肠道病毒71型VP1蛋白原核表达及初步鉴定

目的采用分子克隆技术,构建肠道病毒71型(EV71)VP1全长基因大肠杆菌原核系统表达载体,诱导重组VP1融合蛋白表达。方法自EV71感染患者血清中提取病毒总RNA,进行一步法RT-PCR,扩增编码VP1蛋白的全长基因片段(891 bp),以pET32(a)为表达载体,构建重组表达质粒pET32(a)-VP1,转化E.coli.Rosseta感受态细胞,获得重组工程菌株。经诱导培养,SDS-PAGE电泳,免疫印迹鉴定表达产物。结果获得了含重组表达质粒pET32(a)-VP1的正相阳性工程菌株,经IPTG诱导能高效表达VP1融合蛋白。结论重组工程菌可表达VP1融合蛋白,对研究EV71发病机制及疫苗研制具有重要意义。     

穿膜肽-TDRGl重组蛋白原核表达载体的构建

构建穿膜肽TAT与TDRG1融合蛋白的原核表达载体。以p YD5-TDRG1载体为模板,设计N端和C端含有flag序列和不同酶切位点的引物,利用PCR技术扩增TDRG1基因片段。同时利用内切酶对已构建好的载体pET28aTAT-EGFP和pET28a-EGFP-TAT进行酶切处理,再把扩增产物插入已处理好的线性载体pET28a(含有TAT)中,构建成重组质粒pET28a-TAT-TDRG1和pET28a-TDRG1-TAT,热激转化到E.coli感受态细胞TOP10中,菌检PCR筛选,送测序比对验证。PCR扩增出TDRG1基因片段,目的插入片段长约344bp,产物行限制性内切酶酶切后连接到预先酶切处理好的线性载体pET28a上,并成功转化到E.coli感受态细胞TOP10中,菌检PCR筛选后挑选阳性克隆抽质粒送测序,测序比对序列完全一致。成功构建了原核表达载体pET28a-TAT-TDRG1和pET28a-TDRG1-TAT。     

重组人载脂蛋白A5原核表达载体的构建及分析鉴定

目的构建重组人载脂蛋白A5(apoA5)原核表达载体,为进一步制备抗apoA5的单/多克隆抗体奠定基础。方法从人肝癌组织中抽提总RNA,以此为模板,逆转录降度PCR扩增载脂蛋白A5编码区基因全长,构建含有目的片段的克隆载体pPCR-ScriptampSK(+)-apoA5及原核表达载体pET16B-apoA5,通过酶切、测序及诱导表达等验证重组质粒的准确性。结果PCR扩增出1.1kb特异性片段,克隆至pPCR-ScriptampSK(+)后测序,结果表明序列同源性与genebank报道一致,重组质粒pET16B-apoA5经双酶切后电泳显示约为5.7kb和1.1kb的片段,酶切图谱与预期一致,诱导表达蛋白的大小与预期一致。结论成功构建了重组人载脂蛋白A5的原核表达载体。     

EB病毒BMRF1基因原核表达载体的构建

目的克隆EB病毒早期蛋白P54的编码基因BMRF1，构建原核表达载体，为相应蛋白的表达和应用奠定基础。方法以含EB病毒的B95-8细胞培养上清为模板，PER扩增出BMRF1基因。PER产物经BamH I和Xho I双酶切后克隆至原核表达载体pGEX-5T，用双酶切和DNA测序鉴定重组质粒。结果PER扩增的特异性片段长度为1233bp，以此构建的重组质粒pGEX-5T-BMRF1双酶切的片段大小与预期符合，重组克隆外源基因的测序结果与GenBank中的EB病毒BMRF1基因eDNA序列一致。结论成功构建了pGEX-5T-BMRF1原核表达载体。     

构建Loa22基因去信号肽片段原核重组表达载体

目的：构建赖型钩端螺旋体OmpA膜蛋白Loa22基因去信号肽片段的原核表达载体，并对其进行克隆表达。方法：实验于2004—12／2005—12在四川大学华西医学中心感染免疫研究室完成。以赖型钩端螺旋体017株基因组DNA为模板，PCR扩增Loa22基因去信号肽片段，亚克隆至原核表达载体pGEX-4T-1，经双酶切、PCR鉴定，筛选出阳性重组质粒克隆。经DNA测序正确后，转化大肠杆菌，利用IPTG进行诱导表达，通过SDS—PAGE鉴定表达产物。结果：PCR获得长516bp的片段。Loa22基因去信号肽片段与pGEX-4T-1的重组质粒构建成功。重组质粒经IPTG诱导后能在大肠杆菌中表达Mr45000的融合蛋白。结论：制备了Loa22基因去信号肽片段原核重组表达载体，为钩体新型疫苗的研究奠定基础。     

弓形虫次黄嘌呤-黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因的克隆与原核表达

目的 克隆弓形虫RH株次黄嘌呤-黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HXGPRT）基因，构建原核表达载体，并表达该重组蛋白。方法 收集、纯化弓形虫RH株速殖子，提取总RNA，在设计合成的引物中引入BamHI和XhoⅠ酶切位点。应用RT-PCR扩增弓形虫HXGPRT基因片段，插入克隆载体pMD18-T，提取重组质粒，双酶切获得目的基因，插入原核表达质粒pET28a，重组子双酶切、PCR和测序鉴定，转化大肠杆菌BL21并以IPTG诱导表达。结果 从弓形虫RH株cD-NA中扩增出693bp的HXGPRT基因片段；含pET28a／HXGPRT的宿主菌经诱导后，获得与预期分子量相符的表达产物，Western blotting提示重组蛋白能够被弓形虫患者血清中的IgG抗体识别，获得纯化的重组蛋白。结论 成功地从弓形虫RH株基因组DNA中获取HXGPRT基因，构建pET28a／HXGPRT重组质粒，并高效表达．为进一步研究提供了条件。     

弓形虫表面抗原SAG1基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的 体外扩增弓形虫RH株膜表面抗原SAG1编码基因，构建原核表达质粒，并表达SAG1编码基因序列。方法 收集、纯化RH株速殖子，提取RNA，据已知的SAG1基因序列，在设计合成的1对引物中引入EcoRI和HindⅢ酶切位点。应用RT—PCR技术，扩增SAG1基因片段，插入原核表达质粒pET28a中，转化大肠杆菌BL21感受态细胞，重组子经EcoRI和HindⅢ双酶切、PCR鉴定，转化宿主菌BL21，并以IPTG诱导表达。结果 从弓形虫RH株RNA中扩增出1011bp的SAG1基因片段，构建重组质粒pET28a／SAG1，酶切和PCR鉴定产物大小均与预期值相符；IPTG诱导，SDS—PAGE显示表达产物的大小约34．8kD．结论 成功地从弓形虫RH株RNA中获取SAG1基因，构建了pET28a／SAG1重组质粒并获得了高效表达，为免疫学诊断和蛋白质疫苗的研究创造了条件。     

抑癌基因TCF21重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的：利用大肠杆菌BJ5183细菌内同源重组法构建重组腺病毒pAd-TCF21载体。方法设计TCF21cDNA 扩增引物,从真核表达载体pCMV-SPORT6.1-TCF21中扩增TCF21的DNA序列,与腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV进行连接,构成穿梭质粒pAdTrack-TCF21;然后再用经PmeI酶线性化的pAdTrack-TCF21转化含pAdeasy-1的超感受态AdBJ5183,采用细菌内同源重组法构建腺病毒质粒pAd-TCF21;筛选同源重组质粒阳性克隆,提取pAd-TCF21质粒经PacI酶切鉴定和PCR鉴定。结果线性化的pAdTrack-TCF21转化含pAdeasy-1的超感受态AdBJ5183,12~20h后获得了40%阳性重组质粒克隆,经酶切获得＞23kb的大片段和3.0 kb的特征性片段,PCR反应扩增出了540bp的片段,证明重组腺病毒质粒中已成功插入目的基因TCF21。结论细菌内同源重组法成功构建了含TCF21基因的重组腺病毒质粒,为下一步腺病毒介导的TCF21转染A549细胞的研究打下基础。     

肺表面活性物质相关蛋白C原核表达载体的构建、表达及纯化

背景:研究表明肺表面活性物质蛋白基因缺陷导致肺表面活性物质蛋白的结构发生变化。早期检测肺表面活性物质的含量对于预测肺部疾病的发生意义重大。目的:克隆人肺表面活性物质相关蛋白C(surfactant associated protein C,SP-C)基因,构建原核表达载体PET-28a/SP-C,并纯化SP-C蛋白。方法:提取正常人肺组织总RNA,RT-PCR技术获得SP-C cDNA序列,纯化后的SP-C基因插入至中间载体PMD-18T,得到重组质粒PMD-18T-SP-C,重组质粒经过Bam HⅠ和HindⅢ双酶切后纯化回收得到具有黏性末端的SP-C cDNA,将质粒PET-28a同样经过双酶切后纯化回收得到与SP-C cDNA具有相同黏性末端的质粒片段,将具有黏性末端的SP-C cDNA与PET-28a定向连接后得到重组质粒PET-28a/SP-C。然后将鉴定正确的PET-28a/SP-C重组质粒转入BL21中诱导表达。结果与结论:酶切鉴定及核苷酸序列测序证实扩增的SP-C cDNA及其重组质粒经过Bam HⅠ和HindⅢ双酶切鉴定后,在5000～7500bp和250～1000bp处可检测到2条条带。核苷酸序列测序结果证实,质粒中插入基因长597bp,为一开放阅读框架,与GeneBank中公布的人SP-C cDNA序列相符。Western-blot检测结果显示,纯化后的SP-C蛋白在相对分子质量约27000处出现1条新生条带,与预期的大小一致。结果证实,实验成功克隆人SP-C基因并插入至质粒PET-28a中,构建了PET-28a/SP-C重组质粒,将其体外转化至BL21后可以表达SP-C蛋白。     

人紧密连接蛋白claudin-6真核表达载体的构建

目的构建人紧密连接蛋白claudin-6的cDNA真核表达载体。方法应用RT-PCR、T-A克隆、限制性内切酶切及亚克隆等技术将claudin-6基因全长克隆入真核表达载体pcDNA3.1（＋）质粒中。结果酶切鉴定、PCR扩增以及序列分析表明已经将claudin-6基因全长序列克隆入真核表达载体pcDNA3.1（＋）质粒中。结论获得了人claudin-6基因的全长cDNA片段,构建了claudin-6原核克隆载体和真核表达载体。实验中发现,中国人claudin-6基因的461位点碱基为A,而GeneBank中西班牙人claudin-6基因的461位点碱基为G,说明claudin-6基因461位点可能存在多态性。     

人YPEL5基因真核表达载体的构建及在食管癌细胞中的表达

目的构建人YPEL5基因真核表达重组质粒并在食管癌细胞EC9706中表达。方法以人正常组织的cDNA为模板,扩增得到长366bp的YPEL5基因编码序列,将此序列插入到真核表达载体pCDHCD513B的多克隆位点区域中,得到真核表达载体pCDH-CD513B-Flag-YPEL5,经菌落聚合酶链反应(PCR)鉴定后送公司测序。将构建成功的重组质粒转染到人食管癌细胞系EC9706中,利用实时荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹(Western Blot)检测YPEL5基因的表达情况。结果成功扩增出YPEL5基因片段,大小为366bp,经双酶切、连接、转化和筛选得到pCDH-CD513B-Flag-YPEL5重组质粒,通过基因测序鉴定显示重组质粒中插入的基因序列与GenBank中的序列一致,转染EC9706细胞2d后,荧光定量PCR和Western Blot显示YPEL5基因的表达明显上调。结论成功构建了pCDH-CD513B-Flag-YPEL5真核表达载体并在食管癌细胞株EC9706中得到表达,从而为进一步研究其在食管癌进展中的功能奠定了基础。     

烟曲霉硫氧还蛋白还原酶重组蛋白的原核表达及抗原性分析

摘要：目的：克隆烟曲霉硫氧还蛋白还原酶（thioredoxin reductase,TR）基因并构建原核表达载体,获得烟曲霉TR重组蛋白,并鉴定其抗原性。 方法：用RT-PCR方法从烟曲霉总RNA中扩增出TR cDNA片段,克隆至pMD18-T载体,并转化E.coli JM109。经序列分析证实后,提取重组克隆质粒双酶切获得目的基因,与表达载体pET28a(+)连接,转化E.coli BL21（DE3）,筛选重组表达质粒。用异丙基硫代β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导重组融合蛋白表达,用SDS-PAGE及免疫印迹法分析重组蛋白质,并用亲和层析柱进行纯化。 结果：构建了含TR全长基因的重组表达质粒,IPTG诱导后可高效表达。免疫印迹结果表明该重组蛋白质可被侵袭性曲霉病患者血清识别。 结论：成功构建了重组表达质粒pET28a(+)/TR,并在大肠埃希菌中获得了高效表达,重组蛋白质具有良好的抗原性,为进一步研究奠定了基础。     

人血小板衍生生长因子B在大肠杆菌中的表达及对骨组织修复的影响

目的:为研究人血小板衍生生长因子BB(PDGF-BB)在大肠杆菌中的表达及其在治疗骨折愈合、骨质疏松等疾病中的作用,克隆了PDGF-B的成熟肽基因并进行了序列分析。方法:从脐静脉内皮细胞提取总RNA,经反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出包含全长编码人PDGF-B基因cDNA,再以此为模板,用特异引物进行PCR扩增出PDGF-B成熟肽基因;将目的基因连接到载体pGEM-T上,进行序列测定。之后将此片段克隆到表达载体pQE30,构建成表达质粒pQE30-PDGFB。结果:重组质粒经酶切及PCR鉴定,证实PDGF-B成熟肽基因克隆成功,序列正确。结论:PDGFB基因的成功克隆和原核表达载体的构建,为促进骨修复功能研究及基因工程生产奠定了基础。     

基因重组降钙素原蛋白在大肠杆菌中的克隆表达及纯化

目的构建降钙素原（PCT）基因的原核表达载体，并在大肠杆菌中进行表达，以获取高产量、低成本、高纯度的PCT蛋白。方法按人的全长PCT cDNA序列，设计引物用标准的聚合酶链反应（PCR）法全基因合成步骤合成扣除信号肽外PCT的片段，应用基因重组技术将该片段克隆到质粒pET21a（＋）中，进行限制性内切酶酶切分析和DNA测序鉴定。将重组质粒转化大肠杆菌E．coli（DH5α），经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达后，用镍-氮三乙酸（Ni-NTA）亲和层析纯化获取蛋白，用十二烷基硫酸-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和免疫印迹（Western blot）的方法鉴定。结果扩增出的人PCT片段于原核表达载体中克隆，经酶切和核酸测序鉴定，得到正确的重组质粒pET-PCT，并在大肠杆菌中得以表达。纯化后的蛋白经考马氏亮蓝染色呈单一条带；用抗PCT的抗体进行Western blot分析证明目的蛋白有反应性。结论本研究成功构建了表达基因重组人PCT的原核表达载体，基因重组人PCT蛋白在大肠杆菌中获得了表达和纯化，为进一步获取高纯度、高效价的单克隆抗体和开展临床检测提供了必要的条件。     

基于人脂肪组织获取基因构建pET28a-leptin（瘦素）重组子

背景：新近的一些研究认为,采用体外重组瘦素替代疗法对遗传性肥胖、难愈性创面和内源性瘦素缺乏应是行之有效的方法。目的：取人脂肪组织获取瘦素基因,构建pET28a-leptin重组子。设计、时间及地点：单一样本观察,实验于2004—06/00712在江西省医学科学研究所抗肿瘤室完成。材料：取自22岁汉族女性行重睑手术时皮下脂肪组织,冻存于液氮中备用,供者知情同意。方法：取人脂肪组织,反转录一聚合酶链反应得到瘦素基因后,通过DNA重组技术克隆至pMDl8T载体与pET28a原核表达载体,EcoRI＋XhoI双酶切及测序鉴定。主要观察指标：①cDNA扩增结果。②重组质粒鉴定。③DNA测序结果。结果：扩增得到520bp目的基因;所构建重组瘦素原核表达载体pET28a-leptin经双酶切电泳见520bp目的条带,DNA测序与相应基因序列同源性达100％。结论：通过DNA重组至pET28a原核表达载体,经EcoRI＋XhoI双酶切及测序鉴定成功构建pET28a．1eptin重组子。     

人胰激肽释放酶基因的克隆及表达载体的构建

目的 :克隆中国人胰组织激肽释放酶基因 ,构建原核、真核表达载体 ,为开发生产人源激肽释放酶基因工程产品及人源激肽释放酶基因药物奠定基础。方法 :提取人胰腺组织总RNA ,逆转录后琼脂糖电泳初步鉴定PCR产物。将激肽释放酶cDNA回收、补平后插入克隆质粒KS ,酶切鉴定后 ,对激肽释放酶基因进行序列测定分析。用双酶切法 ,插入原核表达载体PET 2 8b ,真核表达载体pBacPAK9质粒中。酶切鉴定后 ,进行序列测定分析。结果 :本实验克隆的激肽释放酶基因与GenBank报告的激肽释放酶基因相比 ,碱基序列相同。测序分析表明人胰组织激肽释放酶基因经酶切 ,正确插入到原核表达载体PET 2 8b ,真核表达载体pBacPAK9质粒中。结论 :克隆并构建成功中国人组织激肽释放酶基因的原核、真核表达载体 ,可用于基因工程产品及基因药物的深入研究工作     

hVPS4A 基因克隆及真核表达载体的构建

目的：克隆人细胞空泡蛋白分选因子4A（human vacuolar protein sorting 4A,hVPS4A）基因,构建其真核表达质粒。方法以 Huh7细胞 cDNA 为模板,设计引物扩增全长 hVPS4A 基因,再将目的基因插入到真核载体 pRK5中。重组质粒经PCR、酶切和 DNA 测序确认。结果从 Huh7细胞 cDNA 中扩增得到约1350 bp 大小的目的片段,经回收、纯化、酶切后与载体pRK5连接,转化 DH5α大肠杆菌。选择 PCR 鉴定阳性的重组质粒,经 EcoRⅠ单酶切可见约一条5900 bp 片段;经 EcoRⅠ和HindⅢ双酶切可得到4600 bp 和1350 bp 两个片段,分别与载体 pRK5和目的片段 hVPS4A 预期大小一致;DNA 测序结果显示插入片段与 hVPS4A 参考序列一致。结论成功构建了含 hVPS4A 基因的真核表达载体,为进一步研究 hVPS4A 的生物学功能提供了条件。     

结核分枝杆菌ESAT6基因克隆与表达质粒构建

目的 克隆结核分枝杆菌(MTB)分泌蛋白ESAT6基因，并构建重组表达质粒。方法 根据Genbank中ESAT6基因序列，针对其编码区合成引物，采用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA中扩增出ESAT6基因，并连接到T载体，然后定向克隆到原核表达质粒pGEX-4T-2，阳性克隆用酶切和DNA测序鉴定。结果 经双内切酶消化所切下的片段，大小与预计相符；测序结果证实基因序列正确，符合表达框架。结论 成功构建了重组原核表达质粒pGEX-ESAT6。     

HPV16型E5基因重组逆转录病毒表达载体pLEGFP-E5的构建与鉴定

目的构建HPV16型E5基因重组逆转录病毒表达载体。方法根据HPV16型E5基因已知序列,用PCR方法扩增E5片段,利用逆转录病毒载体pLEGFP-N1构建重组质粒pLEGFP-E5。酶切电泳验证重组质粒pLEGFP-E5后,利用脂质体将重组质粒pLEGFP-E5转染入包装细胞PA317。收集PA317病毒上清转染NIH3T3细胞。结果 PCR结果显示扩增片断大小约252bp,与预期相同。重组质粒酶切后显示其大小约7300bp。pLEGFP-E5成功转染检测细胞。结论重组逆转录病毒表达载体pLEGFP-E5基因构建成功,能有效感染靶细胞。     

增强型绿色荧光蛋白RNAi表达载体的构建和鉴定

目的构建靶向增强型绿色荧光蛋白基因（EGFP）的RNA干扰质粒载体。方法设计并合成针对EGFP编码区的模板寡核苷酸单链,克隆入pSilencerTM 3.1-H1 neo载体中,对重组质粒进行酶切鉴定和DNA序列测定。结果重组质粒经限制性内切酶酶切得到66 bp和4.3 kb条带;重组阳性克隆测序结果与实验设计的模板寡核苷酸序列相符。结论成功构建靶向EGFP的RNA干扰表达载体,为RNA干扰技术在实验室的进一步开展奠定基础。