去甲二氢愈创木酸对VEGF及其受体KDR基因表达影响的研究

目的：探讨去甲二氢愈创木酸（NDGA）对血管生成因子（VEGF）及其相应受体KDR基因表达状况的影响及其意义。方法：采用免疫组化、原位杂交及图像分析等技术方法观测NDGA作用下人恶性胶质瘤细胞系SHG－44细胞VEGF基因、人脐静脉内皮细胞系ECV－304细胞VEGF的相应受体KDR基因表达的变化。结果:①100μmol/L的NDGA处理胶质瘤细胞1－3d ,引起VEGF蛋白及mRNA表达水平的降低;②100μmol/L的NDGA处理内皮细胞1－3d,受体KDR的蛋白表达也呈下降趋势,且KDR基因表达的降 低较胶质瘤细胞VEGF的降低更为明显。结论：NDGA对胶质瘤细胞VEGF的表达有抑制作用,NDGA也抑制了内皮细胞KDR的表达,此抑制作用可能是NDGA抗血管生成的重要分子基础。     

去甲二氢愈创木酸对恶性胶质瘤细胞基因组甲基化水平的影响及其意义

目的：探讨去甲二氢愈创木酸（NDGA）诱导人恶性胶质瘤细胞系SHG－44细胞分化过程中基因组甲基化状态改变及其意义。方法：合成甲基化敏感性AP－PCR引物,用AP－PCR方法检测SHG－44细胞基因组甲基化状态,观察NDGA诱导该细胞分化过程中甲基化水平的变化。结果：对照组基因组DNA经MspI酶解后AP－PCR扩增片段比HpaII酶解后的扩增片段小,几乎未见存留大片段,至少有3个片段与HpaII酶解片段不同。同一时相点HpaII酶解后扩增产物相比,NDGA处理后基因组DNA Msp I酶解后的扩增产物量较少、条带较多,且随时相点延长产物量逐渐增加,条带增多。结论：NDGA诱导人恶性胶质瘤细胞SHG－44细胞分化过程中基因组甲基化状态增高,推测基因组甲基化状态可能是NDGA诱导胶质瘤细胞分化的作用靶点之一。     

反义GFAP对人恶性胶质瘤细胞系CHG-5增殖及分化的影响

目的观察抑制内源性胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)基因表达对恶性胶质瘤细胞生物学特性的影响,为进一步深入研究GFAP基因在胶质瘤恶性转化及诱导分化治疗中的作用提供实验基础.方法构建反义GFAP 逆转录病毒表达载体,经包装后以病毒上清感染人恶性胶质瘤细胞系CHG-5;采用RT-PCR、原位杂交以及免疫细胞化学方法检测GFAP基因及其蛋白的表达;并通过形态学、细胞生长曲线、软琼脂克隆形成及流式细胞分析等观察抑制GFAP基因表达后CHG-5细胞形态、增殖和细胞周期进程的变化.结果反义逆病毒感染后CHG-5细胞GFAP mRNA及其蛋白表达显著减弱甚至缺失,瘤细胞异型性增加,细胞增殖速度加快,体外成瘤能力增强,S期、G2/M期细胞比例升高.结论抑制内源性GFAP基因表达可使CHG-5细胞呈现更为恶性的表型,提示GFAP基因在调控胶质瘤细胞分化程度及恶性生物学行为方面具有重要作用.     

bcl-2、c-myc基因表达在去甲二氢愈创木酸诱导人恶性胶质瘤细胞凋亡中的意义

目的：观察bcl-2、c-myc在去甲二氢愈创木酸（NDGA）诱导恶性胶质瘤细胞系SHG－44细胞凋亡中的变化及意义。方法：利用光镜和电镜观察及TUNEL法检测培养细胞凋亡的情况,用免疫组织化学、原位杂交和图像分析等方法检测bcl-2、c-myc基因mRNA和蛋白的表达水平。结果:①一定浓度的NDGA处理SHG－44细胞12－96h,均可诱导SHG－44细胞发生凋亡,且随着作用时间的延长,凋亡细胞数增加越明显;②经NDGA处理细胞后,出现SHG－44细胞bcl-2、c-myc蛋白表达水平降低,且随着作用时间的延长,这种趋势更加明显,与细胞调亡的发生密切相关;③原位杂交结果显示,NDGA处理细胞不同时间后,出现SHG－44细胞bcl-2、c-myc基因mRNA的表达水平降低,结果与免疫组化检测一致。结论：NDGA诱导SHG－44细胞的凋亡可能与其下调bcl-2、c-myc基因的表达有关,但其确切机制有待进一步深入研究。     

胶质瘤协同诱导分化的免疫组化研究

目的 探索诱导分化在脑胶质瘤治疗中的用途。方法 应用SP免疫组化染色法，检测9顺式维甲酸及干扰素－γ（9－cisRA／IFN－γ）协同诱导分化处理前后脑胶质瘤细胞Ki－67及胶质纤维酸性蛋白（GFAP）抗原的表达变化。结果 9－cisRA／IFN－γ协同诱导分化可使脑胶质瘤细胞Ki－67LI水平显著下降（P＜0．01）。而GFAP蛋白的表达显著增加（P＜0．01）。结论 协同诱导分化能有效逆转脑胶质瘤细胞的恶性增殖表型，并促使其进一步分化。     

地塞米松对cAMP诱导胶质瘤细胞分化的影响

目的:探讨地塞米松对环腺苷酸(cAMP)诱导C6胶质瘤细胞分化的影响。方法:应用地塞米松和RU486单独或共同与cAMP作用于C6胶质瘤细胞,通过Western blotting检测胶质细胞分化标志蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)表达变化,光镜观察细胞形态学变化;通过Western blotting和细胞免疫荧光观察CREB磷酸化水平。结果:地塞米松与cAMP共作用于C6胶质瘤细胞48h,抑制GFAP表达和细胞形态改变;糖皮质受体抑制剂RU486逆转地塞米松的作用;地塞米松抑制cAMP诱导的CREB磷酸化。结论:地塞米松通过抑制CREB磷酸化逆转cAMP诱导的胶质细胞分化。     

苯丁酸钠对人脑胶质瘤细胞的诱导分化作用

目的评价新药苯丁酸钠对胶质瘤细胞的诱导分化作用，为胶质瘤诱导分化相关基因研究作前期准备。方法 采用MTT法，软琼脂克隆形成率，形态学，流式细胞术，GFAP免疫荧光等方法鉴定分化程度，用划痕实验检测细胞运动能力的改变。结果 2mM苯丁酸钠即可明显诱导人脑胶质瘤低分化细胞株SHG-44-9的细胞分化，表现为增殖抑制，克隆形成能力丧失，细胞突起增长，G1期阻滞，GFAP表达量升高，细胞运动能力下降。结论 苯丁酸钠可以高效诱导人脑胶质瘤细胞分化，并使细胞运动能力下降，有可能发生分化相关基因表达改变。     

恶性胶质瘤细胞死亡诱导信号复合体表达与TRAIL诱导凋亡的关系

目的：通过研究恶性胶质瘤细胞中死亡诱导信号复合体(DISC)与肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）诱导凋亡的关系,初步探讨TRAIL诱导凋亡抵抗的机制。方法：分离恶性胶质瘤组织,获得和培养原代胶质瘤细胞,用100 μg/L TRAIL作用后采用酸性磷酸酶法检测细胞凋亡水平;Western blotting 法检测细胞表达死亡诱导信号复合体的水平。结果：获得3株（GC417、GC321、GC125）原代恶性胶质瘤细胞;3株细胞对TRAIL诱导凋亡的敏感程度不同［GC321（0.12±0.01 vs 0.51±0.02）和GC125（0.22±0.01 vs 0.36±0.01）］,对TRAIL诱导凋亡作用敏感,与对照组比较差异有统计学意义（P<0.01）;而GC417（0.24±0.01 vs 0.23±0.02）对TRAIL诱导凋亡不敏感。Western blotting法检测结果显示,死亡诱导信号复合体表达不同,GC321和GC125表达增高,GC417表达减少。结论：不同来源的原代培养恶性胶质瘤细胞对TRAIL诱导凋亡的反应不同,死亡诱导信号复合体表达也不同,死亡诱导信号复合体表达的减少可能与凋亡抵抗的发生密切相关。     

CDK4在去甲二氢愈创木酸抑制恶性胶质瘤细胞增殖中的作用

目的：探讨细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶4（CDK4）在去甲二氢愈创木酸（NDGA）抑制人恶性胶质瘤细胞系SHG－44细胞增殖中的作用。方法：采用细胞培养、细胞计数、流式细胞仪检测、免疫沉淀、免疫组化及图像分析等技术方法。结果：①在10－200μmol/L浓度范围内,NDGA可使SHG－44细胞增殖受阻,且NDGA液浓度越高,这种作用越明显,即呈明显的剂量依赖性;②NDGA对细胞周期抑制作用主要表现于G1→期;③NDGA处理后,SHG－44细胞CDK4蛋白激酶的活性降低,且这种作用与NDGA的处理浓度呈正相关,与NDGA对SHG－44细胞的增殖抑制作用相一致;④NDGA处理后,SHG－44细胞CDK4基因的蛋白表达明显减弱。结论：CDK4蛋白激酶活性降低在NDGA抑制SHG－44细胞增殖中起着十分重要的作用。     

去甲二氢愈创木酸与氨甲喋呤、长春新碱配伍对人恶性胶质瘤细胞株的作用

目的：观察体外应用去甲二氢愈创木酸（NDGA）、氨甲喋呤（MTX）、长春新碱（VCR）3种药物单用或合用对人恶性胶质瘤细胞株SHG－44细胞的作用,并探讨其作用的可能机制。方法：用MTT法检测药物作用效应,用免疫组化染色法检测细胞CyclinD1基因的蛋白表达情况。结果：①3种药物单用及两药合用时随着药物浓度的增加其抗肿瘤效应也增加,且两药合用药物的效应增强;②先给NDGA24h后再给MTX或VCR,与同时给药对该细胞的抗肿瘤效应差异无显著性（P＞0.05）,而先给MTX或VCR24h后再给NDGA,与同时给药对细胞的抗肿瘤效应差异有显著性（P＜0.05）;③免疫组化染色结果显示,与对照组相比,NDGA处理后该细胞Cyclin D1基因的蛋白表达明显降低。结论：NDGA与MTX或VCR间有 协同作用,且这种作用可能与NDGA降低细胞cyclin D1基因的蛋白表达有关。     

NDGA诱导人胶质瘤细胞株分化过程中基因组甲基化及甲基转移酶的变化及意义

目的 了解去甲二氢愈创木酸(Nordihydroguaiaretic acid,NDGA)处理前后两种人胶质瘤细胞系CHC-5、SHC-44甲基转移酶(DNA methyltransferase，DNMT)活性、DBNT mRNA表达和基因组甲基化程度的改变。方法 以NDAG处理人恶性胶质瘤细胞系CHC-5及SHC-44，观察两种细胞增殖和分化状态；采用同位素微量示踪法测定甲基转移酶活性和基因组DNA甲基化程度；应用RT-PCR法测定洲DNMT mRNA表达水平。结果 NDMT处理后两种细胞增殖速度明显减缓，分化水平升高；DNMT活性显著降低、基因组甲基化程度明显升高；而DNMT mRNA改变不明显。结论 NDGA能抑制甲基转移酶的活性，升高基因组甲基化水平，这些作用可能与其诱导恶性胶质细胞瘤分化的机制有关。     

Study of apoptosis induced by nordihydroguaiaretic acid in human ma-lignant glioma cell line SHG-44

Objective: To investigate the effect and mechanism of nordihydroguaiaretic acid (NDGA) on apop-tosis in human malignant glioma cell line SHG-44. Methods: Cell growth inhibition was measured with MTT assay. Cell apoptosis was observed with light and electron microscopy and TUNEL. Expression of bcl-2 gene was measured with immunohistochemistry, in situ hybridization and image analyses. Results: NDGA at the concentration of 100 μmol/L inhibited the proliferation of SHG-44 cells and induced apoptosis in a time-de-pendent manner. The expression of Bcl-2 protein in SHG-44 cells was decreased in the present of 100 μmol/L NDGA along with the duration of treatment in a negative correlation with the degree of cell apoptosis. The bcl-2 mRNA expressed in SHG-44 cells was reduced after treatment with 100 μmol/L NDGA, apparently consistent with the immunohistochemical results. Conclusion.- NDGA can induce apoptosis of human malig-nant glioma cells probably by down-regulating expression of bcl-2 gene, though the exact mechanism needs further study.     

芳香化酶对胶质瘤细胞系SHG-44细胞生长及分化的作用

目的 在人胶质母细胞瘤细胞系SHG－44细胞中检测到芳香化酶细胞色素P450（AROM）表达的基础上探讨AROM对胶质瘤细胞生长增殖及分化的作用。方法 通过构建反义AROM真核表达载体，转染SHG－44细胞，利用流式细胞仪、MTT法、免疫荧光染色及激光共聚焦扫描显微镜（CLSM）等技术观察封闭AROM基因表达后细胞生长曲线、细胞周期及中间丝蛋白GFAP和Vimentin表达的变化。结果 成功构建了反义AROM真核表达载体PCI／as-AROM并使AROM的表达封闭达50％以上。SHG－44细胞在转 染了PCI／as-AROM和空载体PCI－neo后，生长曲线、细胞周期无明显变化，但GFAP免疫荧光强度减弱而Vimentin免疫荧光强度增强。结论 反光AROM可能对SHG－44细胞增殖无明显影响但对神经胶质瘤细胞的分化有一定的抑制作用。     

神经调节蛋白2高表达于不同级别胶质瘤组织并通过Akt信号调控胶质瘤细胞GFAP表达

目的 探讨神经调节蛋白2（NRG2）在胶质瘤中的表达及其在胶质瘤发生发展中的作用。方法 通过GEPIA数据库比较分析与人正常对照组相比,低级别胶质瘤（LGG,n=518）和胶质母细胞瘤（GBM,n=163）样本中NRG2和GFAP基因表达水平变化,并分析LGG和GBM样本中两个分子与患者生存率的关系,以及两个分子表达相关性。获取人胶质瘤组织芯片样本,包含癌旁正常组织10个、LGG组织48个、GBM组织20个;使用免疫组织化学染色观察不同级别人胶质瘤组织芯片样本中NRG2表达水平变化情况,并使用免疫荧光双标法观察NRG2与GFAP的共定位情况。采用Western blot检测Akt抑制剂Perifosine对NRG2调控GFAP表达的影响。结果 NRG2在LGG和GBM样本中均存在高表达,以LGG较为显著（P<0.01）。GBM样本中, 低NRG2水平患者的总体生存率在30月之后略高于高NRG2水平患者。 在LGG样本中,NRG2与GFAP基因表达水平呈负相关（P<0.01）,而在GBM样本中则呈正相关（P<0.01）。免疫荧光染色显示LGG样本中NRG2与GFAP多共定位于同一肿瘤细胞,而在GBM样本中则多表达于不同肿瘤细胞。NRG2促进U-87 MG胶质母细胞瘤细胞中GFAP表达,该作用可被Akt抑制剂Perifosine显著抑制（P<0.01）。结论 NRG2可高表达于不同级别胶质瘤组织中,可能部分通过Akt信号调控胶质瘤细胞GFAP表达,影响患者生存率。