II型登革病毒NS1基因的克隆及其在昆虫细胞中的表达

目的获得II型登革热病毒NS1基因并在昆虫细胞中表达,为进一步研发登革热血清学检测试剂盒提供抗原。方法RT-PCR扩增II型登革热病毒NS1基因并测序列,并定向克隆入杆状病毒转移载体pFastBac-HTA,获得重组转移载体pFastBac-NS1。并将pFastBac-NS1转化到DH10Bac感受态细胞中,筛选到重组转座子rBacmid-NS1。在脂质体介导下将rBacmid-NS1转染Sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒rBV-NS1。rBV-NS1感染Sf9细胞后,通过SDS-PAG和Western blot检测NS1重组蛋白。结果成功克隆II型登革病毒NS1基因,SDS-PAGE、间接免疫荧光和Western blot检测表明NS1基因在昆虫细胞得到表达,能与登革患者血清发生特异性免疫反应,具有免疫原性。结论II型登革病毒非结构蛋白NS1在昆虫中表达,为进一步研究NS1的生物学特性和血清学检测奠定基础。     

汉坦病毒汉城型浙37株G1、G2包膜糖蛋白基因重组体的构建及在真核细胞中的表达

目的：构建汉坦病毒浙37（Z37）株包膜糖蛋白基因G1、G2真核表达质粒，并在真核细胞中表达。方法：根据Z37M基因序列设计6条引物，分别以质粒pGEMZ37,pCUMZ37为模板，通过聚合酶链反应（PCR）获得G1及G2片段。将G1、G2片段经BamHⅠ、XhoⅠ双酶切片插入至真核表达载体pcDNA3.1( ），经酶切鉴定，并测序证实。以磷酸钙沉淀法分别将重组质粒转染COS－7细胞，用间接免疫荧光法（IFA）检测瞬时表达的蛋白。结果：获得分别含有编码汉坦病毒（HV）Z37株包膜糖蛋白G1、G2基因的重组质粒pcDNA3.1-g1,pcDNA3.1-G2；在转染的COS－7细胞内，用IFA可检测到细胞内有特异性荧光。结论：成功地构建了HV Z37株包膜糖蛋白G1、G2基因真核表达载体，并可在COS－7细胞中瞬时表达。     

计算机在省级卫生防疫站管理中的应用

随着计算机在各行业中的广泛应用,在防疫系统内,从最初仅在完成疫情数据的上报,发展到计划免疫、食品卫生、环境卫生、劳动卫生、放射卫生、学校卫生及卫生监督人员的月报、季报、年报数据的统计与上报。目前,各级防疫站使用的成熟软件,大部分是预防医学科学院下发的,而各防疫站自身开发的软件很少,软件需求又很迫切。本文重点讨论如何加强计算机在省级卫生防疫站管理中的开发与应用。基本情况1．硬件设施我站共28个科所,现有60多台计算机,机型有386、486、586、PENTIUM,外部设备有激光、喷     

浙江省2000年肾综合征出血热监测分析

为探索肾综合征出血热 (HFRS)流行特征 ,以制定有针对性的防治措施。采用间接免疫荧光法 (I FAT)检测EHF病人血清中抗体 ,采用直接免疫荧光法 (FAT)检测鼠肺汉坦病毒 (HV)抗原。结果表明 ,全省 15 0 7例病人 ,主要分布在浙东和浙西丘陵区、浙南山区 ,5、6月及 12月和翌年 1月为二个发病高峰 ,青壮年农民发病最多。今后应对以姬鼠型为主的混合型疫区选择双价疫苗进行预防接种 ,以降低发病率。     

SARS冠状病毒CT基因型发现及相关特征

目的 研究SAPS冠状病毒基因型及相关特征。方法 对杭州市首例SAPS病人分离的SAPS冠状病毒ZJ01株进行全基因组测序，并在GenBank数据库登录。记录号：AY297028，版本号：gi：30910859。整个全基因组由29715bp组成。使用GeaBank数据库中最新登陆的SARS病毒的基因组进行序列比对、突变点分析和多态性分析、特殊片段的系统进化分析。结果 发现在ZJ0l株的9391、17555、21712、22213和27819位点，分别是T、T、G、T和T核苷酸碱基，和CenBank数据库中的其他SARS冠状病毒株比较，除第l、2、4和5突变位点(C：G：C：C／T1 T1 T2 T)之外，发现在21712位点(第3个)A／G突变也参于这一遗传标识。因此我们提出5个突位点将17株病毒分为两种基因型的新概念，即C：G：A：C：C与T：T：G：T：T两型，简称C型和T型。ZJ01病毒株属于T基因型．在中国大陆内地是首次发现和发表。突起蛋白基因片断的进化树分析，广州的GZ01 C基因型株进化距离和其他病毒株相差甚远；比较而言，和C基因型BJ0l、CUHK-Wl病毒株较为接近，其次是T基因型的Fl和F2组。5个突变位点(C：G：A：C：C／T：T：G：T：T)的两个发生在编码突起蛋白(S)的基因中，分别是A／G和C／T突变，由此引起的突起蛋白(S)氨基酸变化是Asp／Gly(天门冬氨酸／甘氨酸)和Thr／Ile(苏氨酸／异亮氨酸)。结论 这些基因型特征和变异是否会引起生物学及临床症状的差异是非常值得重视的。     

SARS病毒分离与病原学研究

目的 从浙江省首发的3例临床诊断SARS患者样本中分离SAPS病毒，并进行病毒核酸、免疫学检测和形态学观察。方法 采集3例SARS患者发病期的含漱液，接种Veto、Veto-E6、RD、Hep-2、MK单层细胞，观察细胞病变、免疫荧光法检测病毒抗原和RT-PCR法检测病毒核酸。抗原阳性的培养物作电镜形态学观察。结果 从3例患者的2份含漱液中分离到2株SAPS病毒，并发现Vero和RD两种细胞对SARS病毒敏感。在接种病毒后的3天左右可出现典型的细胞病变，两株病毒已在Vero和RD细胞上传代5代；在电镜下观察到SAPS病毒颗粒。结论 分离的2株病毒确定为SARS冠状病毒。并能在Veto细胞上稳定传代；建立的间接免疫荧光技术可用于SAPS实验室诊断及流行病学调查等。     

汉坦病毒核蛋白的重组表达及其免疫印迹法在肾综合征出血热血清抗体检测中的应用

目的 应用基因工程技术,在昆虫细胞中表达汉坦病毒（HV）S基因,表达产物作为诊断抗原,用于检测血清中抗HV特异性抗体IgG。方法 PCR扩增HV-Z10株N蛋白（NP）编码基因,基因工程方法构建NP编码基因昆虫表达系统 rBAC-Z10S-TN。间接荧光法了解重组NP（rNP）表达及与特异性免疫反应情况,SDS-PAGE观察重组蛋白表达情况。建立免疫印迹法检测肾综合征出血热（HFRS）患者血清样品,并与常规间接免疫荧光法进行比较。结果 rBAC-Z10S-TN高效表达rNP,SDS-PAGE显示rNP的蛋白表达带,此抗原仅与HFRS患者血清起反应。经双盲试验,两法检测血清143份,HFRS阳性符合率为97.67%。结论 成功构建了HV-Z10株NP编码基因高效真核表达系统。所建立的免疫印迹法可作为HFRS简便、安全、敏感、特异的血清学诊断新方法。     

肾综合征出血热疫苗后备毒株的分离和生物学特性研究

目的从肾综合征出血热(HFRS)疫区阳性鼠肺中分离汉坦病毒(HV),并对分离到的病毒进行型别鉴定和生物学特性研究,为HFRS疫苗后备毒种库的建立打下基础。方法疫区阳性鼠肺研磨液接种长爪沙鼠分离病毒,并将分离到的HV经乳沙鼠脑内连续传代,采用直接免疫荧光法和酶联免疫吸附试验,检查毒株的型别,研究传代后毒株的繁殖特性、病毒滴度和抗原滴度。结果从疫区32份阳性鼠肺中分离到9株HV,经单克隆直接荧光血清检查6株为汉滩病毒株,3株为汉城病毒株,经乳沙鼠脑内连续传代,其中4株毒株的病毒滴度和抗原滴度较高,汉滩和汉城毒株的病毒和抗原滴度最高分别达106.50、106.00和1∶5120、1∶5120。结论4株毒株的病毒滴度和抗原滴度均较高,可作为HFRS疫苗后备毒种的筛选毒株。     

肾综合征出血热疫苗后备筛选毒株在Vero细胞上的适应传代及其抗原性研究

〔目的〕将肾综合征出血热疫苗后备毒株适应于Vero细胞 ,观察病变情况 ,并对其抗原性和繁殖特性进行研究。〔方法〕将新分离的汉坦病毒ZJ2、ZJ4、ZJ7株和汉城病毒ZJ5株在Vero细胞上进行连续传代 ,采用间接免疫荧光法(IFA)、反向被动血凝试验 (RPHA) ,研究传代后毒株的病毒滴度、抗原量以及细胞的病变情况 ,同时将传代后的病毒接种敏感动物 ,观察动物的发病情况和毒株的繁殖特性。〔结果〕经过 5次连续传代 ,四株病毒在Vero细胞上均显示出良好的适应性 ,从第二代开始病毒滴度稳定在 6.0 0LgTCID5 0 ml以上 ,第五代时最高达 7.5 0LgTCID5 0 ml ,第三代毒株抗原量均已达到 1:12 8,ZJ7株抗原量最高时达 1:768,四株毒株感染Vero细胞 ,连续观察 12d不见细胞产生病变 ,第五代细胞病毒液接种敏感动物 ,9d后动物发病甚至死亡。〔结论〕四株病毒已适应于Vero细胞 ,且具有病毒滴度高、毒力强和抗原性良好的特性 ,是Vero细胞肾综合征出血热灭活疫苗良好的后备筛选毒株。