益气除痰方干预TGF-β信号途径逆转A549细胞上皮间质转化研究

目的:观察益气除痰方是否能通过干预TGF-β信号途径,逆转肺癌A549细胞上皮间质转化(EMT)。方法:通过暴露于TGF-β_1环境中,诱导肺腺癌细胞株A549发生EMT,并以益气除痰方含药血清进行干预,相差显微镜下观察各组细胞形态变化;划痕实验、Transwell实验检测各组细胞迁移及侵袭能力;Western-blot检测各组细胞EMT相关蛋白及TGF-β信号通路蛋白Smad2/3的表达。结果:镜下可见经TGF-β_1孵育的A549细胞呈现明显的间质细胞形态,益气除痰方含药血清作用24 h后细胞A549细胞出现凋亡且间质化程度较低;划痕实验结果显示:与空白血清组比较,TGF-β_1+空白血清组A549细胞迁移及侵袭能力显著升高,益气除痰方可降低TGF-β_1所升高的细胞迁移及侵袭能力;Western-blot检测显示TGF-β_1可以激活Smad2/3通路下调E-cadherin的表达,上调Vimentin的表达,而益气除痰方含药血清可抑制该过程。结论:益气除痰方可能通过干预TGF-β/Smad信号通路上调E-cadherin表达,下调Vimentin表达,从而逆转肺癌A549细胞上皮间质转化,抑制肿瘤细胞的侵袭迁移。     

扶正祛邪方对肺癌A549细胞发生上皮间质转化的抑制作用研究

目的:研究中药复方扶正祛邪方对肺癌A549细胞上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的抑制作用及机制研究。方法:采用MTT方法观察扶正祛邪方对人腺癌A549细胞的抑制作用;Western blot方法观察A549细胞EMT过程中上皮细胞、间质细胞标志物E-cadherin、N-cadherin的表达,以及信号分子P-Smad2/3的表达;RT-PCR检测扶正祛邪方对I型胶原诱导人腺癌A549细胞EMT过程中TGF-β3mRNA的影响。结果:(1)MTT结果显示:扶正祛邪方对人腺癌A549细胞的抑制作用呈剂量和时间依赖。(2)Western blot结果显示:与模型组相比,扶正祛邪方上调E-cadherin蛋白表达,下调N-cadherin、P-Smad2/3的蛋白表达(P<0.05);RT-PCR结果显示:扶正祛邪方下调TGF-β3mRNA的表达,呈浓度依赖性。结论:(1)扶正祛邪方对A549细胞有直接的抑制作用;(2)扶正祛邪方对TGF-β1诱导人腺癌A549细胞EMT有抑制作用,其机制与抑制I型胶原诱导TGF-β3mRNA表达,进而抑制Smad2/3的磷酸化,上调E-cadherin蛋白表达,下调N-cadherin蛋白表达有关。     

基于高内涵细胞成像系统研究黄芩苷对人肺癌A549 细胞上皮间质转化模型的影响

目的基于高内涵细胞成像系统（HCS）探讨黄芩苷（Baicalin）对转化生长因子β1（TGF-β1）诱导的人肺癌 A549 细胞上皮间质转化（EMT）的影响。方法体外培养人肺癌A549 细胞,用TGF-β1 诱导A549 细胞发生上 皮间质转化,设立空白对照组（TGF-β1 0 ng·mL-1）、TGF-β1 模型组（TGF-β1 5 ng·mL-1）和黄芩苷干预组 （TGF-β1 5 ng·mL-1 +黄芩苷5、10、20 μmol·L-1）。采用MTT 法检测黄芩苷对A549 细胞活性的影响;以 TGF-β1 诱导人肺癌A549 细胞发生上皮间质转化,并加入不同浓度黄芩苷干预,采用HCS 分析细胞肌动蛋白 应激纤维（F-actin）纹理强度、细胞面积、细胞圆度和细胞长度等形态学变化,以及细胞黏附能力和运动迁移能 力变化;RT-qPCR 法检测上皮间质转化相关标志基因Collagen I、FN1、Vimentin 和E-cadherin 的相对表达 量。结果黄芩苷干预A549 细胞48 h 后半数抑制浓度（IC50）为22.59 μmol·L-1。HCS 分析结果显示,与空白对 照组比较,TGF-β1 模型组细胞形态呈间质细胞样（纺锤形）变化,F-actin 纹理强度增强（P＜0.01）,细胞长度 和细胞面积增大（P＜0.01）,细胞圆度减小（P＜0.01）,黏附率降低（P＜0.01）,迁移率和迁移速度升高（P＜ 0.01）;与TGF-β1 模型组比较,黄芩苷干预组细胞形态呈上皮细胞样（不规则多边形）变化,F-actin 纹理强度 减弱（P＜0.05,P＜0.01）,细胞长度和细胞面积减小（P＜0.01）,细胞圆度增大（P＜0.01）,黏附率升高（P＜ 0.01）,迁移率和迁移速度降低（P＜0.05,P＜0.01）。RT-qPCR 结果表明,与空白对照组比较,TGF-β1 模型组 Collagen Ⅰ、FN1 和Vimentin 的mRNA 相对表达量升高（P＜0.01）,E-cadherin 的mRNA 相对表达量降低（P＜ 0.01）;与TGF-β1 模型组比较,黄芩苷干预组Collagen I、FN1 和Vimentin 的mRNA 相对表达量降低（P＜ 0.05,P＜0.01）,E-cadherin 的mRNA 相对表达量升高（P＜0.05,P＜0.01）。结论黄芩苷能够有效阻止 TGF-β1 诱导的人肺癌A549 细胞上皮间质转化进程,提示HCS 是一种多参数系统分析细胞上皮间质转化的有 效工具。     

12种中药醇提取物对TGF-β1诱导的A549细胞上皮间质转化的干预作用

目的对茯苓、蒲黄、白及、鸡血藤、郁金、红花、牛膝、何首乌、黄芪、仙茅、鹿衔草、白化参共12种中药的醇提取物进行筛选,探讨12种中药醇提取物对转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的非小细胞肺癌A549细胞上皮间质转化(EMT)的干预作用。方法10 ng/ml TGF-β1诱导A549细胞;采用MTT法检测12种中药醇提取物对A549细胞增殖的影响;观察醇提取物对TGF-β1诱导的A549细胞形态变化的影响;采用Western blot方法检测醇提取物对TGF-β1诱导的EMT相关标志蛋白的表达,以及对EMT相关信号转导的影响。结果 10 ng/ml的TGF-β1诱导A549细胞48 h后使其发生EMT过程;何首乌醇提取物不影响A549细胞增殖;与TGF-β1组相比较,100μg/ml的何首乌醇提取物能逆转A549细胞形态变化过程;与TGF-β1组相比较,100μg/ml的何首乌醇提取物降低vimentin蛋白表达水平(P0.05),上调E-cadherin蛋白表达水平(P0.05);与TGF-β1组比较,100μg/ml的何首乌醇提取物降低pSmad2和p-Erk蛋白表达水平(P0.05)。结论何首乌醇提取物具有抑制TGF-β1诱导的A549细胞上皮间质转化过程的作用,这可能与Smad2和Erk1/2信号通路有关。     

补中益气汤含药血清对TGF-β1介导的A549细胞中Twistl表达的影响

目的:观察补中益气汤含药血清对转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)介导的人肺腺癌A549细胞上皮间质转化过程中Twistl表达的影响。方法:制备最佳浓度补中益气汤最佳浓度含药血清作用于TGF-β1诱导的A549细胞,实验分组为空白血清组、空白血清+TGF-β1组、以及补中益气汤最佳浓度补中益气汤含药血清+TGF-β1组。采用免疫组化、western-blot和realtime PCR法分别检测Twistl在蛋白和基因水平表达的变化。结果:最佳浓度的补中益气汤含药血清能使上皮间质化的A549细胞中Twistl蛋白表达下降,mRNA表达水平降低。结论:补中益气汤含药血清能抑制TGF-β1介导的A549细胞上皮间质化过程中Twistl表达。     

补中益气汤含药血清对TGF-β1介导的A549细胞中拓扑异构酶Ⅱα表达的影响

目的:观察补中益气汤含药血清对转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)介导的人肺腺癌A549细胞上皮间质转化过程中耐药标志物TopoⅡα表达的影响。方法:制备最佳浓度补中益气汤含药血清作用于TGF-β1诱导的A549细胞,实验分组为空白血清组、最佳浓度补中益气汤含药血清+TGF-β1组、以及空白血清+TGF-β1组。采用免疫组化、western-blot和realtime PCR法分别检测TopoⅡα在蛋白和基因水平表达的变化。结果:最佳浓度的补中益气汤含药血清能使上皮间质化的A549细胞中TopoⅡα蛋白表达增加,mRNA表达水平升高。结论:补中益气汤含药血清能增加TGF-β1介导的A549细胞上皮间质化过程中TopoⅡα表达。     

三七总皂苷对肺癌A549细胞上皮间质转化的抑制作用

目的观察三七总皂苷(PNS)对体外经转化生长因子-β_1(TGF-β_1)诱导肺腺癌A549细胞后发生上皮细胞间质化(EMT)的作用。方法首先进行PNS MTT实验,然后再进行PNS干预EMT实验,将A549细胞随机分为5组:空白组加入F-12培养基,模型组及低、中、高浓度中药组分别加入10 ng/mL TGF-β_1和62.5、125、250μg/mL PNS,继续培养72 h。采用光学显微镜观察各组细胞的形态变化,采用实时荧光定量PCR、Western Blot及免疫荧光技术检测纤维连接蛋白(FN)、波形蛋白(Vim)、E-钙黏素(E-Cad)mRNA及蛋白表达水平。结果 31.25～500μg/mL PNS对A549细胞无明显增殖作用。与空白组比较,模型组FN mRNA及蛋白表达升高(P0.01,P0.05),Vim蛋白表达升高(P0.05),E-Cad mRNA及蛋白表达降低(P0.05)。与模型组比较,高浓度中药组FN mRNA表达降低(P0.05),E-Cad及蛋白mRNA表达升高(P0.01,P0.05);低浓度、高浓度中药组FN蛋白表达降低(P0.05),低、中浓度中药组Vim蛋白表达降低(P0.05)。结论 PNS体外干预可提高EMT过程中上皮标志物E-Cad并抑制间质标志物FN、Vim的表达,高浓度时结果更为显著,对EMT过程有一定的干预作用。     

大黄虫丸对转化生长因子-β1诱导A549细胞上皮-间充质转化的影响

目的：基于“IPF患者存在肺络干血”假说,观察大黄虫丸含药血清对TGF-β1诱导后A549细胞上皮-间充质转化(EMT)及Smad3,Collagen Ⅲ表达的影响,探讨其防治特发性肺纤维化(IPF)的作用机制。方法：正常培养并取对数生长期A549细胞,TGF-β1对其诱导48 h,电子显微镜下观察A549细胞的形态学变化;选择吡非尼酮（PFD）为阳性对照药,RT-PCR法检测EMT相关基因及Smad3 mRNA的表达;Western Blottingting法检测Smad3,p-Smad3,Collagen Ⅲ蛋白表达。结果：成功获取发生EMT的A549细胞;以α-SMA mRNA表达情况判断EMT程度由高到低依次为:模型组(M),大黄虫丸含药血清大剂量组(D),西药组(P),大黄虫丸含药血清中剂量组(Z),大黄虫丸含药血清小剂量组(X),空白对照组(K);与M组比较,Z组,X组,P组中Collagen Ⅲ表达不同程度降低(P<0.05),且其在Z组与K组中表达差异无统计学意义(P>0.05);与M组及K组比较,各观察组Smad3表达差异无统计学意义(P>0.05),但对其基因及磷酸化,即Smad3 mRNA及p-Smad3的表达有影响,且与M组比较,Z组,X组,P组中均不同程度降低(P<0.05),D组中表达虽低于M组,但差异无统计学意义(P>0.05)。结论：大黄虫丸对TGF-β1诱导后A549细胞发生EMT程度与Smad3 mRNA及Collagen Ⅲ的表达有影响,推测大黄虫丸对IPF的保护机制可能与不同程度阻断或逆转了TGF-β1/Smad3介导的EMT有关。     

肺瘤平膏含药血清对巨噬细胞共培养条件下A549细胞EMT相关mRNA及蛋白表达的影响

目的观察肺瘤平膏含药血清对A549细胞与巨噬细胞共培养条件下上皮间质转化(epithelialmesenchymal transition,EMT)相关mRNA及蛋白表达的影响。方法制备肺瘤平膏含药血清,建立A549细胞与巨噬细胞的共培养体系,将细胞分为A549加空白血清组(A549+NRS组)、共培养加空白血清组(共培养+NRS组)及共培养加肺瘤平膏含药血清组(共培养+FLP组)。采用荧光定量PCR、免疫荧光法比较各组A549细胞EMT相关基因(SNAIL1、SNAIL2、ZEB1、CDH1、CDH2、VIM、TJP1、CLDN1、CTNNB1、FLRT1)及E-cadherin、N-cadherin、ZO-1、Vimentin蛋白表达水平的影响。结果共培养条件下,A549细胞变为间充质细胞样。加入肺瘤平膏含药血清后,部分A549细胞形态恢复为上皮细胞样。与A549+NRS组比较,共培养+NRS组A549细胞SNAIL1、ZEB1、CTNNB1、FLRT1、CDH2、VIM mRNA表达上调,TJP1 mRNA表达下调(均P0.05);与共培养+NRS组比较,共培养+FLP组SNAIL2、TJP1、CLDN1、CDH1、VIM mRNA表达上调,CTNNB1、FLRT1及CDH2 mRNA表达下调(均P0.05)。免疫荧光结果显示,E-cadherin表达于细胞膜和胞浆内,以细胞膜为主;N-cadherin表达于细胞膜和胞浆内,以细胞浆为主;Vimentin表达于胞浆内;ZO-1表达于细胞连接处为主,部分细胞膜染色亦呈阳性。与A549+NRS组比较,共培养+NRS组A549细胞E-cadherin蛋白表达下调,N-cadherin及Vimentin蛋白表达上调(P0.05);肺瘤平膏含药血清可上调E-cadherin表达,下调N-cadherin及Vimentin蛋白表达(均P0.05)。结论肺瘤平膏可抑制共培养条件下A549细胞EMT的形成。     

金龙蛇颗粒对缺氧环境下胃癌BGC-823细胞上皮间质转化的影响

目的探讨金龙蛇颗粒对缺氧状态下胃癌BGC-823细胞上皮间质转化(EMT)的影响并初步研究该过程的相关机理。方法将胃癌BGC-823细胞分成3组:常氧对照组、缺氧对照组(加入150μmol/L的Co Cl2)、金龙蛇颗粒含药血清组。观察3组细胞形态变化;RT-PCR检测3组细胞E-cad、N-cad、Vimentin mRNA表达变化。结果常氧对照组的胃癌BGC-823细胞排列较致密,为上皮样表现;缺氧对照组大部分细胞排列较前松散,形态较前拉长,呈间质样表现;金龙蛇颗粒含药血清组介于二者之间。金龙蛇颗粒含药血清组与缺氧对照组相比,E-cad mRNA表达升高,N-cad、Vimentin mRNA表达降低,差异有显著统计学意义(P0.01)。结论金龙蛇颗粒可抑制缺氧环境中胃癌BGC-823细胞的上皮间质转化,可能与其下调N-cad、Vimentin mRNA表达,升高E-cad mRNA表达相关。     

芪连扶正胶囊对TGF-β介导EMT作用的影响

目的：观察芪连扶正胶囊含药血清对TGF-β及EMT相关分子在肺癌A549细胞中表达的影响,探讨相关机制。方法：体外培养肺癌A549细胞,制备芪连扶正胶囊含药血清,分组干预,采用RT-PCR检测TGF-β1mRNA表达,IC检测E-cad与N-cad表达。结果：对照组、芪连扶正低剂量、中剂量、高剂量组、化疗组及联合组的TGF-β1 mRNA相对表达量依次为（31.11±1.58）%、（29.53±1.50）%、（27.28±1.75）%、（25.23±1.38）%、（23.03±1.59）%、（20.72±1.38）%;各组E-cad、N-cad均有不同程度阳性表达,除芪连扶正胶囊低剂量组外,各药组E-cad阳性率均高于对照组、N-cad则相反(P<0.05或P<0.01);与化疗组相比,联合组及芪连扶正胶囊各组亦有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结论：芪连扶正胶囊可通过逆转TGF-β介导的EMT作用防止肿瘤转移。     

北沙参石油醚部位抑制TGF-β1诱导的A549细胞上皮间质转化

探讨北沙参石油醚部位对TGF-β1诱导的肺癌Ⅱ型上皮细胞A549上皮间质转化的抑制作用及其可能机制。以A549细胞为研究对象,采用5μg·L~(-1)TGF-β1诱导的上皮间质转化模型进行实验。设置空白对照组、模型组、北沙参石油醚组。MTT法检测北沙参石油醚部位对A549细胞存活率的影响;Real-time PCR分析北沙参石油醚部位对诱导后A549细胞ColⅠ,E-cadherin,Vimentin,α-SMA mRNA表达水平的影响。酶联免疫吸附法(ELISA)检测北沙参石油醚部位对诱导后细胞羟脯氨酸(HYP)分泌水平影响。细胞划痕检测北沙参石油醚部位对细胞运动能力的影响。从实验结果可以看出,北沙参石油醚部位能抑制A549细胞生长且呈药物浓度依赖关系。与模型组相比,北沙参石油醚部位能有效抑制上皮间质转化的标志性蛋白ColⅠ,Vimentin,α-SMA基因的表达,促进E-cadherin基因的表达。降低细胞内羟脯氨酸含量,同时降低细胞的运动能力。由此表明,北沙参石油醚部位能有效抑制TGF-β1诱导的肺泡上皮细胞发生上皮间质转化,是特发性肺纤维化的潜在治疗药物。其机制可能通过调控ColⅠ,Vimentin,α-SMA,E-cadherin而实现。     

地黄对人肺泡上皮细胞间质转化的抑制作用

目的:探讨地黄(环烯醚萜类苷、低聚糖和多糖提取物按照一定比例形成的组合物)对人肺泡上皮细胞间质转化的影响和机制。方法:MTT法分析地黄对A549细胞增殖的影响。TGF-β1诱导A549肺泡上皮细胞的间质转化并进行不同剂量的地黄干预;圆形度定量法和免疫细胞化学法分析细胞形态和细胞E-cad、FN、Collagen-I和α-SMA蛋白的表达;双抗体夹心酶联免疫吸附法检测细胞分泌MMP-9和TIMP-1水平。结果:地黄对A549细胞增殖的抑制作用随着剂量的增加而增强,200μg/ml剂量显著抑制细胞增殖(P0.01)。与正常组比较,TGF-β1组圆形度和E-cad表达显著降低,α-SMA、FN和Collagen-I表达显著升高,MMP-9和TIMP-1分泌量显著增加(P0.01)。与TGF-β1组比较,50μg/ml、100μg/ml组的圆形度和E-cad表达显著升高,α-SMA表达显著降低;地黄对FN、Collagen-I的表达和MMP-9分泌量没有显著的影响;25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml组TIMP-1分泌量显著增加。结论:地黄能有效抑制A549人肺泡上皮细胞的上皮间质转化,作用机制涉及TGF-β1信号转导通路,尚有抑制MMP-9降解细胞外基质的作用。     

基于自噬途径探讨加味麻杏石甘汤干预放射性肺损伤的分子机制

目的:从自噬相关因子的表达研究加味麻杏石甘汤干预放射性肺损伤的发生机制。方法:将肺泡细胞A549分为空白组、模型组及麻杏石甘汤低、中、高剂量组(以下简称低、中、高剂量组)。除空白组外,其余各组细胞进行X线照射,建立放射性肺损伤细胞模型。模型组细胞用10%正常大鼠血清培养,低、中、高剂量组分别用10%低、中、高剂量的含药血清培养。分别采用Western-blot及RT-PCR检测肺泡细胞A549中转化生长因子-β1 (TGF-β1)、Beclin-1、LC3蛋白及mRNA表达。结果:与空白组比较,模型组细胞中TGF-β1、Beclin-1、LC3蛋白及mRNA表达均升高(P0.05)。与模型组比较,低、中、高剂量组细胞中TGF-β1、Beclin-1、LC3 mRNA表达均下降(P0.05),且随着剂量的升高而下降(P0.05);低、中、高剂量组TGF-β1蛋白表达下降(P0.05),中、高剂量组Beclin-1、LC3蛋白表达下降(P0.05),且TGF-β1、Beclin-1、LC3蛋白表达随着剂量的升高而下降(P0.05)。结论:加味麻杏石甘汤可通过下调肺泡细胞A549内TGF-β1、LC3、Beclin-1水平,调控自噬过程,减轻放射性肺损伤。     

扶正祛邪方对肺癌A549细胞EMT的抑制作用及机制研究

目的:研究中药复方扶正祛邪方对肺癌A549细胞上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的抑制作用及机制研究。方法:采用MTT方法观察扶正祛邪方对人腺癌A549细胞的抑制作用;采用Transwell方法观察扶正祛邪方对人腺癌A549细胞侵袭的抑制作用;Western blot方法观察A549细胞EMT过程中上皮细胞、间质细胞标志物E-cadherin、Vimentin、FN的表达,转录因子Snail的蛋白表达,以及信号分子PSmad2/3的表达。结果:1MTT结果显示:扶正祛邪方对人腺癌A549细胞的抑制作用呈剂量和时间依赖。2Transwell侵袭实验结果显示:不同浓度的扶正祛邪方对人腺癌A549细胞的穿膜能力有抑制作用(P0.05)。3Western blot结果显示:与模型组相比,扶正祛邪方上调E-cadherin蛋白表达,下调Vimentin、FN、P-Smad2/3蛋白表达(P0.05);结论:1扶正祛邪方对A549细胞有直接的抑制作用;2扶正祛邪方对TGF-β1诱导人腺癌A549细胞EMT有抑制作用,其机制与抑制Smad2/3的磷酸化,进而减少Snail蛋白的表达有关。     

肺岩宁下调转录因子Snail表达抑制人肺腺癌A549细胞EMT发生及侵袭转移

目的 研究肺岩宁抑制人肺腺癌A549细胞侵袭转移的分子机制。方法 体外培养A549细胞,细胞计数试剂盒（Cell counting kit 8,CCK-8）检测不同浓度的肺岩宁对A549细胞生长增殖的影响;细胞形态学观察和免疫印迹实验（Western blot）检测转化生长因子β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)对A549细胞上皮间质转化（Epithelial mesenchymal transformation,EMT）发生的影响;Western blot、实时荧光定量聚合酶链式反应（Real time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR）实验检测TGF-β1诱导前后,肺岩宁对A549细胞EMT标志蛋白及mRNA表达变化;划痕实验、Transwell实验检测TGF-β1诱导前后,肺岩宁对A549细胞侵袭和迁移能力的影响变化;构建稳定过表达Snail的A549细胞株,Western blot、RT-qPCR实验检测稳定过表达锌指转录因子（Snail）后,肺岩宁对A549细胞EMT标志蛋...     

六君子汤含药血清对TGF-β1介导的A549细胞MMP-9和整合素β1蛋白表达的影响

目的:观察六君子汤含药血清对TGF-β1介导的A549细胞MMP-9和整合素β1表达的影响,探讨六君子汤影响肺癌转移的可能机制。方法:制备六君子汤含药血清,体外培养A549细胞。实验分三组:空白血清组,空白血清+TGF-β1组,六君子汤最佳浓度含药血清+TGF-β1组。普通显微镜下观察TGF-β1对A549细胞的干预程度。细胞划痕实验检测六君子汤含药血清对TGF-β1介导的A549细胞迁移能力的影响。免疫细胞化学法和Western Blot技术检测MMP-9和整合素β1在蛋白表达水平上的变化。结果:TGF-β1能够明显诱导A549细胞发生上皮间质转化。与空白血清组比较,空白血清+TGF-β1组细胞迁移程度明显增加(P0.05),MMP-9和整合素β1的蛋白表达增加(P0.05);与空白血清+TGF-β1组比较,含药血清组细胞迁移程度下降(P0.05),MMP-9和整合素β1的蛋白表达下降(P0.05)。结论:(1)六君子汤含药血清能够减缓TGF-β1介导的A549细胞的迁移能力;(2)六君子汤含药血清能够降低TGF-β1介导的A549细胞MMP-9和整合素β1蛋白的表达。     

补肾化瘀泄浊方通过调控细胞外调节蛋白激酶信号通路阻抑人肾小管上皮细胞间充质转化的机制研究

目的:观察补肾化瘀泄浊方对转化生长因子(TGF-β1)诱导人肾小管上皮细胞(HK-2)的上皮间充质转化(EMT)及Smad2/3的影响,探讨其阻抑HK-2 EMT的机制。方法:采用TGF-β1诱导建立HK-2 EMT模型,Western blot检测TGF-β1对EMT标记蛋白、Smad2/3及细胞外调节蛋白激酶(ERK)信号蛋白的影响。予不同剂量补肾化瘀泄浊方进行干预,Real-Time PCR检测EMT相关基因mRNA的表达,Western blot检测EMT相关蛋白、Smad2/3及ERK的表达;与ERK通路抑制剂PD98059作比较,观察补肾化瘀泄浊方通过ERK信号通路干预HK-2 EMT的作用。结果:与空白组比较,模型组HK-2细胞出现EMT特有的“纺锤形”结构,EMT标记α-SMA、Vimentin蛋白和mRNA表达升高(P<0.05),E-cadherin蛋白和mRNA表达降低(P<0.05),且磷酸化ERK及Smad2/3蛋白水平显著升高(P<0.05)。与模型组比较,补肾化瘀泄浊方各剂量组HK-2细胞EMT样形态改善,α-SMA、Vimentin蛋白和mRNA表达降低(P<0.05),E-cadherin蛋白和mRNA表达升高(P<0.05),磷酸化ERK及Smad2/3蛋白水平下降(P<0.05),且剂量越高作用越明显。与模型组比较,ERK通路抑制剂能显著下调α-SMA、Vimentin、磷酸化Smad2/3蛋白水平(P<0.05);补肾化瘀泄浊方高剂量具有与ERK通路抑制剂类似的作用。结论:TGF-β1可诱导HK-2 EMT,上调ERK及Smad2/3磷酸化水平,补肾化瘀泄浊方很可能通过抑制ERK通路活化,下调Smad2/3磷酸化水平,阻抑HK-2 EMT。     

天龙咳喘灵提取物对A549细胞上皮间质转化的影响及机制研究北大核心CSCD

目的探讨天龙咳喘灵提取物能否抑制转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的A549细胞上皮-间质转化(EMT)及其作用机制。方法 1.用TGF-β1刺激体外培养的A549细胞发生EMT,观察天龙咳喘灵提取物干预后细胞形态的改变,Real-time PCR和Western blot检测上皮标志E-cadherin和间质标志Fibronectin的表达情况。2.检测不同时间点TGF-β1和天龙咳喘灵提取物对Notch1、Jagged1和Hey1表达的影响。3.转染Jagged1si RNA并用TGF-β1刺激细胞,检测E-cadherin和Fibronectin的蛋白表达情况。结果 1.与空白对照组比较,TGF-β1组细胞发生间质细胞形态变化,E-cadherin的m RNA和蛋白表达下调,Fibronectin表达上调;与TGF-β1组相比,天龙咳喘灵提取物组细胞恢复上皮细胞形态,E-cadherin的m RNA和蛋白表达上调,Fibronectin表达下调。2.TGF-β1刺激后,Jagged1、Hey1的表达量随着时间上调,而Notch1表达量无明显变化;天龙咳喘灵提取物可使Notch1、Jagged1、Hey1的表达量均随着时间下调。3.转染Jagged1 si RNA成功敲除Jagged1基因后,TGF-β1诱导的E-cadherin表达下调和Fibronectin表达上调受到抑制。结论天龙咳喘灵提取物通过下调Notch信号通路抑制TGF-β1诱导的上皮间质转化。     

益气除痰方对缺氧微环境下A549细胞上皮间质转化及P4HB表达的影响

目的 研究益气除痰方对缺氧条件下A549细胞上皮间质转化的影响并初步探讨其与脯氨酸4-羟化酶β亚基(P4HB)、波形蛋白(Vimentin)表达的相关性。方法 将A549细胞分为3组培养:常氧对照组(常规培养),缺氧模型组(加入CoCl2培养模拟缺氧微环境诱导A549细胞上皮间质转化),益气除痰方含药血清组(在CoCl2培养基础上加入益气除痰方含药血清培养)。相差显微镜下观察3组A549细胞形态的变化;RT-PCR检测3组549细胞P4HB、Vimentin mRNA的表达含量。结果 相差显微镜下常规培养的A549细胞呈不典型上皮细胞形态,经CoCl2刺激后,大部分细胞形态明显拉长,呈现明显的间质细胞形态。益气除痰方含药血清组与常氧对照组比较间质细胞形态的细胞增多,较缺氧模型组间质细胞形态的细胞明显减少。缺氧模型组A549细胞P4HB、Vimentin mRNA的表达量较常氧对照组明显上调,差异有统计学意义(P < 0.01);益气除痰方含药血清组P4HB、Vimentin mRNA的表达量较缺氧模型组明显下调,差异有统计学意义(P < 0.01,P < 0.05)。结论 益气除痰方可抑制缺氧诱导的上皮间质转化,可能与其下调P4HB mRNA表达相关。