大鼠脐血来源血管内皮细胞的制备和鉴定

目的 研究大鼠脐血来源的单个核细胞体外诱导为血管内皮细胞(VECs)的可能性.方法 分离大鼠脐血单个核细胞,血管内皮诱导液(添加10%胎牛血清,1%青霉素,1%链霉素,VEGF20μg/L,IGF-12μg/L,bFGF2μg/L,EGF20μg/L)培养分化,于3、6周进行免疫荧光染色检测贴壁细胞CD34、CD133、vWF表面标志.结果 培养3周单个核细胞CD34、CD133、vwF抗体免疫荧光检测均为阳性;6周免疫荧光染色可见CD34、vWF组为阳性,CD133组部分为阳性,阴性对照组未发现阳性细胞.结论 大鼠脐血来源的单个核细胞在体外诱导3周可以分化为EPCs,6周部分细胞分化为VECs.     

大鼠乳鼠腹主动脉血管内皮细胞的培养与鉴定

目的：研究大鼠乳鼠腹主动脉血管内皮细胞的培养与鉴定方法。方法：取出生5~7d左右的大鼠乳鼠的腹主动脉血管,用组织块法在含20%胎牛血清及内皮细胞生长添加剂和肝素的DMEM培养基中培养,倒置相差显微镜观察内皮细胞形态和生长特征,免疫荧光方法进行血管内皮细胞Tie2相关抗原的鉴定。结果：来自于大鼠乳鼠腹主动脉的血管内皮细胞在改良的培养基中进行体外培养,能够保持增殖和传代的能力,且Tie2抗原鉴定呈阳性。结论：成功分离大鼠乳鼠腹主动脉组织并且获得体外原代培养大鼠乳鼠腹主动脉内皮细胞。用组织培养方法可以获得较满意的血管内皮细胞。     

大鼠星形胶质细胞培养方法的改进

目的 改进星形胶质细胞的体外纯化培养方法,为研究星形胶质细胞的生物学功能提供实验模型.方法 采用新生 SD大鼠,无菌操作取其大脑皮质,用0.025%的胰酶吹打消化成单个细胞,替代传统的0.25%的胰酶水浴消化15 min,单个细胞悬液接种于预先包被好PDL的24孔板或25 cm2的细胞培养瓶中,体外培养9~14天至细胞完全融合并铺满瓶底后进行传代.第2代细胞应用抗GFAP的抗体进行免疫荧光染色来鉴定星形胶质细胞的纯度.结果 免疫荧光染色结果显示这种培养方法分离培养出的星形胶质细胞纯度达到90%以上.结论 采用本实验改进的方法,培养的大鼠星形胶质细胞纯度高、生长状态良好,符合体外研究要求.     

大鼠肾小球系膜细胞原代培养与鉴定

目的: 原代培养及鉴定大鼠肾小球系膜细胞(GMC),探索分离、培养GMC的最佳条件.方法: 对大鼠双肾灌洗后,筛网滤过分离肾小球,并用Ⅳ型胶原酶消化处理,然后种植法体外培养大鼠肾小球.同时采用免疫细胞化学和免疫荧光技术,检测亚代GMC的α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、波形蛋白(Vimentin)、细胞角蛋白(Cytokeratin)、Ⅷ因子相关抗原抗体的表达,鉴定GMC,并绘制其生长曲线.结果: 种植4 d后,约80%肾小球贴壁,可见卵圆形上皮细胞生长,18 d左右镜下细胞多呈星状或三角形并伴有不规则的突起,21 d后细胞生长密集, 细胞团簇之间形成网络.免疫细胞化学和免疫荧光证实抗α-SMA及抗Vimentin染色阳性,而抗Cytokeratin、抗Ⅷ因子抗体染色为阴性.GMC亚代倍增时间为4 d. 结论: 结果表明,用改良的培养方法成功率高,培养的细胞为大鼠肾小球系膜细胞.     

α7-nAChR在海马星形胶质细胞上的表达

目的 探讨α7-nAChR亚基在体内、体外海马星形胶质细胞上的表达.方法 从大鼠脑中分离海马后进行冰冻切片,采用免疫荧光双染技术,首先用抗-GFAP抗体对星形胶质细胞进行鉴定,再观察α7-nAChR在星形胶质细胞上的表达.体外表达的研究在培养星形胶质细胞上进行,先分离获得新生SD大鼠的海马组织,提取并培养海马星形胶质细胞,纯化鉴定后,用配体结合实验和细胞免疫荧光双标分析α7-nAChR在星形胶质细胞上的表达.结果 海马组织中抗-GFAP染色阳性的细胞抗-α7-nAChR染色也呈阳性,但仅部分抗-α7-nAChR染色阳性的细胞抗-GFAP染色也呈阳性.体外纯化后的星形胶质细胞既能与FITC标记的α-BTX结合,荧光染色呈阳性,同时,细胞免疫荧光双标分析显示星形胶质细胞抗-GFAP和抗-α7-nAChR染色均呈阳性.结论 α7-nAChR在体内体外星形胶质细胞上均能正常表达.     

大鼠股动脉血管原代内皮细胞的分离与培养

目的 体外分离、培养并鉴定大鼠股动脉血管原代内皮细胞,为相对较小血管来源的原代内皮细胞功能研究提供细胞模型.方法 无菌取大鼠股动脉血管,胶原酶消化大鼠股动脉血管内皮细胞使其分离,流式细胞术检测内皮细胞纯度;流式分选出CD31阳性细胞,并用激光共聚焦鉴定内皮细胞;以CCK-8法、高内涵细胞成像法检测内皮细胞增殖能力,以Transwell法、Matrigel胶法检测其迁移和成管功能.结果 胶原酶消化分离所得股动脉血管原代内皮细胞在14～16 d细胞覆盖培养瓶面积的2/3以上,细胞呈现典型铺路石状.流式检测其纯度为38.34％,分选后利用CD31进行荧光染色鉴定,细胞均为CD31阳性;PGE2可显著上调CD31阳性内皮细胞增殖、迁移、成管功能.结论 该研究采用简便的方法成功分离得到股动脉血管原代内皮细胞,为研究相对较小血管来源的原代内皮细胞功能提供体外细胞模型.     

大鼠主动脉内皮细胞的贴壁法培养

为建立大鼠主动脉内皮细胞的培养方法,分离大鼠主动脉,采用组织块贴壁法进行内皮细胞原代培养并纯化传代,用免疫组织化学(SABC)法鉴定CD31抗原。结果,大鼠主动脉内皮细胞呈梭形或多角形,形成单层后,呈典型的鹅卵石样或铺路石样排列,并产生接触抑制现象。抗CD31抗原免疫组织化学法染色呈阳性。结论,大鼠内皮细胞贴壁培养法较简便经济。     

肾小球系膜细胞的分离和培养

目的分离、培养和鉴定正常人肾小球系膜细胞。方法筛网滤过分离正常人肾小球系膜细胞,同时采用免疫荧光技术,利用异硫氰酸荧光素(FITC)间接标记单克隆抗体:抗Ⅷ因子相关抗原抗体、抗结蛋白抗体、抗角蛋白抗体、抗细胞角蛋白抗体、抗Ⅳ型胶原抗体、抗纤维连接蛋白抗体、抗层粘连蛋白抗体对系膜细胞特有的中间微丝进行鉴定。并采用同期培养的同一来源的肾小球内皮细胞作对照。结果抗Ⅷ因子相关抗原、抗角蛋白和抗细胞角蛋白抗体表达均为阴性,而抗结蛋白抗体、抗Ⅳ型胶原抗体、抗纤维连接蛋白抗体、抗层粘连蛋白抗体为阳性,说明培养的细胞为系膜细胞。结论该种方法分离培养的细胞经过免疫荧光染色鉴定为肾小球系膜细胞。     

大鼠胸主动脉内皮细胞培养方法的改进

目的：建立一种简单易行的SD大鼠胸主动脉的内皮细胞培养方法。方法：分离大鼠胸主动脉,清除血管外结缔组织,将其剪成厚约1.5mm的血管环,以15-20个血管环密度接种于25 cm^2培养瓶中,以含20%胎牛血清的DMEM液培养,60h后去掉血管环。待细胞生长达单层融合时,消化传代。对P2代细胞应用抗Ⅷ因子抗体进行鉴定。结果：60h后,细胞呈集落样散在分布于瓶底;7-9d细胞汇合成单层,呈铺路石状。经Ⅷ因子相关抗原免疫组化鉴定,所培养细胞为内皮细胞。结论：血管环贴壁法培养SD大鼠胸主动脉内皮细胞简易可行。     

肾小球系膜细胞的分离和培养

目的 分离、培养和鉴定正常人肾小球系膜细胞。方法 筛网滤过分离正常人肾小球系膜细胞，同时采用免疫荧光技术，利用异硫氰酸荧光素(FITC)间接标记单克隆抗体；抗Ⅷ因子相关抗原抗体、抗结蛋白抗体、抗角蛋白抗体、抗细胞角蛋白抗体、抗Ⅳ型胶原抗体、抗纤维连接蛋白抗体、抗层粘连蛋白抗体对系膜细胞特有的中间微丝进行鉴定。并采用同期培养的同一来源的肾小球内皮细胞作对照。结果 抗Ⅷ因子相关抗原、抗角蛋白和抗细胞角蛋白抗体表达均为阴性，而抗结蛋白抗体、抗Ⅳ型胶原抗体、抗纤维连接蛋白抗体、抗层粘连蛋白抗体为阳性，说明培养的细胞为系膜细胞。结论 该种方法分离培养的细胞经过免疫荧光染色鉴定为肾小球系膜细胞。     

体外转染SV40 T抗原对鼠内皮细胞周期素D1、P53和P21表达的影响

目的:探讨SV40 T抗原促进鼠内皮细胞增殖动力改变的机制,为基因治疗转化细胞提供理论依据。方法:用含有SV40 T抗原的表达质粒(pRNS-1)转染大鼠主动脉内皮细胞,经G418加压筛选,获得阳性克隆后扩增培养。在光镜下观察转染前后细胞的形态和生长特性;流式细胞仪检测细胞增殖周期;PCR检测外源基因的整合;免疫组化蛋白水平检测SV40 T抗原的表达;Western blot检测周期素(Cyclin)D1、P53和P21的表达。结果:转染后的鼠内皮细胞体外生存期延长,大量细胞由G1期进入S期,对血清和生长因子的依赖性降低。与转染前的细胞相比,转染后的鼠内皮细胞表达更多的P53和Cyclin D1,P21表达量降低。结论:SV40 T抗原可能通过调节Cyclin D1、P53和P21的表达来影响鼠内皮细胞的增殖。     

丹皮酚对ox-LDL诱导的大鼠血管内皮细胞黏附功能的抑制作用

目的:研究氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)对体外培养的大鼠单核细胞(MC)与大鼠主动脉内皮细胞(RAECs)黏附的影响及丹皮酚(Pae)含药血清对其的抑制作用.方法:制备Pae含药血清并用RP-HPLC测定血清中Pae含量;改良沉淀法分离大鼠血清低密度脂蛋白(LDL),Cu2 氧化制备ox-LDL;组织块预消化贴壁法培养RAECs;大鼠淋巴细胞分离液分离单核细胞;孟加拉玫瑰红活细胞染色法测定MC与RAECs的黏附功能.结果:ox-LDL在25～400 mg/L时呈剂量依赖性地诱导MC与RAECs的黏附,100 mg/L时促MC与RAECs黏附达最大值;ox-LDL与RAECs共育1 h即可明显促进黏附作用,3 h时达最大诱导效应.Pae含药血清在浓度为1.8～4.2 mg/L时,呈剂量依赖性地抑制ox-LDL诱导的黏附作用;4.2 mg/L孵育24 h时抑制作用最明显.结论:Pae对ox-LDL诱导的大鼠MC与RAECs黏附功能有抑制效应,Pae对ox-LDL介导的血管内皮细胞炎症环节的影响是其抗AS的作用机制之一.     

丹皮酚对高脂血清诱导的大鼠主动脉内皮细胞损伤的保护作用及其黏附功能的影响

目的观察丹皮酚（Paeonal,Pae）对高脂血清诱导的大鼠单核细胞（mononuclear cell,MC）与大鼠主动脉内皮细胞（rat aortic endothelial cells,RAECs）黏附的影响及对RAECs损伤的保护作用。方法高脂乳剂灌胃大鼠并制备高脂血清;组织块预消化贴壁法培养RAECs;淋巴细胞分离液分离MC;孟加拉玫瑰红活细胞染色法测定MC与RAECs的黏附功能;甲基噻唑基四唑比色法以及台盼蓝死细胞染色法检测Pae对高脂血清诱导的RAECs损伤的保护作用。结果30～70ml／L高脂血清呈剂量依赖性地诱导MC与RAECs的黏附,50ml／L时促进MC与RAECs黏附达最大值;高脂血清与RAECs共育6h即可明显促进黏附作用,24h时达最大诱导效应。Pae在浓度为15～240μmol／L时,呈剂量依赖性地抑制高脂血清诱导的黏附作用;240μmol／L孵育24h时抑制作用最明显;Pae在30,60,120μmol／L浓度时,对高脂血清损伤的大鼠RAECs有明显的保护作用。结论Pae对高脂血清诱导的大鼠MC与RAECs黏附功能有抑制效应,对高脂血清损伤的大鼠RAECs有明显的保护作用。     

组织块结合酶消化法培养婴幼儿血管瘤内皮细胞

目的:探讨血管瘤内皮细胞体外培养的方法并观察其生物学特性。方法:收集新鲜手术切除的婴幼儿血管瘤标本,采用组织块结合酶消化法培养内皮细胞,免疫组化EnVision法对培养的细胞进行鉴定;流式细胞仪FITC-CD34检测内皮细胞纯度;相差显微镜下观察血管瘤内皮细胞的生物学特性。结果:共收集血管瘤标本14例,有8例成功培养出内皮细胞,内皮细胞呈现两种形态:多角形和梭形,经免疫组化鉴定为内皮细胞;培养的细胞中CD34＋细胞数为76.28%;血管瘤内皮细胞有明显的“管腔形成”。结论:组织块结合酶消化法能成功培养较纯的婴幼儿血管瘤内皮细胞,培养的内皮细胞具有某些生物学特性。     

酸性成纤维细胞生长因子促血管内皮细胞增殖作用的实验研究

目的　探讨不同浓度的aFGF对体外培养的大鼠主动脉内皮细胞生长的影响。方法　通过组织块培养法获取主动脉内皮细胞。将浓度为 5ng/ml,10ng/ml,2 0ng/ml的aFGF分别加入内皮细胞的培养液中作为实验组(Ⅰ～Ⅲ组 ) ,不加aFGF的组作为对照组。分别在 2 4h、48h和 72h应用MTT法进行细胞计数。结果　从大鼠主动脉成功地获取了内皮细胞。 3天内 ,实验组和对照组的主动脉内皮细胞都有不同程度的增殖 :培养 2 4h ,实验各组与对照组比较P >0 .0 5 ,无统计学差异 ;48h和 72h时 ,Ⅱ、Ⅲ组与对照组以及与Ⅰ组两两比较 ,有非常显著的差异 (P <0 .0 0 1) ;各时间段内 ,Ⅰ组与对照组 ,Ⅲ组与Ⅱ组比较 ,细胞数改变未见差异 (P >0 .0 5 )。结论　一定浓度的aFGF有非常明显的促血管内皮细胞生长的作用 ,可能对缺血性心脏病的促血管形成治疗有较大的帮助。     

猪外周血内皮祖细胞的分离培养及生物学特性

目的从小型猪外周血中分离、培养内皮祖细胞(EPCs),并进行相关鉴定,分析其生物学特性。方法采用密度梯度离心法获得小型猪外周血单个核细胞并进行体外传代培养,分别采用倒置相差显微镜观察、免疫荧光染色、流式细胞仪分析及Matrigel实验和DiI-acLDL摄取实验,对其细胞表型及功能进行相关鉴定。结果外周血单个核细胞在培养过程中出现梭形贴壁和铺路石样形态;培养第14天,约80%的细胞DiI-acLDL吞噬实验阳性,且CD133、CD34、flk-1、CD31、CD144的表达阳性率分别达到25.1%、55.9%、97.7%、82.0%和95.4%;细胞培养于凝固的Matrigel表面7 d后,形成特征性的网格状结构。结论该实验成功从小型猪外周血单个核细胞中分离培养出EPCs,在其体外扩增诱导的过程中,表达EPCs和成熟内皮细胞的特征性标志。     

大鼠胎肝干细胞的体外分离、培养与鉴定

目的：体外分离、培养原代大鼠胎肝干细胞(HSCs),并对其生物学特性进行鉴定。方法：采用胶原酶灌注法及剪碎消化法分离大鼠胎肝干细胞，并用含10％优等胎牛血清的H-DMEM培养液培养。利用免疫细胞化学方法在激光共聚焦扫描显微镜下观察该细胞表面抗原的表达情况，进行鉴定。结果：分离的大鼠胎肝干细胞体外培养24 h贴壁，5 d左右可长成单层,光镜下为致密圆形细胞,边缘清楚。8 d后细胞铺展，呈上皮样，表达甲胎蛋白（AFP）抗原、细胞角蛋白（CK）18、细胞角蛋白（CK）19。结论：分离并鉴定为大鼠胎肝干细胞可在体外培养条件下迅速扩增。     

人循环内皮祖细胞的分离培养和诱导分化

目的研究人循环内皮祖细胞（EPCs）分离、培养、分化及鉴定。方法采用Ficoll密度梯度离心法从人外周血中分离单个核细胞,接种于含血管内皮生长因子（VEGF）及优质胎牛血清的M199培养液中,对其进行体外诱导分化培养,以免疫组化、细胞荧光化学法及流式细胞检测法鉴定贴壁细胞的内皮细胞特异性标志。结果人外周血单个核细胞（MNCs）经体外培养,表达内皮细胞的特异性抗原,包括VWF、CD31和CD34,并显示出能内吞乙酰化低密度脂蛋白（ac-LDL）,结合UE小1等内皮细胞特性,提示这些细胞具有内皮细胞的表面蛋白特性和具有内皮细胞功能。结论人外周血中存在具有分化增殖能力的EPCs,在一定培养条件下可分化为血管内皮细胞。     

碱性成纤维细胞生长因子对三维培养内皮细胞血管样结构形成的作用研究

目的 :观察碱性成纤维细胞生长因子 (basicfibroblastgrowthfactor,bFGF)对三维培养内皮细胞血管样结构形成的作用。方法 :实验分为两组 ,即加入浓度 2 0ng·ml-1bFGF的bFGF组及不加bFGF的对照组。采用Pepper等介绍的三维培养胶原基质配制及细胞培养方法制作标本 ,透射电子显微镜下观察结果。 结果 :对照组内皮细胞在胶的表面呈单层生长 ,未见其向深层生长及管腔结构形成。bFGF组内皮细胞在胶内呈多层浸润生长 ,伸展、变形呈扁平状 ;内皮细胞与胶原纤维之间可见半桥粒结构 ,内皮细胞之间以桥粒连接 ,形成毛细血管样管腔结构 ;在形成管状结构的内皮细胞中可见空泡样变 ,边界由胞质与胞膜组成 ,细胞核变形 ,凹陷 ,可见切迹 ,或呈薄片状 ;内皮细胞游离面有微绒毛突起。结论 :三维培养技术简单易行 ,是揭示在体血管形成的最简单模型 ;bFGF有利于三维培养内皮细胞在有展性的胶原基质面形成血管样结构。     

Differences in the primary culture, purification and biological characteristics between endothelial cells and smooth muscle cells from rat aorta

Objective: To investigate the differences of primary culture, purification and biological characteristics between endothelial cells and smooth muscle cells from rat aorta. Methods: Endothelial cells were obtained using the vascular ring adherence, collagenase digestion method and an improved vascular ring adherence method, while smooth muscle cells were separated from tissue sections of rat aorta. Clones of endothelial cells were selected by limiting dilution assay. Both cell types were identified using specific cell immunofluorescent markers,and phase contrast microscopy was used to observe the morphological disparity between endothelial cells and smooth muscle cells at the single cell and colony level. Cell proliferation was determined by the cell counting kit-8. Differences between endothelial cells and smooth muscle cells were evaluated in trypsin digestion 6me, attachment time and recovery after cryopreservation. Results: Endothelial cells were obtained by all three methods. The improved vascular ring method provided the most reproducible results. Cells were in good condition, and of high purity. Smooth muscle cells were cultured successfully by the tissue fragment culture method. Clonal expansion of singleendothelial cells was attained. The two cell types expressed their respective specific markers, and the rate of proliferation of smooth muscle cells exceeded that of endothelial cells. Endothelial cells were more sensitive to trypsin digestion than smooth muscle cells. In addition, they had a shorter adherence time and better recovery following cryopreservation than smooth muscle cells. Conclusion: The improved vascular ring method was optimal for yielding endothelial cells. Limiting dilution is a novel and valid method for purifying primary endothelial cells from rat aorta. Primary rat endothelial cell and vascular smooth muscle cell cultures exhibited different morphological characteristics, proliferation rate, adherence time, susceptibility to trypsin digestion and recovery after cryopreservation. Our research can be a good foundation for further application in the regeneration of blood vessel.