C57-ras癌症转基因小鼠模型冷冻保种技术研究

目的 建立C57-ras癌症转基因小鼠模型的冷冻保种技术。 方法 通过直接收集体内发育的2-细胞胚或者通过体外受精方法获得2-细胞胚,采用玻璃化冷冻法冷冻、复苏、移植,后代经PCR检测。结果 冷冻体内发育至2细胞期胚胎90枚,解冻后的复苏率是67.78%?.08,移植产仔率是21.31%?.09,后代的阳性率是23.08%?.14;冷冻体外受精的2细胞期胚胎203枚,解冻复苏60枚,复苏率是63.33%?.03,移植产仔率是15.56%?.04,后代的阳性率是33.33%。 结论 两种胚胎冷冻途径均获得了C57-ras癌症转基因动物模型阳性小鼠,建立了该模型动物的低温保存方法。     

HBV—C转基因小鼠快速胚胎冷冻方法的建立

目的 建立用于转基因小鼠种质保存的快速胚胎冷冻方法。方法 用乙二醇作为抗冻保护剂,对携带HBV—C基因的转基因小鼠模型进行了玻璃化胚胎冷冻保存的研究。结果 发现含体积分数30％乙二醇的冷冻液可达到最佳的冷冻效果,有81．54％的冷冻胚胎在体外可进一步发育,其中69．81％达到孵化阶段,比较不同发育阶段的胚胎的冷冻效果发现,致密桑椹胚解冻后的孵化率显著高于囊胚。不同的装管方法对胚胎的回改率也有影响,五段法的胚胎回收率显著高于二段法。将解冻后形态正常的胚胎82枚移植给8只假孕母鼠,5只怀孕,怀孕率为62．5％,产下28只小鼠,产仔率为54．9％。结论 一步法玻璃化冷冻方法可用于转基因小鼠的种质保存。     

胚胎冷冻技术应用于抗菌肽转基因小鼠的保种传代

目的研究胚胎冷冻在抗菌肽转基因FVB小鼠保种传代中的应用。方法对6~8周正常雌性FVB小鼠进行超排分别与雄性杂合子抗菌肽转基因FVB小鼠交配，收集2-cell胚胎，进行胚胎冷冻。1周后进行胚胎复苏移植，通过PCR方法对仔代鉴定。结果冻存胚胎140枚，复苏获得存活胚胎98枚，移植85枚，产仔38只，获得阳性后代12只。结论通过胚胎冷冻技术保种及复苏移植技术可对抗菌肽转基因小鼠进行传代。     

HBV转基因小鼠胚胎玻璃化冷冻保存研究

目的研究OPS法对不同基因型的HBV转基因小鼠胚胎玻璃化冷冻的效果，为建立转基因小鼠胚胎库奠定基础。方法采用乙二醇作为冷冻保护剂，以野生型P21^ / 小鼠为对照，用OPS法对P21^HBsAg／HBsAg及P21^HBx/HBx两种HBV转基因小鼠3．5d的胚胎进行玻璃化冷冻，并比较不同基因型小鼠的超数排卵数，胚胎的复苏率及发育率。结果P21^ / 、P21^HBsAg／HBsAg及P21^HBx/HBx小鼠平均超排数分别为27．89、15．56、9．14枚；复苏率分别为88．7％、81．1％、80．3％；发育率分别为82．6％、79．4％、56．6％。结果表明HBV转基因小鼠的超排数明显低于野生型小鼠的超排数，解冻后三种小鼠的胚胎复苏率之间无显著差别，而解冻后发育率，P21^HBx／HBx小鼠要明显低于其它两种小鼠。结论超排数、胚胎复苏率及解冻后发育率受小鼠的基因型影响。     

实施ICSI后对复苏胚胎的妊娠结局

目的 讨论卵泡浆内单精子注射(intracytoplasmic sperm injection ICSI)与常规体外受精(in vitro fetrilizationⅣF)受精方式对冷冻胚胎的解冻和移植后对临床妊娠的影响.方法 慢速冷冻IVF或ICSI周期中剩余的优质胚胎,随后用快速融解法复苏后进行移植.观察各组胚胎冷冻解冻后的胚胎存活率及相关指标和临床妊娠率.结果 50例患者中,IVF组为30个周期,妊娠4例,妊娠率为13.33%,ICSI组为20个周期,妊娠5例,妊娠率为25%,ICSI组冷冻胚胎优胚率、复苏后胚胎存活率、存活胚胎累积细胞数与复苏胚胎的累积细胞数百分比(累积细胞存活率)和存活胚胎累积评分与复苏细胞累积评分的百分比(累积评分率)有显著差异.结论 冷冻胚胎的优胚率及复苏后获得高质量的胚胎是影响解冻胚胎移植的临床妊娠率重要因素.     

实施ICSI后对复苏胚胎的妊娠结局

目的 讨论卵泡浆内单精子注射(intracytoplasmic sperm injection ICSI)与常规体外受精(in vitro fetrilizationⅣF)受精方式对冷冻胚胎的解冻和移植后对临床妊娠的影响.方法 慢速冷冻IVF或ICSI周期中剩余的优质胚胎,随后用快速融解法复苏后进行移植.观察各组胚胎冷冻解冻后的胚胎存活率及相关指标和临床妊娠率.结果 50例患者中,IVF组为30个周期,妊娠4例,妊娠率为13.33%,ICSI组为20个周期,妊娠5例,妊娠率为25%,ICSI组冷冻胚胎优胚率、复苏后胚胎存活率、存活胚胎累积细胞数与复苏胚胎的累积细胞数百分比(累积细胞存活率)和存活胚胎累积评分与复苏细胞累积评分的百分比(累积评分率)有显著差异.结论 冷冻胚胎的优胚率及复苏后获得高质量的胚胎是影响解冻胚胎移植的临床妊娠率重要因素.     

不同时期和不同来源鼠胚玻璃化冷冻效果的比较

目的：比较不同时期、不同来源的鼠胚玻璃化冷冻的存活率以及发育为囊胚的成功率。方法：采用体外受精和体内受精的方式得到小鼠的2、4、8细胞期胚胎,对其进行玻璃化冷冻、解冻,观察胚胎的存活与囊胚形成,以未冷冻的胚胎作为对照组。结果：由体外受精和体内受精获得的2细胞期胚胎在冷冻复苏后的存活率分别为70.67%、72.06%,囊胚形成率分别为65.33%、67.62%;4细胞期胚胎冷冻复苏后的存活率分别为88%、89.71%,囊胚形成率分别为81.33%、83.82%;8细胞期胚胎冷冻复苏后的存活率分别为93.33%、94.12%,囊胚形成率分别为92%、94.12%。和对照组相比,2细胞和4细胞期胚胎冷冻复苏后囊胚形成率差异有统计学意义（P＜0.05）,而8细胞期的胚胎差异无统计学意义（P>0.05）。不同时期胚胎冷冻复苏后囊胚形成率间差异有统计学意义（P＜0.05）,受精方式对处于同一时期的胚胎在冷冻复苏后存活率和囊胚形成率均无明显影响。 结论：玻璃化冷冻可以作为小鼠胚胎保存的有效方法,相对2、4细胞期胚胎,冷冻效果最好的是8细胞期胚胎。     

不同胚胎冷冻方法对人类早期胚胎解冻后的复苏效果及临床结局的影响

目的 比较玻璃化冷冻与程序化冷冻对人类早期胚胎解冻后复苏效果及临床结局的影响.方法 辅助生殖技术获取的剩余可利用人类胚胎2 884枚,其中采用玻璃化冷冻复苏666个周期,解冻胚胎1 516枚、复苏1 383枚、移植胚胎1 375枚;程序化冷冻复苏506个周期,解冻胚胎1 368枚、复苏1 090枚、移植1 077枚.比较两种方法的复苏效果及临床结局.结果 玻璃化冷冻组胚胎复苏率、胚胎完整率分别为92.02％、92.11％,高于程序化冷冻组的79.68％、69.63％(P＜0.05);两组种植率、临床妊娠率、周期取消率、多胎妊娠率、早期流产率、新生儿胎龄、早产率、新生儿出生体重、出生缺陷率比较,差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 玻璃化冷冻较程序化冷冻有更高的胚胎复苏率及胚胎完整率,胚胎利用率高,两种冷冻方法的临床结局相似,适用于人类胚胎的冷冻.     

小鼠体外受精及其胚胎体外培养的比较研究

目的 通过比较不同品系小鼠体外受精情况以及不同培养液对C57BL/6J小鼠胚胎体外培养效果的实验,进一步完善小鼠体外受精和早期胚胎体外培养体系.方法 对C57BL/6J、DBA/2、FVB/NJ、BALB/c、KM、ICR及BARR Ⅱ小鼠进行超排和体外受精,并对C57BL/6J小鼠体外受精后的2-细胞胚胎用HTF、CZB、KSOM、M16、HECM五种培养液在相同条件下进行体外培养到囊胚,计算4-细胞～囊胚的发育率.结果 各品系小鼠平均排卵数为13.0～38.7个(P＜0.01),体外受精率为70.2%～92.8%(P＜0.05).不同培养液至4-细胞的发育率为60.3%～95.8%,其中KSOM的4-细胞发育率为95.8%,最适合2-细胞向4-细胞的发育.8-细胞发育率为52.8%～91.1%,桑椹胚发育率为40.6%～87.5%,囊胚发育率为5.1%～75.4%,各阶段胚胎发育率均差异显著.其中适合于金黄仓鼠桑椹胚、囊胚发育的HECM-2并不支持C57BL/6J囊胚的发育,其囊胚发育率只有5.1%,CZB最适合其囊胚的发育.结论 遗传背景是影响小鼠超排及体外受精效果的主要因素之一.葡萄糖的存在不利于克服2-细胞发育阻断,胚胎在8-细胞期以前,主要能源物质不是葡萄糖,直到桑椹胚后期,葡萄糖才是主要的能量物质.磷酸盐可引起胚胎发育阻断.氨基酸和EDTA有利于克服胚胎发育阻滞.     

小鼠胚胎单侧与双侧输卵管移植的结果比较

目的 比较小鼠胚胎移植入单侧与双侧输卵管的差异,探索最佳的胚胎移植方法.方法 选用C57BL/6J小鼠作为供体小鼠,取1.5 d胚胎即2-细胞期胚胎分别采用单侧和双侧输卵管移植入ICR假孕雌鼠,统计仔鼠出生率.结果经单侧输卵管移植和双侧输卵管移植后假孕雌鼠的妊娠率均为100％,产仔率分别为32.5％和34.7％.结论 小鼠2-细胞期胚胎经输卵管双侧移植较单侧移植的产仔率略高,但无显著差异.     

不同品系小鼠的体外受精、胚胎冷冻及移植的比较研究

目的　探讨不同品系小鼠的体外受精、胚胎和精子的低温保存效果。方法　本实验分别在中国科学院上海实验动物中心 (SLAC)和日本熊本大学动物资源开发中心 (CARD)对 13个品系小鼠 (C57BL 6J、BALB c、C3H HeJ、ICR、KM、FVB、MRL、NOD、CBA、DBA 2、CD 1、BDF1、B6C3F1)的体外受精 (IVF)率、胚胎培养及移植成绩进行了比较研究。结果　各品系小鼠新鲜精子的IVF率 15 1%～ 87 9% ,冻融精子的IVF率 8%～ 80 % ;冷冻胚胎的复苏率4 2 6 %～ 83 9% ;冻融胚胎移植后的产仔率在 17 8%～ 5 1 8%。结论　遗传背景不同的小鼠体外受精率、冷冻胚胎复苏率和胚胎移植的产仔率差异有显著性。但同一品系两个实验室间的新鲜精子的IVF率、冷冻胚胎的复苏率及移植产仔率差异无显著性 (P >0 0 5 ) ;冻融精子的体外受精率CARD明显高于SLAC(P <0 0 1)。     

利用精子冷冻、体外受精技术进行昆明小鼠育种初探

在昆明(KM)小鼠标准化研究中,采集武汉生物制品研究所、上海第一生化制药厂普通级KM小鼠的精子并冷冻运输,冻融精子与中科院上海实验动物中心KM雌鼠的超排卵体外受精(IVF)得到杂交一代2细胞胚胎,用中科院动物中心KM鼠冻融精子对照.无菌条件下2细胞胚胎移植入SPF级假孕鼠,受体饲养于独立通气笼具(IVC)中.平均产仔率为51.9%,离乳率100%.三种群12周龄KM雄鼠精子冷冻复苏率,IVF率,移植成绩均无显著差异(P>0.05).仔鼠经微生物、寄生虫学检测达SPF标准.结果表明,利用冷冻精子,通过IVF、胚胎移植能够方便快速的建立种群间杂交一代,并实现生物净化.     

人子宫内膜异位症裸鼠模型的建立及雌、孕激素受体的表达

目的　为子宫内膜异位症 (EM)的临床研究提供实验动物模型。方法　实验组 :取EM和正常育龄妇女分泌晚期子宫内膜 ,剪碎 ,随机置入裸鼠盆腹腔 ,实验Ⅰ组切除卵巢 ,实验Ⅱ组不切除卵巢 ;对照组 :同法置入人大网膜。术后给雌激素支持。各组裸鼠分别于 5、10、15、2 0、2 5、3 0d脱颈椎处死 ,观察异位病灶生长情况。免疫组化SP法检测异位病灶雌、孕激素受体表达。结果　子宫内膜种植 5d即见异位病灶牢固粘附 ,主要发生在腹壁(56% )、膀胱旁脂肪 (2 1% )等部位 ,可见腺体细胞及散在间质细胞 ,时间越长 ,病灶与裸鼠组织融合越明显 ,盆腹腔粘连越重。用EM患者和正常育龄妇女内膜移植的异位病灶无差别 ,实验Ⅰ组和实验Ⅱ组的裸鼠所形成的异位病灶亦无差别 ,它们的雌、孕激素受体表达未显示差别 ,多数呈弱表达。结论　裸鼠做为EM早期动物模型科学、简便、可行。     

C57BL/6J小鼠冻融胚胎移植后所得小鼠及其子代生物学特性数据测定与分析

目的探讨C57BL/6J(B6)小鼠冷冻复苏胚胎移植后所得小鼠及其子代的平均体增长和血液生化等部分生物学特性数据的变化。方法实验分为3组。实验组Ⅰ:冻融胚移植组,B6小鼠体外受精后的2-cell胚胎采用EFS法冷冻,复苏后移植到受体(ICR小鼠)输卵管内所产的小鼠(雄鼠30只,雌鼠20只);实验组Ⅱ:冻融胚胎移植所产的小鼠成熟后经自然交配得到的子一代(雄鼠26只,雌鼠17只);对照组:正常饲养和自然交配所得的子代(雌雄小鼠各20只)。3组小鼠饲养至16周龄,每周定时测定体质量,至16周龄时采血,测定各组小鼠血清生化值,并进行分析比较。结果实验组Ⅰ雌雄小鼠初生重和1~16周的平均体重均显著高于对照组(P0.01),实验组Ⅱ雌鼠体重从12周开始均显著高于对照组(P0.01),而雄鼠只有部分周龄与对照组有差异,其余周龄则差异无显著性;实验组Ⅰ和实验组Ⅱ小鼠的血清生化值与对照组相比除AST、TP和Ca等项目无变化外,其余项目均发生了显著或极显著的上调或下调。结论冷冻对胚胎移植所得小鼠及其自然繁殖子一代的平均体增长和血清生化值有一定影响。     

单胚胎玻璃化冷冻对小鼠胚胎体外发育的影响

目的:比较单胚胎玻璃化冷冻与慢速冷冻对小鼠分裂期胚胎损伤和体外发育的影响,探讨使用玻璃化冷冻保存大量胚胎的可行性。方法:选择8-细胞胚胎随机进行改良的玻璃化和慢速冷冻,复苏后培养至囊胚孵出,计数胚胎复苏率、卵裂球死亡率、囊胚形成率、细胞团数、孵出率,并进行组间比较分析。结果:玻璃化冷冻组复苏率、卵裂球死亡率、囊胚形成率、孵出率、细胞团数分别为100%、12.7%、75.7%、66.4%、112,慢速冷冻组分别为87.1%、31.0%、35.5%、58.7%、78,除囊胚孵出率其余各指标两组间差异均具有统计学意义。结论:单胚胎玻璃化法冻存小鼠分裂期胚胎复苏后细胞成活率高,结构完整,更好的保持了胚胎的发育潜能。     

Straw-top玻璃化与程序化冷冻小鼠8-细胞胚胎效果的比较

目的比较慢速程序化法与玻璃化法冷冻小鼠8-细胞胚胎的效果。方法将小鼠卵母细胞行体外受精后培养至8-细胞,分别采用慢速程序化法与玻璃化法进行冷冻,解冻后比较两组胚胎存活率及囊胚形成率。结果慢速程序化冷冻法解冻后的胚胎存活率为79.6%,囊胚形成率为70.7%;玻璃化冷冻法解冻后的胚胎存活率为94.9%,囊胚形成率为89.9%,胚胎存活率与囊胚形成率均显著高于前者（均P〈0.01）。结论在进行小鼠8-细胞胚胎冷冻时,玻璃化法冷冻效果较慢速程序化法效果好。     

三种不同冷冻保护剂对小鼠附睾冷冻效果的比较

目的 探讨三种不同冷冻保护剂对C57BL/6J小鼠附睾冷冻的效果。方法 性成熟并交配过的6-8周龄C57BL/6J雄鼠附睾，分别用3种不同冷冻保护剂二甲基亚砜 (DMSO)、丙二醇 (PROH)、R18S3进行玻璃化冷冻、复苏和精子采集，观察比较三个实验组的复苏精子形态、存活率以及生殖能力。结果 三组冷冻复苏分离后的精子形态完整，具有镰刀头状结构；荧光染色后PROH组精子存活率为 (88.17±3.43)%，明显高于DMSO组：(61.17±10.65)% 和R18S3组(16.83±6.49)%（P<0.05）；经辅助体外受精后均具有受精能力。获得的胚胎移植后可得到正常子代小鼠 (DMSO : PROH : R18S3 = 13 : 8 : 17）。结论 3种冷冻保护剂均适用于C57BL/6J小鼠附睾冷冻，但PROH冷冻效果较好。     

玻璃化冷冻人卵母细胞体外受精－胚胎移植9例临床分析

目的：探讨人卵母细胞玻璃化冷冻在体外受精－胚胎移植（ IVF-ET）中的应用效果。方法行IVF-ET 治疗、因取卵日男方因素无法进行受精的患者9例,对其成熟卵子进行玻璃化冷冻保存,解冻后进行卵胞浆内显微授精（ICSI）,记录卵子复苏、受精、卵裂及移植后妊娠情况。结果9例患者共解冻复苏58枚卵子,复苏率68．2％（58／85）;复苏后进行ICSI的成熟卵子中,受精40枚,形成胚胎34枚,受精率69．0％,卵裂率85．0％。7个移植周期共移植胚胎15枚,临床妊娠3例,临床妊娠率42．9％。结论人卵母细胞玻璃化冷冻可以获得一定的临床妊娠率,在IVF-ET中可作为临床治疗的选择之一。     

利用超数排卵技术进行优化C57BL/6J小鼠生物净化体系的研究

目的以近交系C57BL/6J小鼠为实验对象,通过注射不同剂量的孕马血清促性腺激素(PMSG)和人绒毛膜促进腺激素(hCG)对小鼠进行超数排卵、体外授精和胚胎移植,确定最佳超排剂量,从而完善以C57BL/6J小鼠为背景的转基因小鼠的生物净化体系。方法将5周龄的C57BL/6J雌鼠进行5 IU、10 IU、7.5 IU、15 IU四个剂量组的超数排卵,通过超数排卵与剖宫取胎、胚胎移植两种净化方法相结合,确定C57BL/6J小鼠的净化方法所需的最佳剂量。结果剖宫取胎方法中,注射5 IU剂量组的C57BL/6J小鼠超排后合笼见栓率最高,为(89.00±19.05)%,产仔数和见栓率与其它三组均差异不显著;胚胎移植方法中,10 IU剂量组平均卵母细胞数为30.33±0.89枚,平均体内2-细胞胚胎数为23.78±0.19枚,均显著高于其它三组。结论剖宫取胎法生物净化时,5 IU剂量组可以提高C57BL/6J小鼠的交配成功率;胚胎移植法生物净化时,10 IU剂量组可以获得最多的体内和体外2-细胞胚胎,为C57BL/6J小鼠最佳超排剂量。