缺氧后线粒体Drp1通过LRRK2-HK2诱导mPTP过度开放的机制研究

目的：探究缺氧后线粒体动力相关蛋白1(dynamin-related protein 1,Drp1)对线粒体膜通透性转换通道（mitochondrial permeability transition pore,mPTP）开放的调控机制。方法：在血管平滑肌细胞中通过免疫荧光方法观察缺氧后mPTP开放情况；通过超速离心法分离线粒体和细胞质成分蛋白；使用Co-IP和Westernblot检测缺氧或者干预Drp1、干预己糖激酶-2(hexokinase-2,HK2)后Drp1的表达分布情况、HK2与电压依赖性阴离子通道蛋白（voltage dependent anion channel,VDAC）结合情况、Drp1与富含亮氨酸重复激酶2(leucine-rich repeat kinase 2,LRRK2)结合情况；使用蛋白分子对接和蛋白芯片方法筛选Drp1的潜在结合蛋白及结合位点；使用Drp1抑制剂和点突变法用于相应机制探究。结果：缺氧后Drp1发生线粒体转位促使mPTP过度开放（P<0.05）。使用Mdivi-1减少线粒体Drp1表达后可抑制mPTP开放，减少细胞色素C(cytoc...     

动力相关蛋白-1在缺氧/复氧诱导人肾小管上皮细胞焦亡机制中的作用

目的 观察人肾小管上皮细胞(HK-2细胞)缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)损伤时线粒体动力相关蛋白1 (dynamin-related protein 1,Drp1)、Nod样受体热蛋白结构域相关蛋白3(nucleotide binding oligomerization domain-like receptor family pyrin domain containing 3,Nlrp3)以及炎性因子的表达改变和细胞焦亡情况,探讨Drp1在H/R诱导肾小管上皮细胞焦亡中的作用.方法 HK-2细胞用含10％胎牛血清的DMEM/F12液培养于37 ℃、5％ CO2和95％O2的恒温培养箱.将细胞分为正常对照组、H/R组、H/R+ Drp1抑制剂(H/R+Mdivi-1)组、H/R+siNlrp3腺病毒(H/R+siNlrp3)组、H/R+空腺病毒(H/R+ Scra)组.检测细胞培养液上清乳酸脱氢酶LDH活性,Western blot检测Drp1、Nlrp3、凋亡相关蛋白-l(caspase-1)、IL-1β表达,2',7 '-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)检测细胞活性氧(ROS)水平,流式分析仪检测细胞焦亡情况.结果 与正常对照组比较,H/R组培养液上清LDH和细胞内ROS水平明显升高,Drp1、Nlrp3、caspase-1、IL-1β表达增高,细胞焦亡明显增加,差异有统计学意义(P＜0.05);与H/R组比较,H/R+Mdivi-1组培养液上清LDH和细胞内ROS水平明显降低,Nlrp3、caspase-1、IL-1 β表达降低,细胞焦亡明显减少,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 在H/R条件下,Drp1通过激活Nlrp3炎性体诱导人肾小管上皮细胞焦亡.     

穹窿主体蛋白通过上调干扰素调节因子2抑制动脉内皮细胞凋亡

目的：探究穹窿主体蛋白（major vault protein,MVP）对动脉内皮细胞（endothelial cell,EC）增殖的作用,揭示MVP对动脉EC发挥保护作用的潜在机制。方法：以人主动脉EC（human aortic EC,HAEC）为细胞模型,感染慢病毒以抑制或过表达 MVP。使用CCK-8实验和流式细胞术检测细胞增殖活性和死亡。使用凋亡抑制剂Z-VAD和坏死性凋亡抑制剂Nec-1确定细胞死亡方式。以流式细胞术检测Annexin V结合阳性率和Caspase 3活性,以Western blot检测Caspase剪切体蛋白表达以评价细胞凋亡。以荧光定量PCR和Western blot 技术鉴定靶分子,并明确MVP与靶分子之间的调控关系。结果：敲降MVP抑制 HAEC增殖,促进HAEC死亡,过表达MVP结果则相反。Z-VAD逆转MVP敲降引起的死亡,而Nec-1无此作用。过表达MVP抑制TNF-α诱导的HAEC凋亡,敲降MVP时作用相反。MVP通过上调干扰素调节因子2（interferon regulatory factor 2,IRF2）促进凋亡抑制蛋白1（cellular inhibitor of apoptosis protein 1,cIAP1）的转录。敲降IRF2逆转MVP过表达引起的cIAP1表达增多和凋亡抑制。结论：MVP通过上调IRF2蛋白促进cIAP1转录表达从而抑制TNF-α诱导的HAEC凋亡,发挥对EC的保护作用。     

球形脂联素对间歇低氧所致H9C2细胞损伤的保护作用及机制

目的：探讨Parkin介导的线粒体自噬在球形脂联素(globular adiponectin,gAPN)减轻间歇低氧(intermittent hypoxia, IH)所致H9C2心肌细胞损伤中的作用及相关机制。方法：建立H9C2细胞IH模型来模拟阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征。 采用流式细胞术检测细胞凋亡。采用JC-1试剂盒检测线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP)。采用免疫印迹法检测Parkin、Bax、Bcl-2蛋白表达。采用Parkin siRNA抑制Parkin基因表达。采用LC3与线粒体红色荧光探针进行荧光共定位检测线粒体自噬。结果：IH暴露后,H9C2细胞凋亡率、Bax及Parkin蛋白表达水平、线粒体自噬明显升高,MMP下降,Bcl-2 蛋白表达水平下降;给予gAPN保护后,IH+gAPN组细胞凋亡率、Bax蛋白表达水平较IH组下降,MMP较IH组升高,Bcl-2及 Parkin蛋白表达水平、线粒体自噬也较IH组升高。抑制Parkin基因表达后,线粒体自噬明显下降,线粒体损伤、心肌细胞凋亡率明显增加。结论：gAPN通过上调Parkin介导的线粒体自噬减轻IH所致H9C2心肌细胞损伤。     

缺氧下调FTO并促进小鼠肺动脉平滑肌细胞迁移

目的：探究脂肪质量与肥胖相关蛋白(fat mass and obesity associated protein,FTO)对缺氧小鼠肺动脉平滑肌细胞 (mouse pulmonary artery smooth muscle cell,MPASMC)迁移能力的影响。方法：体外培养 MPASMC,用三气培养箱构建缺氧 MPASMC模型;免疫印迹实验用于检测FTO蛋白表达;FTO过表达以及敲低质粒转染MPASMC以过表达或抑制FTO表达;细胞划痕实验检测细胞迁移能力。结果：缺氧培养后的MPASMC中FTO蛋白表达明显下调,划痕实验提示细胞迁移加快,并在过表达FTO后明显减慢;常氧状态下敲低FTO表达出现了类似缺氧培养的“促迁移”表型。结论：在体外条件下MPASMC缺氧培养后FTO蛋白水平下调,细胞迁移能力增强,并且FTO可能是促进MPASMC迁移的关键调控基因。     

线粒体分裂蛋白抑制剂对癫痫大鼠海马神经元凋亡的影响

目的:研究线粒体分裂蛋白抑制剂(mitochondrial division inhibitor,Mdivi-1)对癫痫大鼠海马神经元凋亡的影响及机制。方法:121只雄性SD大鼠随机分成4组,分别为对照(CON)组、PILO组、PILO+DMSO组和PILO+Mdivi-1组。观察各组大鼠行为学改变,并分别采用尼氏染色法及TUNEL法检测神经元损伤及凋亡,Western blot法检测动力相关蛋白1(dynamin-releted protein 1,Drp1)和半胱天冬酶3(caspase-3)表达水平。结果:Mdivi-1组较PILO组致痫成功率降低(P>0.05),海马神经元损伤显著减轻(P<0.05)。Mdivi-1明显降低癫痫持续状态(status epilepticus,SE)引起的海马神经元凋亡和caspase-3激活(P<0.05)。结论:Mdivi-1对癫痫大鼠海马神经元凋亡有明显的抑制作用,其机制可能是抑制caspase-3激活。     

线粒体动力相关蛋白1与阿尔茨海默病

线粒体动力学是指线粒体通过分裂和融合维持线粒体网络的动态平衡并为细胞提供能量。在各种因素影响下,线粒体极易发生损伤,尤其是分裂异常导致其功能障碍与神经退行性疾病发生发展密切相关,而动力相关蛋白1(dynamin-related protein1,Drp1)是介导线粒体分裂的最关键蛋白。研究表明,Drp1在阿尔茨海默病(Aizheimer’s disease,AD)中表达增加介导的线粒体碎片化与AD病理相互影响,加速了疾病进程。本文通过对近几年关于Drp1蛋白结构、活性调控及其与AD相关的实验结论分析综合,为进一步明确Drp1与线粒体分裂和AD病理的关系、开发新的靶向线粒体动力学蛋白相关药物提供借鉴。     

共伴侣蛋白FKBP51在高脂诱导肥胖中的作用

目的 通过FKBP51基因敲除小鼠模型和细胞脂肪分化模型,探究FKBP51在高脂诱导肥胖中的机制。 方法 4周龄雄性野生型和FKBP51基因敲除小鼠以普通或高脂饲料单只单笼喂养6周,每周记录小鼠体重和饮食量,应用MM-100代谢笼系统,监测各组小鼠24 h内氧气消耗量、二氧化碳产生量、呼吸交换率和产热量的变化,对上述小鼠肝脏组织进行油红O染色,同时检测肝脏和脂肪组织代谢相关基因的表达情况。同时对取自野生型和FKBP51基因敲除小鼠的永生化成纤维细胞(MEF)进行脂肪诱导分化,观察FKBP51缺失对脂肪分化的影响。 结果 高脂饮食诱导后,两种基因型小鼠饮食量无明显变化,但与野生型小鼠相比,FKBP51基因敲除小鼠体重明显减轻,肝脏中脂滴减少。FKBP51基因敲除小鼠在基础和高脂诱导条件下,氧气消耗量、二氧化碳产生量、呼吸交换率以及产热量均高于野生型小鼠,肝脏中糖异生相关酶PEPCK、G6Pase等表达上调,脂肪中能量代谢相关基因UCP-1等表达上调。此外,FKBP51基因缺失的MEF诱导脂肪分化,细胞内脂滴明显少于野生型MEF细胞。 结论 FKBP51基因在脂肪合成和能量代谢方面起着重要作用,因此FKBP51基因缺失小鼠能够抵制高脂诱导的肥胖。     

精氨酸代琥珀酸合成酶⁃1对胰岛β细胞增殖与凋亡的影响

目的：探讨精氨酸代琥珀酸合成酶-1(argininosuccinate synthetase 1,ASS1)对胰岛β细胞增殖与凋亡的影响及机制。方法：利用siRNA和慢病毒载体在胰岛β-TC6细胞中分别敲低和过表达ASS1;5-乙炔基-2′-脱氧尿嘧啶核苷(5-ethynyl-2′- deoxyuridine,EdU)和CCK-8检测细胞增殖能力;Annexin V-PI流式细胞术和原位末端转移酶标记技术(terminal dUTP nick-end labeling assay,TUNEL)检测细胞凋亡水平;Western blot检测B细胞淋巴瘤-2(B-cell leukaemia-2,Bcl-2)蛋白、Bcl-2相关X蛋白 (Bcl-2 associated X protein,Bax)、半胱氨酸天冬氨酸酶3(Caspase3)、切割型半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3(cleaved Caspase- 3)、凋亡诱导因子(apoptosis inducing factor,AIF)、细胞核增殖抗原(Ki67)和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian rapamycin target protein,mTOR)的表达水平;RT-qPCR检测AIF、Ki67和mTOR mRNA水平。结果：①与对照相比,敲低ASS1后,胰岛β细胞EdU阳性率和CCK-8细胞增殖活力降低,TUNEL阳性细胞数和AV/PI检测的细胞凋亡率升高。胰岛β细胞内AIF表达量明显升高,Bax/Bcl-2比值下降,Caspase-3活性降低。②过表达ASS1后,TUNEL阳性细胞数和AV/PI检测的细胞凋亡率均较对照组降低,伴随胰岛β细胞内Ki67和mTOR表达量升高。但胰岛β细胞EdU阳性率和CCK-8细胞增殖活力无明显变化。结论： ASS1 过表达可能激活 mTOR 信号通路促进胰岛β细胞增殖;ASS1 表达降低时,胰岛β细胞可通过 AIF 途径启动细胞凋亡。 ASS1可能在胰岛β细胞的增殖和凋亡中发挥一定调控作用。     

依达拉奉在大鼠局灶性脑缺血细胞中对Drp1和Mfn2动态变化的影响

目的 探讨依达拉奉在大鼠局灶性脑缺血细胞中对Drp1及Mfn2动态变化的影响及其保护机制。方法 采用线栓法建立大脑中动脉缺血模型,并将72只大鼠采用数字表法随机分为假手术组、脑缺血组、依达拉奉组,每组又根据时间的不同分为1、3、7天3个不同亚组。HE染色观察大脑皮质神经元形态结构,Western blot法检测Drp1及Mfn2的蛋白含量,RT-PCR检测Drp1及Mfn2mRNA基因的表达情况。结果 脑缺血组的Drp1蛋白表达量明显高于假手术组及依达拉奉组（P<0.05）,在第1、3、7天中的表达呈递增的趋势,给予依达拉奉治疗后,可以下调Drp1蛋白的表达,差异有统计学意义（P<0.05）;脑缺血组的Mfn2蛋白表达量明显低于假手术组及依达拉奉组（P<0.05）,在第1、3、7天中的表达呈递减的趋势,给予依达拉奉治疗后可上调Mfn2蛋白的表达,差异有统计学意义（P<0.05）。RT-PCR表达结果与Western blot法检验结果一致。结论 依达拉奉治疗大鼠脑缺血可能与依达拉奉减少氧自由基生成、维持线粒体动态平衡使Drp1表达减少,Mfn2表达增多有关,从而发挥神经保护作用。     

内质网应激参与高磷诱导的血管平滑肌细胞钙化的作用机制

目的 探讨内质网应激是否参与高磷诱导血管平滑肌细胞钙化及其作用机制。方法 体外培养人胸主动脉血管平滑肌细胞（VSMC）,分为对照组、正常磷组（1.3 mmol/L磷,NP组）、高磷组（2.6 mmol/L磷,HP组）,培养10 d。茜素红染色后观察细胞钙盐沉积情况;实时定量PCR和Western blotting检测肌醇需求因子1 (IRE1)、RNA依赖的蛋白激酶样内质网激酶（PERK）、内质网应激标志蛋白C/EBP同源蛋白（CHOP）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）、骨形态发生蛋白2 (BMP-2)及Runt相关转录因子2 (Runx-2)的表达;应用CHOP siRNA转染高磷培养VSMC敲低CHOP表达后,检测BMP-2及Runx-2表达;应用JNK抑制剂SP600125 (DMSO溶解),终浓度10μmol/L预处理30 min后加入高磷培养基培养10 min,茜素红染色观察钙沉积情况。结果 与对照组及NP组比较,HP组内质网应激蛋白（IRE1、PERK、JNK、CHOP）及钙化蛋白（BMP-2、Runx-2）均明显增高（均P <0.01）。敲低CHOP表达后钙化蛋白...     

稳定敲低MYH10基因细胞株的建立

目的 构建稳定敲低MYH10基因的COS-7细胞株。方法 在293TX细胞中进行病毒的包装,用获得的高效价慢病毒感染COS-7细胞,通过免疫印迹和荧光显微镜,检测病毒感染后COS-7细胞MYH10蛋白表达的变化。结果 在构建的两种重组质粒中,MYH10-lentiviral shRNA-2在转染后表现出明显的干扰作用,感染后能明显下调COS-7细胞的MYH10蛋白表达。结论 病毒感染的COS-7细胞可明显抑制COS-7细胞内源MYH10的表达,说明了稳定敲低MYH10基因的COS-7细胞株的建立,为进一步研究MYH10在相关疾病中的功能奠定了基础。     

parkin对AD转基因果蝇模型的神经保护作用及其作用机制的研究

目的 探讨parkin在阿尔茨海默病(AD)发病机制中的作用.方法 利用经典的GAL4/UAS系统,选用ninaEGAL4启动子,将突变位点在R406W处的Tau蛋白在果蝇复眼内选择性表达,构建ninaE-GAL4/UAS系统AD转基因果蝇模型.然后分别在敲除和不敲除线粒体分裂蛋白Drp1情况下,使parkin在AD转基因果蝇模型中表达.结果 parkin明显抑制了AD转基因果蝇模型复眼视网膜光感受神经元变性,而在Drp1被敲除后,parkin的保护作用效果明显减弱.结论 parkin对AD转基因果蝇模型具有神经保护作用,而这种神经保护作用可能需要依赖线粒体分裂蛋白Drp1的功能.     

Sirt1在缺氧条件下对心肌细胞线粒体融合与分裂中的作用

目的 探讨缺氧条件下线粒体动态学变化及Sirt1在其中的作用.方法 ①收集2014年于新桥医院心血管外科行手术治疗的先心病患儿29例,其中非紫绀型先心病14例,紫绀型先心病15例,取术中所切除的右室流出道心肌组织为心肌标本,Western blot检测促线粒体分裂蛋白Drp1与Fis1表达情况.②将H9c2心肌细胞置入缺氧培养箱(94％N2,5％ CO2,1％ O2)中进行培养,检测缺氧0、2、4、8、12 h后促线粒体分裂蛋白Drp1与Fis1的表达水平.③将线粒体靶向质粒分别同空载质粒、Sirt1过表达质粒和Sirt1干扰质粒共转染H9c2细胞,常氧或缺氧培养箱中培养12 h后,激光共聚焦显微镜下观察线粒体融合、分裂情况;④运用腺病毒Ad-Sirt1和慢病毒Lv-Sh-Sirt1分别在H9c2细胞中过表达或干扰Sirt1后,将细胞置于缺氧培养箱中培养12 h,检测Drp1与Fis1表达水平;⑤分别转染空载质粒、Sirt1过表达质粒和Sirt1干扰质粒至H9c2细胞后,缺氧培养12 h,LDH试剂盒检测细胞毒性.结果 ①同非紫绀组相比,紫绀组心肌中Drp1与Fis1表达显著增高,Drp1相对灰度值:[(0.47±0.11)vs(0.76±0.12)、Fis1相对灰度值(0.53 ±0.02)vs (0.83 ±0.03),P＜0.05];②细胞水平研究结果显示Drp1与Fis1的蛋白表达随缺氧的时间的延长呈递增趋势;③激光共聚焦结果表明,Sirt1过表达后能够一定程度地缓解缺氧诱导的线粒体分裂(P＜0.05),而当Sirt1受到干扰后,缺氧所诱导的线粒体分裂水平明显提高(P＜0.05);④在缺氧条件下,过表达Sirt1能够抑制Drp1与Fis1蛋白表达水平(P＜0.05),而Sirt1被抑制后,Drp1与Fis1蛋白表达水平增加(对照组,过表达组,低表达组Drp1相对灰度值依次为[(0.47 ±0.02)vs(0.36±0.02) vs (0.78 ±0.04);Fis1相对灰度值依次为(0.64±0.02) vs (0.42±0.02) vs (0.80±0.04),P＜0.05];⑤Sirt1过表达能够降低缺氧刺激后H9c2心肌细胞的死亡率.结论 Sirt1可能通过调控促线粒体分裂蛋白Drp1与Fis1表达水平促进心肌细胞在缺氧条件下的适应.     

ACTN4对胃癌细胞侵袭转移的影响

目的 研究α-辅肌动蛋白（alpha-actinin-4,ACTN4）在胃癌SGC7901细胞及正常胃黏膜上皮RGM-1细胞中的表达及对胃癌SGC7901细胞侵袭和转移的影响。方法 通过qRT-PCR技术及蛋白印迹技术检测ACTN4在胃癌SGC7901细胞及RGM-1正常胃黏膜上皮细胞中的表达;利用RNAi技术敲低SGC7901细胞中的ACTN4表达,并应用qRT-PCR及蛋白印迹技术检测SGC7901细胞中ACTN4的沉默效果;通过Transwell实验检测细胞侵袭及转移能力的变化。结果 ACTN4在胃癌SGC7901细胞中明显高表达;ACTN4-siRNA可有效敲低SGC7901细胞中ACTN4的表达,敲低ACTN4的表达可以明显降低胃癌SGC7901细胞的侵袭转移能力。结论 ACTN4在胃癌细胞发生侵袭转移中发挥着重要作用。     

槲皮黄酮改善心肌细胞肥大过程中对线粒体功能及动力学的影响

[目的]探讨槲皮黄酮对原代心肌细胞肥大、线粒体功能及动力学的影响。[方法]原代培养大鼠心肌细胞,采用血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）及槲皮黄酮共同干预细胞48、72 h后,BCA试剂盒检测细胞中蛋白浓度,倒置显微镜分析心肌细胞直径;酶标仪检测心肌细胞内三磷酸腺苷（ATP）及活性氧（ROS）含量,JC-1方法分析心肌细胞线粒体膜电位（MMP）;蛋白免疫印迹（Western Blot）方法测定线粒体动力学相关蛋白视神经萎缩蛋白（OPA1）、动力相关蛋白（Drp1）及磷酸化动力相关蛋白1（p-Drp1）表达量。[结果]与空白组比较,模型组心肌细胞中总蛋白浓度、细胞直径大小及ROS水平显著升高（P<0.05）,ATP和MMP值则显著降低（P<0.05）,Western Blot结果发现OPA1蛋白表达水平显著降低（P<0.05）,p-Drp1蛋白表达水平显著升高（P<0.05）;与模型组比较,槲皮黄酮处理72 h后心肌细胞中总蛋白浓度、细胞直径大小及ROS水平显著降低（P<0.05）,ATP和MMP值则显著升高（P<0.05）,Western Blot结果发现OPA1蛋白表达水平显著增高（P<0.05）,p-Drp1蛋白表达水平显著降低（P<0.05）。[结论]槲皮黄酮对AngⅡ引起的心肌细胞肥大具有保护作用,其作用机制可能与降低心肌细胞线粒体功能障碍、稳定线粒体动力学平衡相关。     

双氢青蒿素诱导前列腺癌 PC-3 细胞凋亡及其机制研究

目的 研究双氢青蒿素对前列腺癌 PC-3 细胞的凋亡诱导作用,并探讨其可能的机制。方法 MTT 法测定不同浓度双氢青蒿素对 PC-3 细胞增殖的影响,流式细胞仪 (FCM)、透射电镜 (TEM) 观察双氢青蒿素对 PC-3 细胞的凋亡诱导作用,免疫组化 (SP) 检测双氢青蒿素对 PC-3 细胞内 Bax、Bcl-2 蛋白阳性表达的影响。结果 双氢青蒿素对 PC-3 细胞有明显增殖抑制效应,能诱导 PC-3 细胞凋亡且具有浓度-时间依赖性,导致 PC-3 细胞线粒体肿胀、核碎裂、凋亡小体形成;随着双氢青蒿素浓度的增加,Bcl-2 蛋白阳性表达降低,而 Bax 蛋白阳性表达增加。结论 双氢青蒿素可能通过上调 Bax,下调 Bcl-2 蛋白表达诱导前列腺癌 PC-3 细胞凋亡。     

泛素连接酶Cul7调控人滋养层细胞 Notch1蛋白稳定性

目的 探讨泛素连接酶Cullin 7(Cul7)在人胎盘绒毛外滋养层细胞HTR8/SVneo中对Notch1蛋白稳定性的影响,初步阐明Cul7对Notch1蛋白表达的调控作用。方法 Western blot法检测Cul7基因敲除的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)中Notch1蛋白表达的变化。慢病毒稳定转染构建Cul7低表达HTR8/SVneo细胞系,通过real-time PCR检测Notch1 mRNA的表达。Western blot法检测干扰或过表达Cul7后Notch1蛋白的表达。应用蛋白免疫共沉淀(Co-IP)确定Cul7与Notch1蛋白结合情况。结果 与野生型MEF细胞比较,Cul7基因敲除MEF细胞Notch1蛋白表达增加。在HTR8/SVneo细胞也观察到干扰Cul7后Notch1蛋白表达显著升高,但对Notch1 mRNA的表达无显著影响。用放线菌酮(CHX)处理细胞后,与对照组比较干扰Cul7使Notch1蛋白降解的半衰期延长。将Flag-Notch1重组质粒和HA-Cul7真核表达质粒导入HTR8/SVneo细胞后,Co-IP结果显示外源性Cul7与Notch1无结合。结论 Cul7调控Notch1降解速度,但对Notch1转录表达无显著影响。Cul7可能通过间接方式调控Notch1蛋白稳定性。     

基于Drp1-Ser637磷酸化探讨补阴牵正方对PD小鼠脑线粒体的影响

目的通过帕金森病(PD)小鼠脑动力相关蛋白1(Drp1)和其磷酸化位点丝氨酸637(Ser637)表达的变化及对脑线粒体的影响探讨补阴牵正方防治PD的可能机制。方法选用C57BL/6小鼠72只,随机分为正常组、模型组、补阴牵正方组、美多芭组,每组18只。除正常组外,其余3组小鼠腹腔注射1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)建立PD模型,补阴牵正方组灌胃补阴牵正方水煎剂,每天灌胃2次,连续28 d,美多芭组腹腔注射美多芭,隔天1次,共28 d。爬杆法、抓握法观察小鼠行为学;免疫荧光组化法观察中脑黑质酪氨酸羟化酶(TH)阳性神经元数目;荧光素酶法测定脑线粒体三磷酸腺苷(ATP);JC-1法检测脑线粒体膜电位;蛋白印迹法(Western blot)检测脑蛋白Drp1及其磷酸化蛋白Drp1-Ser637表达。结果相比正常组,模型组小鼠爬杆时间延长(P0.01),抓握力度减弱(P0.01),黑质TH阳性神经元数目减少(P0.01),脑线粒体膜电位及ATP水平降低(P0.01),脑Drp1蛋白表达增加(P0.01),Drp1-Ser637磷酸化蛋白表达降低(P0.01)。与模型组相比,补阴牵正方组小鼠在第14天爬杆时间缩短、握力明显增加(P0.05),黑质TH数目明显增加(P0.05),Drp1蛋白表达减少(P0.01),Drp1-Ser637磷酸化蛋白表达增加(P0.05),脑线粒体膜电位及ATP水平显著升高(P0.01);而美多芭组除在第14天行为学较模型组有明显改善外(P0.05),其余指标均无统计学差异;补阴牵正方组与美多芭组比较其黑质TH数目、ATP水平及膜电位均有差异(P0.05,P0.01),Drp1-Ser637磷酸化蛋白表达也显著增加(P0.01)。结论补阴牵正方可能通过下调维持线粒体动态平衡的分裂蛋白Drp1、上调Drp1-Ser637磷酸化位点的表达改善PD小鼠脑线粒体功能,从而保护中脑黑质多巴胺神经元达到防治PD的作用。     

线粒体动力学在OSAHS合并肥胖所致腓肠肌损伤中的作用及其机制研究

目的 探究慢性间歇性缺氧(chronic intermittent hypoxia, CIH)合并高脂饮食(high-fat diet,HFD)对小鼠腓肠肌的作用及其可能机制。方法 通过模拟CIH、HFD建立阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征(obstructive sleep apnea hypopnea syndrome, OSAHS)合并肥胖小鼠模型。分为正常对照组(NC组)、CIH组、HFD组、CIH+HFD组。采用苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色观察各组小鼠腓肠肌结构变化,采用三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)酶染色分析腓肠肌中肌纤维类型的改变,采用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测小鼠腓肠肌细胞中MHC同工型基因(MHC1、MHC2)和线粒体功能相关基因(Cs、Ant、NQO1、Hmox1、OGG1)的mRNA表达水平,采用蛋白质免疫印迹(Western blot)法检测细胞凋亡相关蛋白(cleaved-caspase-3)、线粒体融合蛋白(Mfn1、Mfn2、OPA1)及线粒体分裂蛋白(Drp1 Ser616、Fis1)的表达。结果 与NC组比较,CIH+HFD组小鼠的腓肠肌结构明显损伤,同时腓肠肌中Ⅰ型肌纤维减少,Ⅱ型肌纤维增加,腓肠肌细胞中MHC1mRNA表达水平下降、MHC2mRNA表达水平增加;另外,CIH+HFD组小鼠腓肠肌细胞中cleaved-caspase-3蛋白和线粒体分裂蛋白(Drp1 Ser616、Fis1)的表达明显上调,线粒体融合相关蛋白Mfn1表达下调。结论 CIH合并HFD能导致小鼠腓肠肌结构及功能损伤,该作用可能与线粒体动力学紊乱引起的线粒体功能障碍有关。