TaqMan荧光定量逆转录-聚合酶链反应快速检测麻疹病毒核酸

目的建立以特异性荧光探针为特点的TaqMan荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法.方法检测麻疹病毒的核酸,对设计的引物与探针进行筛选与条件优化.结果 Tag Man荧光定量RT-PCR方法具有对麻疹病毒核酸检测的高度特异性与准确性,检测的敏感度可达0.1TCID50,从病毒核酸提取至检测完成仅需3个多小时,操作简便,而且大大减少了常规PCR扩增产物的污染机会.结论采用Tag Man荧光定量RT-PCR方法对麻疹病毒与相关的临床样本进行了检测,均获得了满意的结果,为麻疹病毒的分子生物学检测,提供了一种新方法.     

麻疹病毒荧光定量RT-PCR反应体系的建立

目的:建立一种快速、敏感、特异性高的麻疹病毒核酸检测方法,以便对早期麻疹病毒感染做出准确及时的临床诊断.方法:采用TaqMan特异性荧光标记探针标记的RT-PCR技术对40例临床疑似麻疹患者的咽拭子进行麻疹病毒核酸的检测,同时对其血清用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测麻疹特异性抗体IgM.结果:40份患者咽拭子RT-PCR检测均阳性,40位患者入院第2天血清ELISA法检测,麻疹特异性抗体IgM阳性28例,阴性12例,1周后对12例麻疹特异性抗体IgM阴性的患者再次检测,结果12例全阳性.结论:荧光定量RT-PCR检测麻疹病毒方法有较好的敏感性和特异性,与血清麻疹特异性抗体IgM检测方法相比,荧光定量RT-PCR法在临床症状出现后就能检测到,同时不受标本量的限制,在短时间内就可完成检测,更适合作麻疹早期诊断的实验室检查依据.     

实时定量RT-PCR法检测咽拭子中麻疹病毒核酸

目的应用实时定量RT-PCR方法检测咽拭子中麻疹病毒核酸。方法荧光定量real-timeRT-PCR方法检测麻疹病毒核酸;酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测麻疹特异性IgM抗体。结果荧光定量RT-PCR方法在咽拭子中检测麻疹病毒核酸的结果是准确的。结论荧光定量RT-PCR方法是一种快速、简便检测麻疹病毒核酸的方法 ,适用于麻疹病毒的早期诊断。     

荧光定量逆转录-聚合酶链反应方法快速检测甲1型流行性感冒病毒核酸

目的建立特异、快速、敏感的TaqMan荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法,用于检测甲1型流行性感冒(流感)病毒核酸.方法在甲1型流感病毒血凝素基因的保守区设计引物和TaqMan探针,对其进行筛选,同时对荧光定量RT-PCR反应条件和反应体系进行优化,验证该方法的特异性、敏感性、重复性,并对疑似流感患者含漱液标本进行检测.结果该方法对甲1型流感病毒的检测具有高度的特异性,对甲3型流感病毒、乙型流感病毒、禽流感病毒H5、严重急性呼吸道综合征病毒、麻疹病毒及其它呼吸道病毒均无交叉反应,检测的灵敏度达0.1TCID50.采用该方法从临床疑似患者含漱液中对甲1型流感病毒核酸的检出,比采用狗肾传代细胞进行病毒分离更为敏感.从病毒核酸提取至检测完成仅需3h左右,操作简便,重复性好,且大大减少了常规RT-PCR检测产物的污染机会.结论新建立的TaqMan荧光定量RT-PCR是一种快速检测甲1型流感病毒的特异、敏感的方法,非常适合于疑似流感爆发疫情的应急诊断和鉴别诊断.     

荧光定量-聚合酶链反应法快速检测麻疹病毒核酸

目的：采用荧光定量一聚合酶链反应（FQ-PCR）法，检测麻疹病毒核酸，用以建立和推广一种敏感、特异、快速的麻疹检测新技术。方法：TaqMan特异性荧光标记探针法，进行特异性、敏感性和麻疹疑似患者临床标本的检测。结果：FQ-PCR法检测麻疹病毒核酸具有高度的特异性和敏感性，本次试验检测灵敏度达0．1TCID砷。在14份麻疹患者咽拭子标本中，有13份标本检出麻疹病毒核酸，从核酸提取至完成检测仅需3h。结论：FQ-PCR法为麻疹病毒核酸检测提供了一种可靠的方法。     

A群轮状病毒TaqMan RT-PCR检测方法的建立

摘要:目的　建立以特异性荧光探针为特点的Taqman荧光定量RT-PCR方法,对轮状病毒A群核酸进行检测。方法　根据轮状病毒A群基因组保守序列设计引物和探针,建立并分析TaqMan RT-PCR的重复性、特异性、敏感性;以所建立的方法对128例病毒性腹泻患者粪便标本进行检测,同时以基因测序进行验证。结果　所建立的TaqMan RT-PCR检测方法对轮状病毒A群具有很好的特异性和重复性,灵敏度达到101拷贝/μl。128例粪便标本中,轮状病毒A群的检出率为18.0%,与基因测序比对结果相符。结论　构建的轮状病毒A群TaqMan RT-PCR检测方法快速、特异且灵敏,可用于临床病原诊断和流行病学调查。     

流行性腮腺炎病毒荧光定量逆转录-聚合酶链反应快速检测方法的建立

目的建立以TaqMan-MGB荧光探针为特点的荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR),用于检测流行性腮腺炎(腮腺炎)病毒(MuV)核酸。方法针对MuV血凝素(H)基因保守区域设计特异性引物与TaqMan-MGB荧光探针,筛选并优化荧光定量RT-PCR反应体系与反应条件,用以提高方法的特异性、灵敏度与准确性;并通过体外克隆技术建立MuV基因拷贝数定量分析模型。结果引物与探针的优化浓度分别为880mmol/L和280mmol/L,具有良好的保守性和特异性,与其它呼吸道病毒均无交叉反应;方法检测灵敏度为10拷贝/反应,相当于0.01TCID50,标准曲线线性范围为107~10拷贝/反应;从病毒核酸提取至检测完成仅需3h左右,操作简便,重现性好。结论TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR方法特异、敏感、快速,为MuV的早期快速检测提供了一种新的检测技术。     

一步法流行性乙型脑炎病毒TaqMan荧光定量反转录聚合酶链反应方法的建立及应用

目的 建立一种特异、灵敏、快速检测流行性乙型脑炎(乙脑)病毒的荧光定鼍RT-PCR方法.方法 根据GenBank登录的乙脑病毒毒株序列,应用生物软件在乙脑病毒基因的保守区设计与筛选引物和探针,对荧光定量RT-PCR反应体系与条件进行优化,验证方法的特异性、敏感性和重复性.并通过对蚊虫样本的检测,以评价该方法的实际应用价值.结果 优化结果表明荧光定量RT-PCR的最佳反应体系为0.1 μmol/L探针浓度,0.2μmol/L引物浓度,5 mmol/L Mg2+浓度.结果 表明该方法对乙脑病毒的检测有高度的特异性、通用性,对1～4型登革热病毒、狂犬病毒、汉坦病毒(SEO型与HTN型)均无交叉反应,检测的灵敏度达0.1 TCID50,重复性分析表明同一样品Gt值的重复检测4次,其标准差均在合理范围内,分别为0.033、0.079、0.149和0.411.对110批蚊虫标本进行荧光定量RT-PCR检测和病毒分离榆测,结果荧光定量RT-PCR检测出7份阳性,而病毒分离则只检测出3份阳性,表明建立的荧光定量RT-PCR方法更敏感,可直接从蚊虫样本中检测乙脑病毒核酸,从病毒核酸提取至完成检测仅需3 h左右,且操作简便、敏感性高.结论 研究建立的TaqMan荧光定量RT-PCR的方法具有特异、敏感、快速的特点,适用于乙脑病原学的快速检测.     

肠道病毒71型免提取核酸的荧光RT-PCR检测方法的建立及应用

目的建立肠道病毒71型(EV 71型)免提取核酸的荧光RT-PCR检测方法。方法根据EV 71型VP1基因保守序列设计高特异性、高保守性的引物和探针,运用设计序列和缓冲液建立一种免提取核酸的荧光RT-PCR检测方法,并与传统RT-PCR方法进行比较。结果本研究建立的方法能够检测出EV 71型病毒株和EV 71型核酸标准品,而对柯萨奇病毒A4、A6、A10、A24型和诺如病毒、肠道腺病毒、札如病毒、麻疹病毒、风疹病毒的扩增均为阴性,阴性对照结果中无非特异性扩增和无假阳性结果。灵敏度检测结果显示,对EV 71型核酸标准品最低检测浓度为6.13×102copies/μL,灵敏度标准曲线为y=-3.329 8x+41.571(r=0.999 4)。对临床样本检测结果显示,本研究方法与传统RT-PCR检测方法检测结果的Kappa值为0.82,一致性强度等级为最强。结论本研究建立的EV 71型免提取核酸荧光RT-PCR检测方法特异性强、灵敏度高,适用于EV 71型的临床样本筛选分析。     

荧光定量RT-PCR快速检测乙型流感病毒核酸

目的建立以特异性荧光探针为特点的TaqMan荧光定量RT-PCR方法用于检测乙型流感病毒核酸.方法根据GenBank登录的流感毒株序列,应用生物学软件进行序列比对,在乙型流感病毒核蛋白(NP)基因的保守区设计引物和TaqMan探针进行筛选,对荧光定量RT-PCR反应条件进行优化,检测该方法的特异性和灵敏度.此外还对疑似乙型流感含漱液标本进行检测.结果该方法对乙型流感病毒的检测有高度的特异性,对甲1型、甲3型、禽流感病毒H5、SARS病毒及其他呼吸道病毒均无交叉反应,检测的灵敏度达0.01 TCID50,可从疑似流感患者含漱液中直接检测流感病毒核酸,从病毒核酸提取至完成检测仅需3 h左右.结论本研究建立的TaqMan荧光定量RT-PCR是一种快速检测乙型流感病毒特异、敏感的新方法.     

基于M基因构建的麻疹病毒实时荧光PCR检测技术

目的:建立麻疹病毒的实时荧光PCR检测方法并应用于临床标本的检测。方法:根据四十年来在我国流行的麻疹病毒M基因序列,设计用于病毒实时荧光PCR检测的引物和探针,建立麻疹病毒实时荧光PCR检测方法。用此法对40例麻疹的病人标本进行检测,并与血清学检测结果比较。结果:通过40例病人标本中实时荧光PCR检测,39份阳性,1份阴性,阳性率97.5%,高于血清学检测(阳性率77.5%)。结论:该方法方便快捷、特异性强、敏感性高,可用于麻疹病毒的快速诊断和分子流行病学调查。     

一种无RNA纯化步骤TaqMan RT—PCR方法用于快速检测登革病毒

目的 建立一种简便、快速的登革病毒核酸检测方法。方法 设计合成LNA探针，替代MGB探针，建立一步法TaqManRT—PCR方法，并用已知的登革病毒标准毒株进行方法的优化；用商品化的纯化试剂盒和简单的热释放法获取登革病毒细胞培养液和模拟含登革病毒血清中RNA。以优化的TaqManRT—PCR方法进行检测，比较有或无RNA纯化步骤检测的敏感性和重复性。结果 LNA探针TaqMan RT—PCR有较好的PCR扩增效率（104％）、较广的线性范围（10^0-10^-7样品稀释度）、较高的敏感性（0．003TCID50／反应）和较好的重复性（CV值小于4．53％），新方法检测经简单热释放RNA的细胞培养液和模拟含登革病毒血清中登革病毒也有较高的敏感性（0.03TCID50／反应）和较好的重复性（CV值小于6．36％）。结论 新型LNA探针可替代MGB探针用于TaqMan RT—PCR反应。简便的热释放RNA方法结合高敏感性的TaqMan RT—PCR可满足登革病毒快速检测的需要。     

麻疹病毒H基因的特异性逆转录-聚合酶链反应检测

采用逆转录-聚合酶链反应（RT－PCR）直接从麻疹疫苗沪191株、Edmonston株以及临床麻疹患者的含漱液和咽拭子中检测出635bp的特异性H基因目的条带；而对风疹病毒和流行性感冒甲     

一步法分离血清RAN用于丙肝病毒RT—PCR检测

应用双功能交联剂在乳胶颗粒上交联一段与丙肝病毒(HCV)核酸某段序列互补的探针使之成为特异性活化乳胶颗粒。将这种乳胶颗粒混悬在6M硫氰酸胍中，在检测时，将待检血清与之混合并置室温振摇，病毒RNA在病毒脱壳后释放出来并与活化颗粒的探针杂交，从而被分离出来．本研究应用这种方法检测临床血清50例，并与经典法、蛋白酶K法，血清直接扩增法进行比较．结果表明：一步法提取RNA，检测方法简便、敏感性高、重复性好，是一种较理想的RNA分离技术．     

2014年北京市西城区40例麻疹患者分离的麻疹病毒基因型及同源性

目的了解北京市某城区2014年分离的麻疹病毒基因型,及时发现输入性麻疹病例。方法采用荧光聚合酶链反应（PCR）方法,对北京市西城区2014年采集的标本进行病毒核酸鉴定、RT PCR扩增,扩增产物进行测序及序列比对分析。结果2014年北京市西城区共采集81例麻疹疑似患者的82份标本,其中咽拭子63份,尿19份。麻疹病毒核酸检测阳性70例,RT PCR扩增、测序获得基因序列40份,麻疹病毒培养阳性毒株37例。种系进化树分析显示,获得的40份麻疹病毒基因序列与H基因簇代表株Chin9322/H1a,以及世界卫生组织推荐的代表株MVi/Hunan.CHN/0.93/7/H1在同一分支上,核苷酸水平上同源性分别为98％～98.9％、96.9％～97.8％;氨基酸水平上同源性分别为97.3％～99.3％、95.3％～98％。结论2014年北京市西城区麻疹病例以本土基因型(H1)病例为主,进一步加强麻疹病例病原学监测对麻疹输入性病例的控制和预防具有重要意义。     

实时荧光PCR检测基孔肯雅病毒方法的建立及初步应用

目的 建立基孔肯雅病毒的荧光定量PCR检测方法.方法 针对基孔肯雅病毒的基因序列,设计、合成引物、探针及反应体系,摸索出最佳反应条件,建立TaqMan荧光探针法和SYBR荧光染料法.利用建立的方法对30例基孔肯雅热病标本和10份基孔肯雅病毒保存液进行扩增、检测和结果分析,并与常规RT - PCR方法的检测结果进行比对.结果 实时荧光定量PCR法比常规RT - PCR法快速、灵敏.40份标本TaqMan荧光探针法、SYBR荧光染料法和常规RT - PCR方法的阳性率分别为:17.5％、17.5％、15％.统计分析表明,3种方法差异不具有统计学意义.结论 实时荧光定量PCR方法快速且具有较好的特异性、敏感性、重复性,适用于基孔肯雅病毒的快速检验.