多种细胞因子在CD34+细胞增殖分化中的作用

目的:探讨血小板生成素（TPO）等多种细胞因子在分离后的脐血造血干/祖细胞体外扩增中的作用。方法:在集落培养体系及体外液体扩增体系中,分别用含有和不含有TPO细胞因子组合实验,比较其结果。结果:含有TPO组其诱导红系爆式集落单位(BFU-E )和粒巨细胞集落形成单位(GFU-GM)集落形成倍数、细胞总数和CD34⁺细胞增殖倍数明显高于不含有TPO组。 结论：TPO与干细胞因子(SCF)、白细胞介素3(IL-3)等其他细胞因子协同可明显提高早期造血干/祖细胞扩增效率。     

高增殖潜能内皮祖细胞促进脐血造血祖细胞体外扩增

目的：研究脐血来源高增殖潜能内皮祖细胞支持脐血造血干／祖细胞体外扩增的能力。方法：利用第3代的HPP—EPC联合细胞因子培养脐血造血干／祖细胞,分因子组、非接触培养组和接触培养组。体外培养脐血CD34＋细胞10d后,从细胞总数,CD34＋细胞数,各系造血集落形成细胞数等比较各组的扩增效率。结果：接触组细胞总数扩增倍数（44．6±8．7）倍和非接触组（39．5±7．3）倍均高于因子组（24．8±5．6）倍,P〈0．01。接触组CD34＋细胞数扩增倍数（8．8±2．1）倍高于因子组（2．9±0．6）倍和非接触培养组（3．3±0．6）倍,P〈0．01。接触组集落扩增倍数和非接触组均分别高于因子组,P〈0．05,且接触组各造血集落扩增数均分别高于非接触组,各P〈0．05。接触组扩增后CD34＋CD38＋细胞（10．8％±2．7％）明显高于因子组（4．1％±0．9％）和非接触培养组（3．8％±0．8％）,P〈0．01。结论：脐血来源高增殖潜能内皮祖细胞能支持脐血CD34＋细胞体外扩增。     

层流流体剪切力对脐血CD34＋细胞体外扩增的影响

目的本实验系在考察层流剪切力对脐血CD34＋细胞体外扩增的影响作用。方法从脐血中分离出CD34＋细胞,接种入实验室自制的层流剪切力实验装置中,在不同大小的层流流体剪切力（0.5,1,2,4dyn/cm2）加载下进行体外扩增培养。结果较小的层流剪切力（0.5,1dyn/cm2）可促进造血干/祖细胞扩增,有利于早期造血干/祖细胞的维持,并能促进更多的细胞由G0/G1期进入S期 较大的层流剪切力（2,4dyn/cm2）抑制了造血干/祖细胞的扩增,导致其迅速分化 并使S期细胞的比例减小。结论在生物反应器体外扩增培养脐血CD34＋细胞时,其层流流体剪切力应控制在1dyn/cm2范围内。     

脐血造血干/祖细胞体外扩增后端粒酶活性的表达

目的 探讨脐血造血干／祖细胞在不同细胞因子支持的体外扩增过程中端粒酶活性的表达及意义。方法 应用PCR—ELISA方法检测脐血造血干／祖胞体外扩增前后的端粒酶活性、细胞扩增倍数及免疫表型的变化。结果 新分离的脐血CD34^ 细胞表达弱的端粒酶活性，体外培养7d，细胞端粒酶活性达最高，干／祖细胞扩增倍数也明显增高，随着培养时间的延长，细胞分化成熟，端粒酶活性减低。结论端粒酶的活性的升高与造血干／祖细胞的扩增相一致；从临床应用价值来看，脐血CD34^ 细胞体外扩增时间应以7d内为宜；IL-3促分化能力大于G-CSF。     

人脐血基质细胞对脐血CD34+细胞体外扩增的作用

目的研究人脐血基质细胞(hUCBSCs)对脐血CD34+细胞体外扩增的促进作用. 方法应用MACS磁珠分离系统分离脐血CD34+细胞,按照DEXTER法行脐血基质细胞培养,观察hUCBSCs的生长状态及细胞表面分子的表达情况.建立以hUCBSCs为滋养层的脐血CD34+细胞体外扩增体系,并对脐血CD34+细胞短期扩增后行集落形成单位(CFU)-GM、CFU-E和CFU-Mg半固体培养. 结果脐血基质细胞为混合细胞群,包括CD68(+)、Fn(+)、CD31(+)和CD34(-);以hUCBSCs为滋养层的体外扩增体系对脐血CD34+细胞具有明显的扩增作用,体外液体扩增后的脐血CD34+细胞集落形成能力明显高于对照组,其中细胞因子(SCF+IL-3+EPO+TPO+GM-CSF)联合hUCBSCs体系的扩增作用最强,hUCBSCs在促进CFU-Mg集落形成的作用中具有明显优势. 结论hUCBSCs具有体外支持造血作用,与细胞因子联合对促进脐血CD34+细胞扩增作用更加明显.hUCBSCs对促进巨核细胞扩增可能具有特殊的意义.     

青蒿琥酯对K562细胞和脐血CD34+造血干/祖细胞的选择性作用

目的 探讨青蒿琥酯(artesunate, AST)对K562细胞和正常造血干/祖细胞是否具有选择性作用.方法 选用K562细胞及脐血CD34 造血干/祖细胞,加入不同浓度AST.MTT法检测药物对上述两种细胞增殖的影响;甲基纤维素半固体培养法考察AST对其体外扩增和多向分化能力的影响;以流式细胞术Annexin V-FITC-PI双染定量检测细胞凋亡率;Western blot方法检测BCR-ABL融合蛋白的表达.结果 青蒿琥酯对K562细胞有明显的抑制增殖和诱导凋亡的作用(P＜0.01),并存在时效和量效关系,对集落抑制作用明显(P＜0.01).青蒿琥酯在12.5～25 μg/ml作用48 h对脐血CD34 造血干/祖细胞增殖抑制作用和诱导凋亡作用不明显(P＞0.05),对集落生成亦无明显抑制作用(P＞0.05).经青蒿琥酯作用48 h,K562细胞BCR-ABL蛋白以剂量依赖方式被降解(P＜0.01). 结论 青蒿琥酯在一定浓度范围内对K562细胞具有选择性抑制增殖和诱导凋亡的作用,对脐血CD34 造血干/祖细胞影响较小.     

脐血CD34+细胞体外扩增和分化调节的研究

目的探讨脐血体外扩增的最佳造血生长因子组合及时间.方法脐血CD34+细胞培养于含不同造血生长因子组合的无血清培养液.对其有核细胞数(NC)、表面抗原以及集落形成能力进行监测.结果同对照组相比,扩增组的NC和CD34+细胞均有不同程度的扩增,扩增高峰分别为第10d和第6d;其中含SCF、IL-3、IL-6、TPO、Flt3-L、G-CSF及Epo的E组扩增的细胞数最多.第6d,CD34+细胞、NC及CFC总数分别扩增了9.90、101.80和31.18倍,第10d分别累积扩增了3.56、357.42和73.11倍.而D组(含SCF、IL-3、IL-6、TPO及Flt3-L)扩增的细胞中CD34+及CD34+CD38-含量最高.提示E组细胞分化较D组明显.结论体外扩增可望解决单份脐血造血干/祖细胞数量不足的问题,但扩增中应注意其过度分化,扩增时间以6～10d为宜.     

人参总皂苷体外定向诱导CD34+细胞分化为粒系血细胞的研究

目的研究人参总皂苷(TSPG)协同造血生长因子对CD34 细胞体外定向诱导分化为粒系血细胞的影响。方法应用阴性磁性分选策略,以StemsepTM系统从正常人骨髓细胞中分离CD34 造血干/祖细胞(HSC/HPC),通过甲基纤维素半固体培养法检测TSPG诱导CD34 HSC/HPC向粒系祖细胞集落(CFU-GM)增殖与分化的能力;在SCF IL-3 GM-CSF G-CSF(SIGG)液体培养体系中加入不同剂量的TSPG,检测对CD34 HSC/HPC增殖形成CFU-GM的影响以及CD33 细胞比例的变化。结果TSPG(10～50μg/mL)均能提高CD34 细胞形成CFU-GM的集落产率,以TSPG20μg/mL效果最为明显;不同质量浓度的TSPG协同造血生长因子在液体培养体系中诱导CD34 细胞2周,观察粒系血细胞的分化,TSPG10～70μg/mL均可不同程度地提高细胞总数、CFU-GM扩增倍数及CD33 细胞比例,TSPG20μg/mL是液体培养诱导CD34 细胞向粒系分化的最佳质量浓度。结论TSPG协同造血生长因子能促进CD34 细胞定向诱导分化为粒系血细胞。     

脐血造血干/祖细胞集落体外生物特性的研究

目的探讨脐血造血干/祖细胞CD34+含量、集落生长及产率等生物特性并与骨髓进行相关比较。方法选择脐血标本25份,正常骨髓标本18份,健康成人标本20份,对脐血体积测量和有核细胞计数,用流式细胞仪对脐血、骨髓、外周血中CD34+细胞含量进行检测;采用体外细胞培养法测定脐血和骨髓的粒单系祖细胞集落(CFU-GM)和粒-巨噬细胞与红系细胞混合集落(CFU-GEM)的产率、生长、构成,并进行了相关比较。结果①脐血量平均为96.73 mL(64~150 mL)含有核细胞数为7.84×108[(4.94~11.3)×108];②脐血中CD34+细胞含量0.85%虽低于骨髓的1.68%,但明显高于外周血的0.15%,P均<0.05,差异有显著性;③CFU-GM的产率脐血为(92.9±12.2)/2×105高于骨髓的(73.4±14.1)/2×105,脐血CFU-GEM的产率(11.64±1.86)/2×105高于骨髓的(8.63±1.17)/2×105,差异均有显著性(P<0.01,P<0.05)。结论①脐血中含有丰富的造血干/祖细胞,是造血干细胞移植的较好的来源。②脐血的造血干/祖细胞对外源性集落刺激因子反应较骨髓更敏感,更易在外源条件下增殖分化,体外扩增获得大量脐血造血干/祖细胞以达到移植阈值是完全可行的。     

脐血造血干/祖细胞体外扩增的实验研究

目的探讨因子组合FL+TPO+SCF+IL-6对脐血CD34 +细胞的体外扩增效应.方法采用Mini-MACS分离纯化出CD34+细胞, 在无基质接触的液体悬浮培养体系培养,通过间接免疫荧光染色、流式细胞仪技术、集落形成试验等动态测定细胞扩增情况.结果培养4周后,FL+TPO+SCF+IL-6组细胞总数、集落形成数均比扩增前显著增加(P＜0.05),并且能维持一定比例的CD34+、Th y-1+细胞;SCF+IL-3+IL-6+GM-CSF+EPO组在第2周时集落形成数已降低,第4周时集落形成数、CD34+细胞基本检测不到.结论与经典因子组合SCF+IL-3+IL-6+G M-CSF+EPO相比,因子组合FL+TPO +SCF+IL-6能在较长时间内有效扩增脐血造血干/祖细胞, 是一个优化组合方案.     

脐血细胞成份及造血干/祖细胞的定量研究

目的:探讨脐全血细胞组成特点,对脐血造血干／祖细胞进行定量测定。方法:采用自动血细胞分析仪检测血细胞成份,以流式细胞术为基础.应用双荧光标记单克隆抗体方法,测定造血于／祖细胞的含量。结果:脐血组成细胞的大多数检测指标高于成人外用血。CD34＋细胞占1.14±1.12％;CD34＋CD38-细胞占CD34＋细胞的16％。结论:脐血具有丰富的血细胞及造血于／祖细胞,有造血重建的临床应用潜能。     

脐血造血细胞体外集落培养最佳收获时机的探讨

目的 探讨脐血（CB）多系造血集落培养在不同培养条件下脐血造血细胞体外扩增的最佳收获时机。方法 将从新鲜CB标本中分离出的单个核细胞（MNC）分别接种于已建立的无血清培养基，该培养基分别含单用人骨髓基质细胞、单用细胞因子及细胞因子联合入骨髓基质细胞（HBMSC）支持培养体系。在0、6、10及14d各时间点分别取细胞进行巨细胞集落形成单位（CFU—MK）、红乐爆式集落形成单位（BFU—E）及粒单细胞集落形成单位（CFU—GM）培养。结果在体外培养过程中，第10d时各组CFU—MK、BFU—E及CFU—GM数均高于组内其它时间点（P〈0．05）；在含HBMSC支持培养的组集落生成数优于其它组（P〈0．05）。结论 脐血MNC体外培养过程中，第10d可能是收获的最佳时机。FIBMSC能更好地维持造血干／祖细胞的活性，使其集落形成能数得到有效扩增。     

脐血造血细胞移植救治放射损伤小鼠的实验研究

用人脐血造血细胞体外扩增后对受骨髓致死量照射的BALB／C小鼠进行移植。结果，移植组平均存活率为90％，对照组仅为10％。存活鼠骨髓和脾脏内可检测到CD45阳性的人源性造血细胞，体外祖细胞集落培养有人源性髓系和红系集落形成。结论，脐血造血细胞可帮助恢复急性重症放射损伤骨髓的造血重建。     

生长抑素对人脐血CD34+细胞增殖能力的影响

目的 探索生长抑素(SST)对造血干/祖细胞增殖能力的影响以及可能机制.方法 采用免疫磁珠分选技术纯化人脐血CD34+细胞;SST孵育人CD34+细胞后,体外集落形成、扩增培养了解细胞增殖;ELISA测定细胞内外TNF-α、TGF-β水平;RT-PCR分析其受体亚型.结果 在1×10-5～1×10-10mol/L浓度范围内,SST抑制人CD34+细胞集落形成及扩增倍数,其细胞集落形成抑制与SST浓度呈正相关(r=0.903,P＜0.01).SST使CD34+细胞内、外TNF-α及TGF-β1浓度显著增加(P＜0.05);人脐血CD34+细胞表达SST-3型受体.结论 SST通过人脐血CD34+细胞上SST-3型受体介导,提高造血抑制因子TNF-α、TGF-β水平,抑制人CD34+细胞的增殖,维持其干细胞特性.     

Transwell培养体系中人AGM区基质细胞支持脐血CD34+细胞造血

[目的]探讨Transwell系统中人胚主动脉-性腺-中肾(AGM)区基质细胞对脐带血造血干/祖细胞的造血能力长期维持及扩增的作用.[方法]采用免疫磁珠方法分离人脐带血CD34 细胞,接种于底层铺有人AGM区基质细胞的Transwell培养板的Inserts中,非接触共培养7～35 d,每星期取样检测细胞总数,用半固体培养基分析CFU-C及HPP-CFU集落形成数,流式细胞术检测CD34 、CD34 CD38-细胞百分率.[结果]在Transwell中非接触共培养条件下,人AGM区基质细胞培养体系较胚胎躯干基质细胞和无饲养层培养体系对有核细胞总数、CFC和CD34 细胞均具有明显的扩增作用,共培养14 d的CD34 、CD34 CD38-造血干/祖细胞均获得峰值扩增(2.62±0.8和2.15±1.04,P<0.05),而MNC总数和CFC均在21 d获得最大扩增(32.5±4.3和4.2±0.6倍,P<0.05).克隆分析发现CFU-Mix、CFU-GM、BFU-E在共培养4～5星期后均仍然可见.原始祖细胞HPP-CFC在3星期也得到2.23倍的扩增,较空白及hFT对照组均有显著性差异(P<0.05),并在共培养35 d后仍可见HPP-CFU集落形成.[结论]人AGM区基质细胞hAGM-S3/hAGM-S4均具有造血支持作用,在非接触共培养条件下中可长期维持脐血中造血干/祖细胞的多系造血能力和高增殖潜能达21～35 d,对脐血CD34 /CD34 CD38-细胞数也有一定程度的扩增作用.     

脐血CD34+细胞的体外扩增研究

目的:探讨造血生长因子不同组合方式对脐血CD34+造血干/祖细胞(HSC/HPC)的扩增作用.方法:应用StemsepTM阴性分选系统分离纯化CD34+细胞,在体外液体培养体系中经不同组合细胞因子进行扩增1～3w.结果:FL+Tpo+SCF+IL-3+GM-CSF+G-CSF+Epo组合的扩增效果最佳,可分别扩增细胞总数、造血祖细胞集落总数(CFCs)、CD34+细胞达1627.57±52.93、56.78±8.13、41.09±4.11倍.FL和Tpo具有明显的协同扩增早期祖细胞的作用,CFCs和CD34+细胞在1～2w维持在较高水平,以后逐渐衰退.结论:合理的细胞因子组合在大量扩增造血细胞的同时也有助于早期造血祖细胞的自我更新,把握适宜的扩增时机,将有助于扩增细胞在质和量上满足移植和基因治疗等的要求.     

脐血CD34+细胞体外扩增和分化调节的研究

目的：探讨脐血体外扩增的最佳造血生长因子组合及时间。方法：脐血CD34^ 细胞培养于含不同造血生长因子组合的无血清培养液。对其有核细胞数（NC）、表面抗原以及集落形成能力进行监测。结果：同对照组相比，扩增组的NC和CD34^ 细胞均有不同程度的扩增，扩增高峰分别为第10d和第6d；其中含SCF、IL-3、IL-6、TPO、Flt3-L、G-CSF及Epo的E组扩增的细胞数最多。第6d，CD34^ 细胞、NC及CFC总数分别扩增了9.90、101.80和31.18倍，第10d分别累积扩增了3.56、357.42和73.11倍。而D组（含SCF、IL-3、IL-6、TPO及Flt3-L）扩增的细胞中CD34^ 及CD34^ CD38^-含量最高。提示E组细胞分化较D组明显。结论：体外扩增可望解决单份脐血造血干/祖细胞数量不足的问题，但扩增中应注意其过度分化，扩增时间以6-10d为宜。     

低氧诱导因子-1α基因体外转染内皮祖细胞的可行性及对其成内皮细胞活性的影响

目的探讨低氧诱导因子-1α(HIF-1α)基因体外转染入内皮祖细胞(EPCs)的可行性及对其表现型的影响。方法构建真核表达载体pEGFP-HIF-1α。分离外周血单个核细胞(PBMC)及脐血CD34 单个核细胞(MNCCD34 )。采用电穿孔基因转染,荧光显微镜检测转染效率,逆转录聚合酶链反应检测HIF-1α的表达。培养1周后,分为4组:A组:只加入血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)诱导培养;B组:转染入空质粒pEGFP-C1,并加入VEGF、bFGF;C组:转染入pEGFP-HIF-1α质粒;D组:未加VEGF、bFGF诱导。采用流式细胞仪检测CD31阳性细胞百分率。结果构建的pEGFP-HIF质粒基因序列与基因库(U22431, gi:881345)HIF-1α的CDS编码区完全一致。PBMC转染效率达38％,MNC CD34 转染效率达到42％。PBMC培养1周时,A、B、C组间CD31阳性率的差异无显著性(P值均>0．05),但均显著高于D组(P值均<0．05)。MNCC CD34 培养1周后,A、B、C组间CD31阳性率的差异无显著性(P值均>0．05)。结论真核表达载体pEGFP-HIF体外电穿孔转染入PBMC,提示转染HIF-1α能促祖细胞向内皮细胞分化,效果与加入细胞因子诱导相似,其能增加祖细胞增殖活性。     

人脐血干细胞对裸小鼠移植的实验研究

目的　探讨脐血干细胞移植到小鼠体内的增殖、分化以及维持情况。方法　将人脐血单个核细胞注入经致死量照射后的免疫缺陷小鼠— BAL B/C nu 小鼠。观察小鼠的生存、造血重建和植入指标情况。结果　移植组小鼠生存、造血重建及植入指标表达明显优于对照组 (P<0 .0 5 ) ,人脐血中的 CD34 细胞可植入且定居于小鼠骨髓中 ,并可在其中增殖、分化。结论　人脐血干细胞移植入裸鼠显示脐血的造血干 /祖细胞在体内具有长期重建造血的能力     

中晚孕期与足月胎儿脐血干/祖细胞功能特性研究

目的　对比研究中、晚孕期和足月胎儿脐血造血干 /祖细胞的表型及功能特性 ,为造血干细胞宫内移植和基因治疗先天性疾病提供新的思路。方法　采用免疫磁珠分离法、流式细胞术、液体培养、半固体甲基纤维素培养等对中、晚妊期及足月胎儿脐血造血干 /祖细胞比例、对细胞因子的反应性、体外增殖及自我更新能力进行了测定。结果　未足月脐血中CD34+ 、CD34+ CD38- 细胞及CD34+ 细胞中CD34+ HLL DR+ 、CD34+ CD38- 细胞比例较足月脐血高 (平均 3 1 4 %、0 76 %比 0 78%、0 1 8%及 9 8%、2 0 4%比 3 9%、1 4 6 % ) ,产生的集落形成单位量 (CFU)较足月脐血高 ,且与CD34+ 细胞比例成正相关 (r =0 83) ,长期培养启动细胞 (LTC IC)约是足月脐血的 3倍 (5 7± 1 2 / 1 0 5细胞比1 7± 0 8/ 1 0 5细胞 ,P <0 0 5)。在短期液体培养体系中 ,不同胎龄脐血干 /祖细胞具有相似的扩增潜能 ,体外细胞因子支持下培养 7天 ,CFU C、细胞总数、CD34+ 细胞数、CD34+ CD38- 细胞数达高峰 ,之后逐渐下降 ,其中以SCF +FL +TPO +IL 3 +IL 6组合条件下效果最显著。结论　未足月胎儿 (尤其是中妊期 )脐血与足月胎儿脐血相比 ,含有较高的造血干 /祖细胞 ,有较强的集落形成能力 ,对细胞生长因子刺激敏感 ,在体外能有效地扩增和