因片段,克隆入表达载体pMAL-c2x,构建了与标签蛋白麦芽糖结合蛋白基因融合表达载体pMAL-c2x/hMCC-N,融合蛋白在大肠杆菌中得到了稳定表达,并经亲和层析,纯化出可溶性的重组蛋白,用其免疫小鼠,获取了鼠抗hMCC-N端片段的多克隆抗体,ELISA结果显示效价达1∶12800,Westernblot分析表明该抗体能特异结合hMCC。结论:成功地制备了效价高、特异性较强鼠抗hMCC-N端片段抗体,为进一步建立hMCC的ELISA检测方法打下了良好的基础。     

肠道病毒71型 VP1基因的扩增、克隆、表达及蛋白分析

目的：对肠道病毒71型 VP1基因片段进行扩增、克隆、生物信息学分析、原核表达、纯化,初步证实重组表达产物的生物学活性。方法根据 GenBank 中 EV71序列设计一对特异性引物,以 EV71患者咽拭子标本中提取病毒核糖核酸为模板, RT-PCR 扩增 EV71 VP1基因,酶切后插入表达载体 pET28a。构建 pET28a-EV71 VP1原核表达载体。转化 E．coli DH5α,IPTG诱导表达,使用 SDS-PAGE 及 Western blot 分析表达结果,利用软件对测序结果进行生物信息学分析。纯化蛋白并包被反应板,用 ELISA 分别检测 EV71阳性与 COX A16阳性患者 VP-1 IgG 抗体,进行统计学分析。结果目的基因经 BLAST 比对,同源性与 GenBank 登录号为 JQ766207．1 EV71 VP1一致性达99％。EV71 VP1蛋白相对分子质量约为32×10^3,主要以包涵体形式存在。生物信息学分析得出,EV71 VP1蛋白为亲水性蛋白,无跨膜区,不具有 N-端信号肽序列,存在三级结构。ELISA 结果显示EV71阳性患者 OD 值为（2．425±0．521）,COX A16阳性患者 OD 值为（1．205±0．314）,健康对照组 OD 值为（0．353±0．128）。EV71 VP1蛋白检测敏感性和特异性分别为84％和88％。结论成功构建了 pET28a-EV71 VP1表达载体;通过对手足口患者血清进行 ELISA 初步分析,得出目的蛋白有较高的敏感性和特异性,初步证实具有生物学活性,可进一步用于 EV71诊断及疫苗的相关研究。     

基因重组降钙素原蛋白在大肠杆菌中的克隆表达及纯化

目的构建降钙素原（PCT）基因的原核表达载体，并在大肠杆菌中进行表达，以获取高产量、低成本、高纯度的PCT蛋白。方法按人的全长PCT cDNA序列，设计引物用标准的聚合酶链反应（PCR）法全基因合成步骤合成扣除信号肽外PCT的片段，应用基因重组技术将该片段克隆到质粒pET21a（＋）中，进行限制性内切酶酶切分析和DNA测序鉴定。将重组质粒转化大肠杆菌E．coli（DH5α），经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达后，用镍-氮三乙酸（Ni-NTA）亲和层析纯化获取蛋白，用十二烷基硫酸-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和免疫印迹（Western blot）的方法鉴定。结果扩增出的人PCT片段于原核表达载体中克隆，经酶切和核酸测序鉴定，得到正确的重组质粒pET-PCT，并在大肠杆菌中得以表达。纯化后的蛋白经考马氏亮蓝染色呈单一条带；用抗PCT的抗体进行Western blot分析证明目的蛋白有反应性。结论本研究成功构建了表达基因重组人PCT的原核表达载体，基因重组人PCT蛋白在大肠杆菌中获得了表达和纯化，为进一步获取高纯度、高效价的单克隆抗体和开展临床检测提供了必要的条件。     

肝素结合血凝素蛋白在结核病诊断中的应用研究

目的制备天然和重组肝素结合血凝素（HBHA）蛋白,探讨其在结核杆菌感染诊断中的应用价值。方法用聚合酶链反应从结核分枝杆菌H37Rv基因组扩增出HBHA基因片段。结核分枝杆菌HBHA基因克隆至PQE80L克隆表达载体中,序列测定正确后,将其转化到大肠埃希菌BL-21中,再经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导表达HBHA蛋白,表达蛋白经SDS-PAGE及免疫印迹法分析后,亲和层析法纯化蛋白,并以此免疫新西兰兔制备多克隆抗体。同时将7H9液体培养基中的卡介苗（BCG）培养至稳定生长期,用CL-6B层析柱分离纯化HBHA蛋白。观察抗体对不同浓度天然HBHA和重组HBHA诱导BCG聚集效应的影响。结果所得天然和重组HBHA蛋白均有诱导BCG聚集的作用,并均可被多克隆抗体抑制。结论成功获得天然HBHA和重组HBHA蛋白;证实了两者均具有促进BCG聚集的功能,并可被由重组HBHA诱导产生的多克隆抗体所抑制。从而为进一步研究HBHA的临床诊断价值提供了实验依据。