PDGF—B基因的膜型表达产物促进血管平滑肌细胞增殖和胶原合成

考察ＰＤＧＦ－Ｂ基因的膜型表达产物对血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣｓ）增生、胶原合成的影响。制备供转导人ＰＤＧＦ－Ｂ基因的重组逆转录病毒，感染ＮＩＨ３Ｔ３细胞，受染ＮＩＨ３Ｔ３细胞经筛选、扩增后，制备细胞膜上表达产物ＰＤＧＦ－ＢＢ以观察其对ＶＳＭＣｓ生长的影响，并以３Ｈ－ＰｒｏＬｉｎｅ掺入率评估该重组蛋白对ＶＳＭＣｓ胶原合成的影响。结果：重组逆转录病毒介导ＰＤＧＦ－Ｂ基因转移并表达出具有生物学活性的重组ＰＤＧＦ－ＢＢ，免疫荧光细胞化学染色证实其表达；该膜型重组蛋白可促进ＶＳＭＣｓ增殖和胶原合成。     

逆转录病毒载体介导的标志基因转移研究

目的：为建立高效、安全的逆转录病毒介导的基因标记系统。方法：用脂质体方法将含有标志基因 Ｎｅｏ Ｒ的逆转录病毒载体 Ｌ Ｘ Ｓ Ｎ 导入包装细胞 Ｐ Ａ３１７ ;通过与单向型包装细胞 Ｇ Ｐ Ｅ８６ 相互转导,获得高滴度的双嗜型产病毒细胞,并以其对人类白血病细胞进行基因标记。结果：脂质体转染法获得的病毒滴度约为２ ．０ ×１０５ Ｃ Ｆ Ｕ／ ｍｌ,而与 Ｇ Ｐ＋ Ｅ８６ 细胞转导后可提高至２ ．８ ×１０６ Ｃ Ｆ Ｕ／ ｍｌ;重组病毒转导白血病细胞（ Ｈ Ｌ－ ６０ , Ｋ５６２ , Ｋ Ｇ－ １） 后,聚合酶链反应（ Ｐ Ｃ Ｒ） 证实 Ｎｅｏ Ｒ 基因整合到靶细胞基因组,巢式 Ｐ Ｃ Ｒ 与补救分析均未能检测到辅助病毒。结论：“乒乓效应”可显著提高逆转录病毒滴度,而逆转录病毒介导的基因标记系统是安全的。     

逆转录病毒介导的TNFa基因在胶质瘤细胞系（C6）中的表达及对肿瘤细胞恶性生长的影响

利用逆转录病毒载体ＬＸＳＮ构建了含有完整编码ＴＮＦｃＤＮＡ的重组逆转录病毒质粒ｐＬＸＳＮ－ｔｎｆ，用Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ将重组质粒导入病毒包装细胞ｐＡ３１７，经Ｇ４１８筛选培养获得抗性克隆，用ＮＩＨ３Ｔ３细胞测定病毒滴度，获得滴度为５×１０５ＣＦＵ／ｍｌ的细胞克隆。利用病毒上清液感染大鼠胶质瘤细胞系Ｃ６，得到Ｇ４１８抗性克隆细胞Ｃ６ｐＬＸＳＮ－ｔｎｆ，经ＰＣＲ检测，ＴＮＦｃＤＮＡ完整地整合在细胞基因组中。测定Ｃ６ｐＬＸＳＮ－ｔｎｆ细胞上清中ＴＮＦ的生物活性，结果显示ＴＮＦ有相对稳定的表达（４８～１８０Ｕ／ｍｌ１０６ｃｅｌｌｓ／２４ｈ）。实验还显示经ＴＮＦ基因转导的Ｃ６ｐＬＸＳＮ－ｔｎｆ细胞生长速度较之亲本肿瘤细胞Ｃ６明显下降，基因修饰后的肿瘤细胞在Ｗｉｓｔａｒ大鼠体内形成肿瘤的能力明显受到抑制。进一步用超离心法浓缩病毒对胶质瘤移植模型进行了体内治疗研究。     

用双拷贝逆转录病毒载体转导入G—CSFcDNA的实验研究

为克服逆转录病毒中内部启动子对插入外源基因表达的干扰，将人Ｇ－ＣＳＦ（粒细胞集落刺激因子）ｃＤＮＡ插入双拷贝载体Ｎ２Ａ的３＇ＬＴＲＵ３区上的多克隆立点，酶切鉴定后将重组质粒用电击转导法转入Ｐｓｉ－２嗜单性包装细胞系，经Ｇ－４１８选择压力，两周后挑出阳性克隆，测定感染滴度后转染ＮＩＨ３Ｔ３细胞，选择挑出抗性克隆，测定Ｇ－ＣＳＦ表达量，最高达５３．３Ｕ／１０＾６细胞。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹和Ｎｏｒｔｈｅ     

肿瘤坏死因子α基因转染人脑胶质瘤浸润淋巴细胞的实验研究

采用脂质体转染技术将能表达肿瘤坏死因子α（ＴＮＦ－α）基因的重组逆转录病毒质粒ｐＬ（ＴＮＦ－α）ＳＮ导入病毒包装细胞ＰＡ３１７，在细胞培养上清液中得到重组病毒，滴度为１．４×１０９ＣＦＵ／Ｌ。将此病毒上清液感染人脑胶质瘤浸润淋巴细胞（ＴＩＬ），用Ｇ４１８筛选出能表达标记基因ＮｅｏＲ的阳性克隆，ＥＬＩＳＡ法测得ＮｅｏＲ阳性ＴＩＬ培养上清液中存在ＴＮＦ－α，可达５３０ｎｇ／Ｌ，Ｌ９２９依赖细胞法并测出上清液中有ＴＮＦ－α生物学活性。结果表明，我们构建的重组逆转录病毒可介导ＴＮＦ－α基因在人脑胶质瘤ＴＩＬ中的表达     

用双拷贝逆转录病毒载体转导人G－CSF cDNA的实验研究

为克服逆转录病毒中内部启动子对插入外源基因表达的干扰，将人Ｇ－ＣＳＦ（粒细胞集落刺激因子）ｃＤＮＡ插入双拷贝载体Ｎ２Ａ的３＇ＬＴＲＵ３区上的多克隆位点，酶切鉴定后将重组质粒用电击转导法转入Ｐｓｉ－２嗜单性包装细胞系，经Ｇ－４１８选择压力，两周后挑出阳性克隆，测定感染滴度后转染ＮＩＨ３Ｔ３细胞，选择挑出抗性克隆，测定Ｇ－ＣＳＦ表达量，最高达５３．３Ｕ／１０６细胞。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹和Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹分析证明嵌合的目的基因在感染细胞中通过基因复制而转染到５＇ＬＴＲ的转录单位之外并且在染色体ＤＮＡ中稳定整合，复制产生两个拷贝，在３＇ＬＴＲ和５＇ＬＴＲ中各有一个基因。     

HSV-TK基因逆转录病毒重组体的构建和鉴定

利用逆转录病毒载体ｐＬＮＳＸ构建了带ＨＳＶＴＫ基因的逆转录病毒重组体ｐＬＮＳＴＫ，用磷酸钙沉淀法转染ＰＡ３１７包装细胞，经Ｇ４１８筛选抗性克隆，建立了产生重组病毒的载体产生细胞系ＰＡ３１７／ＴＫ，用ＮＩＨ３Ｔ３细胞测定病毒（ＣＦＵ）滴度为３×１０８Ｌ－１。提取ＰＡ３１７／ＴＫ细胞的ＤＮＡ和细胞上清液的ＲＮＡ，在特异性引物引导下，分别用ＰＣＲ和ＲＴＰＣＲ检测证实ＰＡ３１７／ＴＫ细胞整合了ＨＳＶＴＫ基因并产生重组病毒，为ＨＳＶＴＫ基因治疗恶性肿瘤的实验研究打下了基础。     

HCMV即刻早期基因在大肠杆菌中的表达

①目的 在大肠杆菌中表达人类巨细胞病毒（ＨＣＭＶ）ＡＤ１６９株即刻早期基因ＵＬ３７×１,并检测原核表达蛋白的免疫原性。②方法 将原核表达质粒ｐＩＥ１转入大肠杆菌ＤＨ５α菌中,并通过温控的方式诱导目的基因的表达,用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳及Ｗｅｓｔｅｒｎ－Ｂｌｏｔ实验分析原核表达蛋白的表达情况及其免疫原性。③结果 获得了ＨＣＭＶ即刻早期基因的原核表达产物。④结论 ＨＣＭＶ即刻早期基因ＵＬ３７×１的原核表     

H—2K^b cDNA的克隆及其在多种真核细胞中的表达

目的 克隆Ｈ－２Ｋ＾ｂｃＤＮＡ及研究其在多种真核细胞中的表达。 方法 ＲＴ－ＰＣＲ法扩增Ｈ－２Ｋ＾ｂｃＤＮＡ,克隆入双顺反子逆转录病毒载体ｐＧＣＥＮ,ＰＡ３１７包装出重组病毒后,分别感染ＮＩＨ３Ｔ３、ＣＯＳ７及ＭＭ４５Ｔ．Ｌｉ,ＰＣＲ和ＲＴ－ＰＣＲ分析目的基因表达,ＦＡＣＳ分析Ｈ－２Ｋ＾ｂ在细胞膜上的表达。结果 以双顺反子逆转录病毒载体ｐＧＣＥＮ介导,分别建立了Ｈ－２Ｋ＾ｂ基因转导细胞：ＮＩＨ３Ｔ     

构建人白细胞介素2逆转录病毒载体和包装细胞

目的：构建人白细胞介素２（ｈＩＬ－２）逆转录病毒载体及包装细胞。方法：用基因重组法将ｈＩＬ－２ｃＤＮＡ与ｐＬＮＣＸ重组成正义和反义ＬＮＣＩＬ－２基因。用磷酸钙－甘油法及感染法将ＬＮＣＩＬ－２基因转入ＰＡ３１７包装细胞内。所得克隆Ａ８的ｈＩＬ－２分泌量，ＤＮＡ、ＲＮＡ分别用ＥＬＩＳＡ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹和Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交法分析。结果：Ａ８分泌的ｈＩＬ－２量为８．４ｎｇ·（２４ｈ·１０６细胞）１，ｈＩＬ－２基因完整地整合到转导细胞基因组内并有ｈＩＬ－２ｍＲＮＡ表达，细胞上清内病毒滴度为１０６·ＣＦＵ·ｍｌ１。结论：本研究成功地构建编码ｈＩＬ－２的逆转录病毒载体，并筛选出能产生病毒粒子、分泌ｈＩＬ－２的包装细胞。     

人胰岛素原基因的包装及增殖

目的:用PA317包装细胞包装突变人胰岛素基因原质粒,并检测其增殖情况.方法:用脂质体转染法将PLXSN-MPINS质粒转染至PA317包装细胞,用G418筛选出阳性PA317包装细胞克隆并测定胰岛素原基因浓度,用TRIZOL法提取未转染和转染后PA317细胞的基因组DNA,PCR检测突变人胰岛素基因的整合情况.结果:(1)用脂质体转染法获得G418阳性PA317包装细胞克隆;(2)该细胞克隆获高滴度的胰岛素原基因浓度;(3)PCR方法在转染后PA317基因组中检测到突变人胰岛素原基因.结论:脂质体转染法是一种操作简便且行之有效的转染方法.PA317包装细胞系可成功包装突变人胰岛素原基因质粒并可获得高滴度表达,为1型糖尿病基因治疗的进一步实验研究奠定了基础.     

HIV-1辅受体配体的逆转录病毒载体的构建和表达

目的: 构建HIV-1辅受体的配体-趋化因子RANTES和SDF-1的逆转录病毒载体,并观察在NIH3T3细胞的表达.方法: 从重组质粒pCMV-R-K-S-K中获取RANTES-KDEL-SDF-KDEL基因片段,构建RANTES和SDF-1的逆转录病毒载体pLNCX-R-K-S-K,酶切鉴定并测序.采用标准的磷酸钙共沉淀法转染包装细胞Bing, G418筛选克隆细胞,制备重组病毒液,继之感染NIH3T3细胞,计算病毒滴度.间接免疫荧光检测NIH3T3细胞中RANTES、SDF-1的表达.结果: pLNCX-R-K-S-K逆转录病毒载体酶切和测序结果与预期一致,筛选出抗性克隆,制备了高滴度的重组病毒液,间接免疫荧光证实RANTES和SDF-1可表达于转染细胞.结论: HIV-1辅受体的配体、趋化因子RANTES和SDF-1的逆转录病毒载体构建成功,重组病毒可以感染NIH3T3细胞,为下一步HIV-1感染实验打下了基础.     

嗜肺军团菌主要免疫原基因真核表达质粒的构建与表达

目的 构建嗜肺军团菌主要免疫原基因的真核表达重组质粒pcDNA3.1-ip,并观察其在真核细胞中的表达.方法 以嗜肺军团菌1型DNA为模板,PCR扩增获得嗜肺军团菌ip基因,将其定向插入载体pcDNA3.1( ),构建真核表达重组质粒pcDNA3.1-ip.经限制性核酸内切酶HindⅢ和BamHⅠ酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后,用脂质体法将重组质粒pcDNA3.1-ip转染NIH3T3细胞,采用免疫荧光法和Western blot分别鉴定pcDNA3.1-ip的瞬时和稳定表达.结果 成功构建了嗜肺军团菌ip基因的真核表达重组质粒.在细胞膜与细胞内观察到较强的绿色荧光,表明pcDNA3.1-ip成功转入NIH3T3细胞,并在NIH3T3细胞中得到了瞬时表达;用嗜肺军团菌兔血清抗体检测pcDNA3.1-ip稳定转染的NIH3T3细胞,在相对分子质量为29×103处检测到阳性杂交信号,表明pcDNA3.1-ip在细胞内可稳定表达IP蛋白.结论 本研究构建的嗜肺军团菌主要免疫原基因真核表达质粒pcDNA3.1-ip能够成功表达IP蛋白,表达的蛋白具有良好的免疫原性与免疫反应性.     

霍乱肠毒素基因DNA疫苗的构建和体外表达

目的构建霍乱弧菌ctxAB融合基因分子佐剂DNA疫苗,并在NIH3T3细胞中进行表达。方法用限制性核酸内切酶从原核表达重组质粒pET32a-ctxAB上切下ctxAB基因,导入真核表达载体pcDNA3.1（＋）,重组子经限制性酶切分析、PCR鉴定正确后,命名为pcDNA3.1-ctxAB。用脂质体法将重组质粒pcDNA3.1-ctxAB转染NIH3T3细胞,采用免疫荧光法和Western blot对pcDNA3.1-ctxAB的瞬时表达产物和稳定表达产物进行鉴定。结果真核表达重组质粒pcDNA3.1-ctxAB成功转入NIH3T3细胞,利用免疫荧光技术检测到其在细胞膜和细胞浆中获得瞬时表达,对稳定转染细胞用Western blot分析,发现在约40.5kDa处有阳性杂交信号。结论成功构建霍乱弧菌ctxAB基因分子佐剂DNA疫苗,并在NIH3T3细胞中获得表达。     

Galectin-3重组真核表达载体的构建及其在NIH/3T3细胞中的表达

目的:构建半乳糖凝集素-3(Gal-3)的真核表达载体,在NIH/3T3细胞中表达,并检测其表达?方法:通过DNA重组技术和PCR方法从人肿瘤细胞克隆Gal-3基因,插入真核表达载体pEGFP-N1中,通过酶切和测序鉴定重组载体的正确性;采用脂质体转染技术将重组质粒pEGFP-Gal-3瞬时转染NIH/3T3细胞,经荧光和Western blot方法检测Gal-3表达,MTT法检测Gal-3对NIH/3T3细胞增殖的影响?结果:限制性内切酶鉴定和核酸序列测序证实成功构建含Gal-3的重组真核表达载体pEGFP-Gal-3?以重组质粒瞬时转染NIH/3T3细胞,检测到Gal-3蛋白表达,并证实Gal-3蛋白促进NIH/3T3细胞增殖?结论:成功构建的pEGFP-Gal-3真核表达载体在小鼠NIH/3T3细胞中成功表达,并促进NIH/3T3细胞增殖?     

小鼠24p3基因真核表达载体的构建及其在NIH3T3细胞中的表达

目的构建小鼠24p3基因真核表达载体并观察其稳定转染的NIH3T3细胞中24p3/SIP24蛋白的表达情况,初步鉴定24p3/SIP24蛋白介导铁向细胞内转运的生物学功能.方法RT-PCR自小鼠肺组织中克隆24p3 cDNA.用基因重组技术构建24p3-pcDNA3.0真核表达载体并行酶切和测序鉴定.脂质体DOTAP方法转染NIH3T3细胞,48 h后用G418筛选阳性克隆并培养扩增至21 d.对阳性克隆的培养基上清中24p3/SIP24蛋白的表达用ELISA和Westernblot分析,进一步用原子吸收分光光谱观察其介导铁向NIH3T3细胞内转运的生物学功能.结果成功克隆24p3cDNA并构建24p3-pcDNA3.0真核表达载体,筛选出稳定表达24p3/SIP24蛋白的NIH3T3细胞株,24p3/SIP24蛋白在NIH3T3细胞上清中获得表达,并能介导铁向NIH3T3细胞内转运.结论24p3基因在NIH3T3细胞中获得表达,有良好的生物学活性,为进一步研究24p3/SIP24蛋白介导铁转运的生物学功能及作用机制奠定了基础.     

稳定表达神经营养素-3的NIH3T3细胞建立及鉴定

目的：建立稳定表达NT3的NIH3T3细胞株，通过体外共培养实验观察其对耳蜗螺旋神经节细胞生长的影响．方法：以阳离子脂质体作为载体，将携带有外源性基因NT3的重组真核表达载体pIRES2-EGFP-NT3转染小鼠成纤维细胞，进行RT-PCR，Western-blot分析及免疫组化鉴定，并与耳蜗螺旋神经节细胞进行共培养实验．结果：得到抗G-418的阳性细胞克隆；RT-PCR的产物约为744 bp；Western-blot可见一清晰的蛋白条带，与NT3的蛋白分子量相符合．NT3免疫组化染色结果显示转染NT3-cDNA的NIH3T3细胞胞质呈棕黄色着色．NT3转染组细胞与耳蜗螺旋神经节细胞共培养2wk后，与对照组相比，耳蜗螺旋神经节细胞无明显减少．结论：成功建立了稳定表达NT3的NIH3T3细胞株；该细胞对耳蜗螺旋神经节细胞有很好的营养支持作用．     

mIL-12重组逆转录病毒载体的构建及包装细胞系的建立

目的：构建 mIL-12重组逆转录病毒载体。方法：将 mIL-12 DNA克隆到载体pLEGFP,用该重组质粒转染PA317包装细胞获得重组逆转录病毒。结果：重组质粒pLEGFP-mIL12酶切及PCR产物在2 290 bp区域见强荧光条带与mIL-12基因大小相符;转染PA317细胞后的上清感染NIH3T3细胞后,经共聚焦显微镜能观察到融合蛋白的表达。结论：包装细胞上清中有含mIL-12 DNA的重组逆转录病毒,mIL-12重组逆转录病毒可感染NIH3T3细胞并在细胞中进行有效的复制。     

新的人内源性逆转录病毒NP9基因的分子克隆与病毒蛋白表达

目的:研究新近发现的人内源性逆转录病毒NP9基因与自身免疫性疾病的相关性及其可能的作用机制,构建该基因的蛋白表达系统. 方法:提取自身免疫性疾病患者外周血单个核细胞(PBMCs)的总RNA,利用RT-PCR 技术,扩增NP9基因,然后将该片段进行T-A克隆并测序鉴定,纯化回收后亚克隆于原核表达载体pQE30中,然后提取质粒,酶切鉴定;最后经IPTG诱导,原核表达重组子在M15宿主菌进行表达,并进行SDS-PAGE与Western 印迹分析与鉴定.结果:应用RT-PCR 技术,从系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞的总RNA中扩增到一条大小约为250 bp的片段,经T-A克隆与测序鉴定,证实此片段为NP9基因,具有一个完整的开放阅读框架;将pQE 30-NP9重组子转化入宿主菌,用IPTG诱导菌体表达NP9重组蛋白,经SDS-PAGE电泳和Western印迹技术鉴定证实:在相对分子量约9kD处见明显的病毒特异性的高表达条带.结论:已成功克隆了新的人内源性逆转录病毒NP9基因,并经IPTG诱导,在M15宿主菌中表达了相应的病毒蛋白,为进一步研究该逆转录病毒与自身免疫性疾病的相关性奠定基础.     

嗜肺军团菌pilE基因体外表达及其免疫原性研究

目的 构建嗜肺军团菌Ⅳ型菌毛pilE基因的真核表达重组质粒pcDNA3.1-pilE,研究其真核细胞中的表达及其免疫原性.方法 以嗜肺军团菌1型DNA为模板,PCR扩增获得嗜肺军团菌pilE基因,将其定向插入载体pcDNA3.1( ),构建真核表达重组质粒pcDNA3.1.-pilE.经限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后,用脂质体法将重组质粒pcDNA3.1-pilE转染NIH3T3细胞,采用免疫荧光法和Western-blot分别鉴定pcDNA3.1-pilE的瞬时和稳定表达产物.将pcDNA3.1-pilE作为DNA疫苗免疫BALB/c小鼠,检测免疫小鼠体内抗原特异性抗体水平、脾淋巴细胞增殖活性、IFN-γ产生水平、CTL杀伤活性等指标,评价疫苗的免疫原性.结果 扩增出了429 bp的PilE基因,在细胞膜与细胞内观察到较强的绿色荧光,在相对分子质量15000处检测到阳性杂交信号,表明pcDNA3.1-pilE在细胞内表达PilE蛋白.pcDNA3.1-pilE免疫组的免疫原性均高于对照组pcDNA3.1( )组(P＜0.01).结论 成功构建了嗜肺军团菌pilE基因的真核表达重组质粒,并在NIH3T3细胞中得到了表达,免疫小鼠后诱导了特异的体液免疫应答和细胞免疫应答.