血吸虫极低密度脂连结蛋白的表达及免疫原性鉴定

目的：在大肠杆菌中表达日本血吸虫特异性极低密度脂连结蛋白(SVLBP)，纯化并鉴定其免疫活性。方法：SVLBP基因克隆菌在IPTG诱导下大肠杆菌中以6个组氨酸融合蛋白形式大量表达；非变性条件下制备克隆菌裂解液，离心后上演液经凝胶亲和层析纯化重组蛋白，已纯化的重组SSVLBP免疫家兔制备特异性抗血清，用SDS—PAGE和Western blot鉴定其免疫活性。结果：克隆菌在IPIG诱导下能大量表达重组蛋白SVLBP；重组SSVLBP蛋白能诱导家兔产生单特异抗体，琼脂双扩散法测抗体滴度＞1：16；表达产物能与血吸虫病人血清反应；单特异抗血清能识别天然成虫可溶性膜抗原的单一蛋白。结论：SVLBP能在克隆菌中大量表达并且具有较好的免疫原性。     

重组Calpain蛋白诱导抗体产生及检测日本血吸虫感染的研究

目的 研究在大肠杆菌中表达的日本血吸虫Calpain蛋白的免疫原性及其在日本血吸虫病诊断上的应用。方 法用重组Calpain蛋白免疫BALB／c小鼠，ELISA法测定特异性IgG抗体的动态变化及其IgG亚型(IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3)产生特征；同时用重组Calpain蛋白作为诊断抗原，粪检血吸虫病阳性患者血清作为一抗，肝吸虫阳性患者血清作为考核交叉反应血清。结果 重组Calpain抗原免疫小鼠后，产生了一个极高的抗Calpain特异性抗体，免疫4周IgG类抗体达到高峰，与对照组鼠相比较免疫鼠血清中IgG1，IgG2a，IgG2b特异性抗体也显著上升；Calpain重组抗原血清检测日本血吸虫和粪检的符合率为100％，粪检阳性EPG低的个体抗Calpain抗体滴度高，EPG高的患者抗Calpain抗体滴度反而低，与肝吸虫的交叉反应率为37％。结论 日本血吸虫Calpain是一个具有免疫原性的蛋白，能够激发宿主产生高水平的免疫球蛋白，能够敏感地测定日本血吸虫的感染，提示Calpain可以发展成为日本血吸虫病的诊断抗原和日本血吸虫疫苗候选分子。     

金标免疫渗滤法（DIGFA）快速检测血吸虫循环抗原的研究

目的建立一种简便、快速的血吸虫病诊断方法。方法在已建立的检测血吸虫抗体的DIGPA基础上，以抗血吸虫重组蛋白SVLBP多抗为捕捉抗体，金标抗SEA多抗为覆盖抗体，建立快速检测病人血清中血吸虫循环抗原的双夹心DIGFA。结果用该法检测了急性血吸虫病病人血清30人份和慢性血吸虫病病人血清38人份，其阳性检出率分别为100％和52．6％；120人份流行区健康人血清全为阴性；100人份非流行区健康人群血清的阴性符合率为100％，与10例华支睾吸虫病病人血清无交叉反应；15例肺吸虫病病人血清有1例阳性，交叉反应率为6．7％；与双夹心ELISA的符合率为97.4％，经x^2检验表明两法检测效果无显著性差异。结论用DIGFA检测血吸虫循环抗原具有较高的敏感性和特异性，并且方法简便、快速、不需特殊仪器设备，有广阔的应用前景。     

日本血吸虫Mr为8000钙结合蛋白基因的表达及其融合蛋白免疫反应性的评价

目的 将亚克隆在pET32a( )质粒上的日本血吸虫Mr为8000钙结合蛋白(calcium-binding protein，CBP)基因进行表达及蛋白纯化。并对表达产物用Westem blotting及ELISA方法进行免疫反应性的评价。方法 将重组表达质粒pET328( )-CBP转化人宿主菌BL2l中，IPTG诱导表达后超声裂菌，离心后取上清进行SDS-PAGE，观察融合蛋白的表达情况；用金属Ni鏊合物亲和层析树脂(Ni-NTA)柱子纯化目标蛋白；将SDS-PAGE后的蛋白从凝胶转移到聚氟乙烯膜上，分别用6-组氨酸(6-His)抗体、日本血吸虫尾蚴感染6周的兔血清及紫外照射减毒尾蚴免疫的兔血清作一抗进行免疫印迹，将纯化后的融合蛋白作为包被抗原，ELISA法检测正常兔血清及感染兔血清，对该蛋白的免疫反应性作出评价。结果 重组菌株用IPTG诱导后于Mr=29000处有一表达条带，该蛋白与硫氧还蛋白融合表达，带有6-His基团，用抗6-His抗体做免疫印迹有特异性的反应条带，而用尾蚴感染兔血清及紫外照射减毒尾蚴免疫的兔血清做免疫印迹都没有特异性的目标反应带出现，ELISA的结果显示该蛋白与血吸虫感染兔血清没有免疫反应性。结论 CBP蛋白与硫氧还蛋白融合表达后为可溶性蛋白且相对分子质量约为29000，该蛋白与尾蚴感染兔血清及紫外照射减毒尾蚴免疫的兔血清均无免疫反应性，这可能与该蛋白为尾蚴期特异性抗原有关。     

日本血吸虫重组信号蛋白14-3-3对日本血吸虫病的诊断价值

目的 探讨纯化的日本血吸虫(中国大陆株)重组信号蛋白14—3—3(rSjl4—3—3)诊断血吸虫病的价值。方法 利用纯化的rSjl4—3—3抗原与成虫抗原，间接EUSA法检测急、慢性日本血吸虫病患者血清。结果 急、慢性血吸虫患者血清rSjl4—3—3抗体检出率为100％和92．0％，与正常人血清未出现交叉反应；抗AWA抗体检出率为98．0％和94．0％，与正常人有7．3％的交叉反应。结论 rSjl4—3—3为抗原诊断日本血吸虫病显示出高度的敏感性和特异性，具有实用价值。     

间日疟原虫MSP1 C重组蛋白的制备及其在血清学诊断中的应用

目的在大肠埃希菌（E，coli）中表达、纯化间日疟原虫裂殖子表面蛋1C端重组蛋白（rGST—PvMSP1C）作为诊断抗原，评价其在间日疟血清学诊断中的应用价值。方法将含有重组质粒pGEX-4T-2／PvMSP1C的工程菌E．coil BL21（DE3）以IPTG进行诱导表达，表达产物以SDS—PAGE与Western—blot免疫印迹进行鉴定；采用GST融合蛋白层析柱进行分离纯化；以纯化重组蛋白包被酶标板，酶联免疫吸附试验（ELISA）检测间日疟患者血清中的特异性IgG抗体。结果含有重组质粒pGEX-4T-2／PvMSP1C工程菌经IPTG诱导表达的rGST—PvMSP1C重组蛋白大小约63ku，能够被间日疟患者的血清所识别。纯化的重组蛋白SDS—PAGE电泳显示一条预期大小的蛋白条带；以重组蛋白作诊断抗原，67份镜检阳性的间日患者血清标本ELISA均为阳性。55份健康人血清ELISA均为阴性．5份恶性疟患者血清及7份血吸虫患者血清检测结果亦为阴性。结论在大肠埃希菌中表达纯化的间日疟原虫rGST—PvMSP1C蛋白具有免疫反应性，以其作为诊断抗原建立的血清中特异性IgG抗体ELISA检测方法具有良好敏感性和特异性，在间日疟的免疫学诊断中具有一定的推广使用价值。     

SARS冠状病毒M基因片断在大肠杆菌中表达及其抗原性的研究

目的：获得纯的重组SARSCoV M蛋白，并初步测定重组蛋白的抗原性。方法：软件分析SARSCoV M蛋白富含免疫表位的片断，体外合成编码SARSCoV M蛋白15．170aa序列的DNA片段，利用DNA重组技术，将该合成DNA克隆至表达载体pGEX-5X-1，构建重组质粒pGEX．SARSCoV M。在大肠杆菌BL2l中诱导表达GST-SARSCoV M重组融合蛋白，分离纯化GST-SARSCoV M蛋白，利用纯化蛋白作为抗原，建立ELISA试验检测抗SARSCoV M抗体。结果：GST-SARSCoV M蛋白分子量为43kD，纯化的GST-SARSCoV M蛋白作为抗原检测血清中SARSCoV M抗体，53例正常成人献血者血清未检出SARSCoV M抗体。结论：SARSCoV M蛋白表达成功，在健康人血清中未检出SARSCoV M抗体。     

鲍曼不动杆菌外膜蛋白CarO的原核表达、纯化和多克隆抗体的制备

目的 表达和纯化带多聚组氨酸(6×His)标签的鲍曼不动杆菌杆菌外膜蛋白Caro(-binding protein)融合蛋白并制备抗Caro多克隆抗体,为研究临床鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗生素耐药机制奠定基础.方法 构建pET23d-CarO重组表达质粒,转入大肠埃希菌BL21(DE3),以IPTG诱导6×His-CarO融合蛋白表达,经镍离子金属螯合树脂纯化后,用纯化出的蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,Western印迹检测多克隆抗体的特异性.结果 在大肠埃希菌中诱导出高水平表达的His-CarO融合蛋白,经亲和树脂纯化后免疫新西兰大白兔,获得了高特异性的抗CarO抗血清.结论 成功构建pET23d-CarO原核表达质粒,表达并纯化出目标蛋白,制备出高特异性的多克隆抗体.     

日本血吸虫P7蛋白基因免疫诊断价值的初步研究

目的为了寻找血吸虫病新的免疫学诊断候选分子,在大肠杆菌中克隆、表达日本血吸虫(Sj P7)蛋白,建立纯化重组抗原间接ELISA方法(r Sj P7-ELISA)诊断日本血吸虫病。方法设计引物,用PCR法扩增出日本血吸虫P7样蛋白基因编码基因序列,T载体连接,再将其亚克隆入p ET28a(+)表达载体中,经酶切、测序证实正确后,用IPTG对该重组菌诱导表达,SDS-PAGE和Western blot验证表达量和免疫活性。结果 PCR法扩增出一条大小约为423 bp大小的Sj P7样蛋白的DNA片断,将其克隆亚表达质粒p ET28a(+),测序证实具有完整的ORF。结论日本血吸虫P7蛋白在血吸虫病免疫诊断上具有较大的应用潜能。     

乙型肝炎病毒S基因片段的克隆及其原核表达的实验研究

目的：获得adw亚型乙肝病毒表面抗原S基因在原核中的克隆和表达，经家兔免疫后产生抗-HBs抗体。方法：从乙型肝炎病人血清中提取HBV DNA后扩增出501bp的核苷酸片段，经纯化限制性内切酶(BamH Ⅰ和HindⅢ)切后，分别与PUC19和pGEME^XM—1载体连接后转化入宿主菌JM109中和BL21，重组质粒经蓝／白斑，筛选、PCR鉴定、酶切鉴定，序列分析得到阳性重组质粒pGE-S。通过IPTG诱导在大肠杆菌BL21中表达出重组抗原，重组抗原免疫家兔后，用ELISA法在血清中检测到抗-HBs的存在。结果：HBV DNA经扩增得到501bp的核苷酸片段，与质粒重组后形成的重组质粒，在IPTG诱导形成重组抗原，重组抗原两次免疫家兔后的血清抗体阳性率比较，差别有显著性(X^2=0．25，P≤0．05)。     

人精子蛋白FSCB的表达、纯化和多克隆抗体制备

目的：构建表达重组人精子蛋白FSCB的重组质粒,获得其纯化重组蛋白并制备其多克隆抗体.方法：分别成功构建了表达人精子全长FSCB蛋白和截短FSCB（FSCBt）蛋白的重组菌株BL21,IPTG诱导表达,镍柱亲和层析法和分子筛层析法纯化目的蛋白FSCBt,免疫接种雌性家兔制备多克隆抗体.结果：重组菌成功诱导表达了重组蛋白FSCB和FSCBt,相对表观分子量分别为230000和30000,重组蛋白FSCBt经纯化后纯度达到95%,制备的多克隆抗体效价达到1∶105,Western Blot显示多克隆抗体与重组蛋白FSCB和FSCBt均具有良好的反应性.结论：人精子蛋白FSCB在重组菌株中得到表达,成功制备高效价的多克隆抗体,为进一步研究该蛋白在人体组织中的表达、分布以及生物学功能奠定了实验基础.     

蛋白激酶SGK2α在大肠杆菌中的表达纯化及抗体制备

目的 该研究通过SGKα基因的克隆、原核蛋白表达以及纯化,制备抗SGK2α抗体,为进一步研究SGK2α蛋白的生物学功能奠定基础.方法 利用原核表达载体PGEX-4T-3构建重组质粒,并在大肠杆菌中通过IPTG诱导表达;亲和层析法纯化重组蛋白:以纯化的重组蛋白为抗原免疫新西兰大耳白兔制备抗SGK2α多克隆抗体,ELISA方法检测抗体效价,免疫印迹法检测抗体的特异性.结果 构建了PGEX-4T-3-SGK2α原核表达质粒,经原核表达和亲和层析获得GST-SGK2α融合蛋白,蛋白纯度在90%以上;利用GST-SGK2α融合蛋白制备多克隆抗体,抗体效价阳性且具有较强的特异性.结论 利用原核表达的GST-SGK2α融合蛋白成功地制备了抗SGK2α多克隆抗体,可用于免疫组织化学和免疫印迹检测以及功能研究.     

兔抗破骨细胞蛋白质酪氨酸磷酸酶多克隆抗体的制备和应用

目的：采用已构建的pET28a-ΔPTP-oc重组质粒纯化重组蛋白,制备兔抗破骨细胞蛋白质酪氨酸磷酸酶（PTP-oc）多克隆抗体并鉴定其性能。方法：将构建的pET28a-ΔPTP-oc重组质粒转化至BL21（DE3）中,应用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导重组蛋白表达。表达产物经过Q柱阴阳离子交换和Ni柱亲和层析获得纯化的PTP-oc重组蛋白,将纯化的重组蛋白作为抗原免疫家兔,获得PTP-oc多克隆抗体。采用间接ELISA法检测抗体效价,Western blotting法检测抗体的特异性。结果：成功纯化出PTP-oc重组蛋白。间接ELISA法检测,采用纯化诱导后的重组蛋白免疫家兔获得了兔抗PTP-oc多克隆抗体,多克隆抗体效价达1∶32000以上,Western blotting法检测,所得多克隆抗体有较高的特异性。结论：成功纯化了PTP-oc重组蛋白,制备出PTP-oc多克隆抗体。     

结核分枝杆菌esat6基因原核表达载体的构建和表达

目的：构建结核分枝杆菌(MTb)esat6基因原核表达载体并进行表达。方法：PCR扩增MTbeast6基因，克隆入pQE30质粒，测序正确后，再亚克隆入pET32a( )质粒，构建PQE30—ESAT6和PET32a( )—ESAT6重组体。结果：重组体分别转化DH5α和BL21(DE3)菌后，经IPTG诱导，pQE30—ESAT6未表达目的蛋白，而PET32α( )—ESAT6表达出19kDA左右重组蛋白。SDS—PAGE分析显示，IPTG诱导4h重组蛋白表达量最高，表达蛋白以可溶性非包涵体形式存在于胞浆中，表达量占全菌蛋白质的42％，用Westermblotting证实其有良好的抗原性；经过Ni—NTA柱纯化，获得纯度为92％的重组蛋白。结论：成功构建原核表达载体pET32a( )—ESAT6，并获得重组ESAT6蛋白，为MTb重组抗原的应用奠定基础。     

重组日本血吸虫26 ku谷胱甘肽-硫-转移酶的表达、纯化及其免疫特性分析用于急性血吸虫病免疫诊断

目的将日本血吸虫(中国大陆株)26 ku谷胱甘肽-硫-转移酶(26 ku SjGST)基因克隆入pET28a(+)并诱导表达26 ku rSjGST蛋白,纯化并用于急性血吸虫病免疫诊断.方法构建重组质粒pET28a-SjGST,转化到E.coli BL21,经IPTG诱导表达并进行SDS变性蛋白质电泳,以小鼠抗GST单克隆抗体为一抗,进行Western-blot分析.用His·BandPurification Kit亲和层析纯化重组蛋白,以此重组蛋白作为抗原,用ELISA法检测急性血吸虫患者血清和非流行区正常人血清. 结果成功地构建了重组质粒pET28a-SjGST,SDS变性蛋白质电泳显示可见一与预期分子量大小相符的特异蛋白条带的表达.Western blot分析表明,该重组蛋白能被小鼠抗GST单克隆抗体识别.ELISA结果表明,rSj GST用于急性血吸虫患者血清中抗体检测的阳性率为92.3%.结论 rSj GST得到表达和纯化,该重组蛋白用于急性血吸虫患者血清中抗体的检测具有良好的免疫反应性,为进一步探讨其在血吸虫病诊断中的应用奠定了基础.     

HCV核心蛋白片段的表达、纯化及免疫原性检测

目的：探讨HCV核心蛋白N端119aa片段表达产物的抗原性及用于抗-HCV抗体检测的可能性。方法：把HCV C119-pEq32a／BL21重组菌进行发酵表达，提取包涵体，并用阳离子柱进一步纯化目的蛋白。用Western blot及ELISA分析该融合蛋白的免疫特异性及敏感性。结果：所表达的目的蛋白约占菌体总蛋白的20％，SDS-PAGE结果表明所纯化的目的蛋白纯度大于95％。Western blot及ELISA结果显示该融合蛋白具有良好的免疫特异性，所检测的47份临床HCV感染血清的阳性率为91．5％，而阴性对照及HBV感染血清则未见阳性结果。结论：该HCV Cll9融合蛋白检测HCV感染患血清具有良好的特异性和敏感性，可望用于HCV抗体检测试剂盒的研制。     

MAGE-3基因的表达、纯化及其抗血清的制备

[目的]构建MAGE-3的原核表达质粒,表达、纯化蛋白并制备多克隆抗体.[方法]利用RTPCR方法扩增MAGE-3基因片段,连接入原核表达载体pGEX-4T-1,构建MAGE-3的原核表达质粒pGEXMAGEE-3并测序.将该质粒转化大肠杆菌BL21进行诱导表达,并通过谷胱甘肽巯基转移酶纯化系统进行分离纯化.用纯化的融合蛋白GST-MAGE-3免疫新西兰大白兔,ELISA法测定抗体效价,饱和硫酸铵沉淀法纯化抗体,Western-blot检测抗体活性.[结果]构建了pGEX-MAGE-3原核表达质粒,含有该质粒的大肠杆菌经IPTG诱导后表达一相对分子质量约为72×103的蛋白,经GST融合蛋白纯化系统纯化,得到了MAGE-3的重组蛋白GST-MAGE-3.制备了兔抗GST-MAGE-3抗体.Western blot证实该抗体可与GST-MAGE-3蛋白特异性结合.[结论]获得了肿瘤抗原MAGE-3的纯化重组蛋白及其特异的多克隆抗体、为进一步研究MAGE-3抗原在肿瘤免疫治疗中的作用提供了一件检测工具.     

SVLBP重组抗原用于日本血吸虫病免疫诊断的研究

目的研究日本血吸虫极低密度脂结合蛋白重组抗原(reSVLBP)在血吸虫病诊断中的应用价值及现场推广前景。方法以reSVLBP为抗原建立reSVLBP-ELISA,检测血吸虫病人及其它寄生虫感染者血清中特异性抗体,并与常规SEA-ELISA进行平行检测和比较。结果reSVLBP抗原和SEA对血吸虫的敏感性分别为90.5%和97.3%(P>0.05),两者对血吸虫的特异性分别为100%和77.0%(P<0.05);reSVLBP与肺吸虫、姜片虫血清未见交叉反应,与华支睾吸虫、蛔虫、鞭虫感染者血清的交叉反应率分别为20.0%、20.0%、10.0%。SEA对肺吸虫和姜片虫病人血清的交叉反应率分别为29.4%和16.7%,与华支睾吸虫、蛔虫、鞭虫感染者血清的交叉反应率分别为26.7%、30.0%、20.0%。结论reSVLBP作为诊断抗原具有很高的特异性,与其它寄生虫的交叉反应少,敏感性与SEA相近,在血吸虫病诊断中具有一定的应用前景。     

基于IgY的ELISA用于日本血吸虫病循环抗原的检测

目的 以鸡卵黄免疫球蛋白(IgY)替代哺乳动物来源的IgG抗体,建立双抗体夹心ELISA用于日本血吸虫病的诊断.方法 制备并纯化抗日本血吸虫可溶性虫卵抗原(SEA)的卵黄抗体IgY和抗SEA的兔多克隆IgG抗体;以抗SEA的IgG为捕获抗体,IgY为检测抗体的双抗体夹心ELISA诊断方法,共检测血清443份,其中急性血吸虫病患者血清68例,慢性血吸虫病患者180例,正常人100例,肺吸虫感染者20例,华支睾吸虫感染者48例和钩虫感染者血清27例.探讨基于IgY的循环抗原检测的应用价值.结果 成功制备并鉴定了特异性IgY和lgG抗体,建立了双抗体夹心ELISA检测体系;检测急性血吸虫病患者和慢性血吸虫病患者血清的阳性率分别为79.4%和64.4%,最低灵敏度为9.3μg/L;正常人血清的阴性率为92%;与肺吸虫、华支睾吸虫、钩虫感染者血清的交叉反应分别为20%、20.8%、14.8%.结论 建立了基于lgY的双抗夹心ELISA检测体系,用于日本血吸虫SEA的检测具有一定特异性和较高的敏感性,可试用于日本血吸虫病的辅助诊断.     

ΦC31整合酶的表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的：提供ΦC31整合酶研究所需的大量纯化蛋白质及特异性抗体。方法：将编码ΦC31整合酶的ORF插入到pET22b载体构建表达质粒并转化E．coliBL21（DE3），用IPTG诱导表达His-C31整合酶融合蛋白，His-BindQuick Cartridge纯化表达产物。重组蛋白作为抗原常规免疫家兔制备相应的多克隆抗体，Westernblotting确定抗体的特异性，体外线性底物分子内重组检测系统检测抗体的活性。最后用该抗体检测了ΦC31整合酶在真核细胞HEK293中的定位和分布。结果：16℃条件下O．2mmol／LIPTG诱导培养30h，携带pETa2b—ΦC31质粒的E-coliBL21（DE3）在YTG培养基中，可表达出大量的融合蛋白，该蛋白经体外线性底物分子内重组检测系统检验具有较高的活性。使用该融合蛋白免疫新西兰大白兔后，分离兔血清可得到ΦC31整合酶多克隆抗体，Westernblotting和荧光免疫细胞组织化学方法证实，该抗体可特异性地识别细菌及细胞表达的ΦC31整合酶蛋白抗原。结论：本实验建立了表达ΦC31整合酶的方法，并成功制备了ΦC31整合酶特异性抗体。