促血管生成素-2过表达重组腺病毒载体的构建

目的 构建小鼠促血管生成素-2(Ang-2)基因过表达重组腺病毒载体.方法 化学合成小鼠Ang-2编码序列,经PCR扩增、鉴定后连接至穿梭质粒.将含目的基因的重组质粒转化DH5α感受态细胞,所得阳性转化子经电泳分析并测序鉴定.将携带目的基因的穿梭质粒与辅助包装质粒共转染人胚肾细胞系HEK293细胞,反复冻融获取重组腺病毒,终点稀释法测定病毒滴度,重组腺病毒转染HEK293细胞并提取蛋白,采用免疫印迹法分析Ang-2蛋白的表达.结果 PCR产物电泳分析可见大小约1.5 kp的特征性条带,基因序列显示测序结果与GenBank提供的Ang-2序列一致,经 HEK293细胞包装后腺病毒滴度为1×108.8 pfu/ml,免疫印迹法分析可见大小57 kD特征性条带,即重组腺病毒可成功表达Ang-2蛋白.结论 Ang-2基因重组腺病毒载体可成功构建.     

促血管生成素-1基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的构建携带小鼠促血管生成素-1(Ang-1)基因的重组腺病毒载体并鉴定。方法化学合成小鼠Ang-1基因经PCR扩增后亚克隆至穿梭质粒,重组质粒转化感受态细胞,所得转化子经PCR电泳分析并测序鉴定,携带外源基因的腺病毒穿梭质粒与携带腺病毒大部分基因组的辅助包装质粒共转染人胚肾细胞系HEK 293细胞,反复冻融获取重组腺病毒,终点稀释法测定重组腺病毒滴度,所得腺病毒转染293T细胞48 h收集培养上清,通过Western Blot分析Ang-1蛋白的表达。结果 PCR产物电泳分析可见大小约1.5 kbp的特征性条带,测序结果显示基因序列与Gen Bank提供的Ang-1序列一致,经HEK293细胞包装后腺病毒滴度为1×109pfu/ml,转染293T细胞后培养上清Western Blot分析可见大小58 k D特征性条带,即转染后能分泌正确大小的重组Ang-1蛋白。结论 Ang-1基因重组腺病毒载体可成功构建,为进一步研究Ang-1蛋白对造血干细胞动员及血管新生的作用提供实验依据。     

应用AdMax载体系统构建SCL基因重组腺病毒表达载体

目的 用AdMax载体系统构建人SCL基因重组腺病毒载体,为研究SCL基因对ICC样细胞功能恢复奠定基础.方法 采用PCR方法从含人SCL基因质粒中扩增SCL基因,连接到腺病毒穿梭质粒的多克隆位点上,构建重组穿梭质粒pDC315-EGFP/SCL,在脂质体介导下与腺病毒辅助大质粒pBHGlox(delta)E1、3Cre共转染293细胞,包装产生复制缺陷型重组腺病毒pDC315-SCL经HEK293细胞扩增,纯化后测定病毒滴度.结果 PCR结果和Western blotting检测证实pDC315-SCL重组腺病毒载体构建成功,滴度达到1×1010 PFU/mL.结论 AdMax载体系统可成功构建pDC315-SCL重组腺病毒载体.     

PTG重组腺病毒过表达载体的构建

目的 构建及鉴定携带小鼠PTG基因(NM＿016854)的过表达重组腺病毒载体,为深入研究PTG的功能奠定基础。方法 化学合成小鼠PTG基因的编码序列,经聚合酶链式反应(PCR)扩增、酶切,后插入GV314载体(CMV-MCS-3FLAG-SV40-EGFP),得到重组穿梭质粒pGV314-PTG;进一步BamHⅠ/AgeⅠ双酶切,产物交换入线性化表达载体pDC315,构建重组腺病毒Ad-PTG,将其转染HEK293T细胞包装成重组病毒颗粒,经在HEK293T细胞反复扩增数代后,进行纯化及滴度检测,最后利用PCR、Western blot及测序验证重组腺病毒。结果 经PCR、Western blot及测序后,结果显示成功构建pGV314-CMV-MCS-3FLAG-SV40-EGFP-PTG过表达腺病毒载体(Ad-PTG),终点稀释法测得病毒滴度为4×10¹⁰ PFU/ml, Western blot和荧光定量PCR显示PTG的蛋白和mRNA表达水平显著升高。结论 成功构建携带小鼠PTG基因的重组过表达腺病毒载体,且能有效上调肝细胞中PTG基因的表达。     

小鼠树突状细胞相关C型凝集素-1基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的树突状细胞相关C型凝集素-1(dendritic cell-associated C-type lectin-1,Dectin-1)是介导抗真菌天然免疫的重要受体之一。文中旨在构建表达小鼠Dectin-1基因的重组腺病毒载体,扩增、纯化获得高浓度的重组腺病毒。方法将PCR扩增的目的片段CLEC7A-p IRES2-EGFP重组到中间载体p DONR221上,再与腺病毒骨架质粒p AD/CMV/V5-DEST重组,获得重组腺病毒质粒p AD-CLEC7A-p IRES2-EGFP,经Pac I线性化后转染人胚肾293(HEK293)细胞,收获重组腺病毒p AD-CLEC7A-p IRES2-EGFP;利用HEK293细胞大量扩增腺病毒;并进行重组腺病毒的滴度测定;用荧光显微镜和实时荧光定量PCR鉴定转染重组腺病毒组(Dectin-1基因重组腺病毒转染HEK293细胞)和转染空病毒组(空病毒转染HEK293细胞)中Dectin-1基因的表达。结果菌落PCR鉴定、酶切鉴定及测序结果均显示重组腺病毒含有Dectin-1基因,腺病毒滴度为5×1011IU/m L,荧光显微镜下可见绿色荧光,PCR检测到转染重组腺病毒组Dectin-1表达量是转染空病毒组的8677.25倍。结论成功构建并获得了较高浓度的Dectin-1基因重组腺病毒载体,为下一步体内外研究Dectin-1高表达在宿主抗真菌天然免疫中的作用奠定基础。     

人canstatin基因重组腺病毒载体的构建及其病毒制备

目的:利用HEK293细胞内同源重组法构建带有绿色荧光蛋白报告基因的人血管能抑素(canstatin)重组腺病毒载体,扩增并纯化重组腺病毒颗粒.方法:PCR法扩增cansta-tin全长基因,克隆至pGEM-T载体,经酶切和测序证实后,亚克隆到穿梭质粒pAdS-CMV中,获得穿梭质粒pAdS-CMV/canstatin.用PasI酶单独酶切穿梭质粒pad5-CMV/canstatin和腺病毒E3区带有绿色荧光蛋白表达元件的腺病毒骨架载体,采用标准的磷酸钙方法共转染HEK293细胞.7～10 d后收获细胞裂解物,在HEK293细胞中扩增,病毒颗粒经氯化铯密度梯度离心纯化后,分光光度计检测重组病毒滴度.结果:测序证实pEGM-T/canstatin基因片段与GenBank公布的can-statin基因序列一致.重组腺病毒质粒转染293细胞后24 h观察到绿色荧光,病毒纯化后制备出高滴度重组腺病毒(病毒滴度为2.0×1015pt/L).结论:成功构建了表达canstatin基因的重组腺病毒载体并制备了重组腺病毒颗粒,为研究该基因在肿瘤治疗中的作用奠定了基础.     

人BMP-7基因重组腺病毒的构建与鉴定

目的 构建含有人骨形态发生蛋白-7(bone morphogenetic protein-7,BMP-7)基因的重组腺病毒载体,并对其相关指标进行鉴定,观察其对肾小管上皮细胞株(HKC)细胞的转染情况.方法 用基因工程技术将人BMP-7基因cDNA亚克隆至穿梭质粒pDC316上,利用脂质体介导的方法将AdMax腺病毒包装系统的骨架质粒pBHGlox_E1,3Cre和穿梭质粒pDC316-BMP-7转染入HEK293细胞,进行同源重组,得到腺病毒重组质粒Ad5-BMP-7,并在其中包装扩增病毒.采用PCR方法对重组腺病毒进行鉴定,利用穿梭质粒中所带绿色荧光蛋白GFP报告基因,进行病毒滴度的测定和对HKC细胞感染效率的检测.结果 酶切鉴定及PCR结果证明BMP-7基因重组腺病毒载体构建成功,病毒滴度达1.25 × 1010PFU/ml,对HKC有较强感染能力.结论 应用细胞内同源重组方法成功构建了含人BMP-7基因的重组腺病毒载体.     

携带神经导向因子netrin-1基因的重组腺病毒构建

目的:制备并构建神经导向因子netrin-1(NT-1)和EGFP双基因共表达的重组腺病毒载体,为后续的基因转染做准备.方法:采用基因克隆技术克隆目的基因NT-1,并将目的基因克隆入含有报告基因EGFP的穿梭载体pDC316质粒;构建的质粒pDC316-netrin经酶切及测序鉴定正确后.通过脂质体lipofeetamine2000的介导与腺病毒包装质粒pBHGlox_E1.3Cre共转染至人胚肾细胞HEK293,经同源重组后得到携带鼠NT-1的重组腺病毒Ad5-netrin-CMV-EGFP.应用PCR鉴定重组腺病毒,空斑传代纯化病毒并反复冻融扩增病毒.以50%组织培养感染剂量法(TCID50)测定病毒滴度.结果:PCR鉴定证实重组腺病毒含有鼠NT-1基因,病毒滴度为5.2×109pfu/ml,EGFP活性检测腺病毒感染阳性细胞率在40%以上.结论:成功制备Ad5-netrin-CMV-EGFP腺病毒,为以后基因治疗研究打下基础.     

Betatrophin重组腺病毒过表达载体的构建

［摘要］目的: 应用基因同源重组技术,构建及鉴定携带小鼠betatrophin基因Gm6484(NM_001080940)的复制缺陷型重组腺病毒载体,为进一步研究betatrophin的功能奠定基础。方法: 根据基因库中登录的小鼠betatrophin基因Gm6484(NM_001080940)序列,经化学合成得到含BamHⅠ/ AgeⅠ酶切位点的小鼠betatrophin基因全长cDNA质粒,将其酶切后插入到带有增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）基因的GV314载体CMV MCS 3FLAG SV40 EGFP中,得到重组病毒穿梭质粒pGV314 betatrophin;经BamHⅠ/ AgeⅠ双酶切后,与线性化的pDC315病毒基因组质粒体外同源重组,构建含有目的基因的腺病毒载体Ad betatrophin,酶切线性化重组腺病毒质粒后转染HEK293T细胞包装成重组病毒颗粒,经在HEK293T细胞反复扩增数代后,利用聚合酶链式反应（PCR）、蛋白质印迹法及测序鉴定重组的腺病毒。结果： 阳性克隆质粒Ad betatrophin在HEK293T细胞中成功包装出重组病毒,经PCR、蛋白质印迹及测序检测表明重组腺病毒包装成功。结论： 成功构建了携带小鼠betatrophin基因的复制缺陷型重组腺病毒过表达载体。     

hVEGFA基因重组腺病毒载体的构建及其转染效率的研究

目的:应用AdEasy复制缺陷型腺病毒载体系统构建携带hVEGFA基因的重组腺病毒载体.方法:采用分子克隆技术,从PCR2.1-hVEGFA质粒中克隆出hVEGFA基因的编码序列,酶切、连接后,插入腺病毒系统中的穿梭载体pAdTrack-CMV,获得重组质粒pAdTrack-CMV-hVEGFA,将其转化含有腺病毒骨架载体pAdeasy-1的大肠埃希菌BJ5183,进行同源重组,获得重组子pAdeasy-1-hVEGFA.鉴定后,将pAdeasy-1-hVEGFA转染人胚肾细胞(HEK293A细胞),获得含hVEGFA基因的重组腺病毒(rAd-hVEGFA).反复感染HEK293A细胞扩增腺病毒,50%组织培养感染量法(TCID50)检测病毒滴度,荧光显微镜观测绿色荧光蛋白(GFP)的表达.结果:成功构建出含有hVEGFA基因的腺病毒载体rAd-hVEGFA,转染HEK293A细胞后出现绿色荧光蛋白表达,证明腺病毒载体rAd-hVEGFA 转染成功,通过反复感染HEK293A细胞获得大量病毒.结论:成功构建含有hVEGFA基因的腺病毒载体rAd-hVEGFA,可为缺血性脑血管疾病的基因治疗提供基因载体.     

携带人脂联素基因重组腺病毒的构建及表达

目的构建携带人脂联素基因的重组腺病毒载体,为进一步研究脂联素的功能提供实验基础。方法以带有人脂联素基因的质粒pINCY—APM1为模板,聚合酶链反应扩增人脂联素基因APM1,并将其定向克隆于真核表达载体pDC315-EGFP,与辅助质粒pBHGlox△E1,3Cre共转染HEK293细胞,经位点特异重组包装得到重组腺病毒Ad—APM1。通过Real—timePCR和Westernblot分别检测重组腺病毒Ad—APM1感染HEK293细胞后的表达。结果重组腺病毒Ad-APM1包装成功,病毒滴度〉6．3×10^12pfu／mL。Real—timePCR和Westernblot检测证实APM1在HEK293中表达。结论应用细胞内同源重组方法成功构建了携带人脂联素基因的重组腺病毒。     

以AdMax载体系统构建携带HCV NS5B基因的重组腺病毒表达载体

目的构建表达丙型肝炎病毒(HCV)非结构基因NS5B的重组腺病毒表达载体,并对其相关指标进行鉴定,为进一步研究防止丙型肝炎感染的基因免疫和基因治疗奠定实验基础。方法应用基因工程技术将HCVNS5B基因定向克隆至穿梭质粒pDC316上,利用脂质体介导的方法将AdMax腺病毒包装系统的骨架质粒pBHGloxΔE1、3Cre和穿梭质粒pDC316-NS5B共转染293细胞,进行同源重组,产生重组腺病毒pAd-NS5B并进行鉴定、反复感染293细胞进行扩增,扩增后测定重组病毒滴度。结果重组病毒颗粒pAd-NS5B经双引物PCR、凝胶电泳证明插入片段与HCV非结构基因NS5B片段大小相符;经测序证明其插入序列与设计HCV NS5B基因序列完全一致,扩增后重组病毒滴度达到2.3×1013IU/L。结论成功构建了表达HCV NS5B基因的重组腺病毒载体。     

携带凋亡抑制蛋白Livinα基因的重组腺病毒载体的构建

目的构建携带凋亡抑制蛋白Livinα和绿色荧光蛋白(GFP)基因的重组腺病毒pAd-Livinα。方法 PCR扩增Livinα基因片段,克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV中,再与骨架质粒pAdEasy-1在大肠杆菌BJ5183中同源重组,在人胚肾293细胞中包装扩增得到携带Livinα和GFP基因的重组腺病毒pAd-GFP-Livinα。采用PCR对重组腺病毒进行鉴定。结果经酶切及PCR鉴定证实携带Livinα的重组腺病毒载体构建成功,并可在人胚肾293细胞中表达,病毒滴度2.15×1010 pfu/mL。结论成功构建了携带Livinα和GFP基因的重组腺病毒载体系统,为进一步研究Livinα的生物学特性奠定了基础。     

抑制HBV复制的小干扰RNA的重组腺病毒构建与鉴定

目的构建可同时表达绿荧光蛋白（GFP）和针对HBVS区基因的小干扰RNA（siRNA）的重组腺病毒,并研究该siRNA在体外对HBV的抑制作用。方法采用PCR技术自质粒pEGFP-C1中扩增含CMV启动子的GFP表达框,自质粒pAVU6＋4sh579中扩增含U6启动子的针对HBV S 区579-597位基因的siRNA表达框,分别将两个表达框克隆至穿梭载体质粒pShuttle内,与质粒pADEasy-1在大肠杆菌BJ5183内进行同源重组,将阳性重组体DNA转染至人胚肾细胞株HEK293细胞中进行包装、扩增,并在HepG2.2.15细胞中初步观察其对HBV复制的抑制疗效。结果构建了可同时表达GFP和siRNA的重组腺病毒,其可在HEK293细胞中进行包装、扩增,并在HepG2.2.15细胞中对HBV-DNA、HBsAg和HBeAg的表达具有抑制作用。结论成功构建了可同时表达GFP和针对HBV的siRNA的重组腺病毒,并在体外实验中证实了其对HBV复制具有抑制作用。     

基质金属蛋白酶组织抑制剂1基因重组腺病毒载体的构建

目的 为探讨基因治疗逆转或延缓椎间盘退变的可行性,构建及制备人基质金属蛋白酶组织抑制剂1 (tissue inhibitor of metalloproteinase 1,TIMP1) cDNA重组腺病毒载体.方法 以含TIMP1 cDNA序列的质粒为模板,通过PCR方法扩增TIMP1cDNA片段,将TIMP1 cDNA全长定向克隆到Ad5MaxTM腺病毒系统的穿梭质粒pDC316上,构建pDC316-TIMP1穿梭质粒;使用Ad5MaxTM腺病毒包装系统,脂质体介导的穿梭质粒及骨架质粒pBHGlox-E1,3Cre共转染HEK293细胞,同源重组构建含TIMP1 cDNA的重组腺病毒Ad5-TIMP1,通过PCR方法鉴定重组腺病毒Ad5-TIM P1的正确性.通过阴离子柱层析方法纯化重组腺病毒Ad5-TIMP1并测定重组腺病毒感染滴度.结果 经PCR及酶切方法证实pDC316-TIMP1穿梭质粒中存在630 bp大小左右的插入片段,与目的基因TIMP1的cDNA大小一致;经PCR鉴定证实TIMP1 cDNA重组腺病毒载体Ad5-TIMP1构建成功,病毒感染性滴度为1×1010 IU/mL.结论 成功构建TIMP1 cDNA重组腺病毒载体,为应用基因治疗方法逆转或延缓椎间盘退变的研究奠定实验基础.     

小鼠CD40Ig基因真核表达质粒的构建及鉴定

目的：构建含小鼠CD40Ig基因的真核表达载体，为诱导供体特异性移植物的免疫耐受的基因治疗作准备。方法：以小鼠脾脏总RNA为模板，以RT-PCR法克隆小鼠CD40胞外段cDNA及IgG2a Fc段cDNA；另以pEGFP-N1质粒为模板获得绿色荧光蛋白（GFP）基因。将所得基因片段插入真核表达载体pDC516中得到重组质粒pDC516-CD40-IgG-GFP，测序鉴定正确后，用脂质体2000将其转染人胚肾上皮细胞（HEK293细胞），荧光显微镜下观察融合蛋白的表达。结果：成功构建了小鼠CD40Ig基因真核表达质粒pDC516-CD40-IgG-GFP，并在HEK293细胞中实现表达。结论：小鼠CD40Ig基因真核表达质粒pDC516-CD40-IgG-GFP构建成功，为诱导供体特异性移植物免疫耐受的研究奠定了基础。     

狨猴血清中重组人5型腺病毒中和抗体滴度的测定

目的构建表达荧光素酶与绿色荧光蛋白报告基因的重组人5型腺病毒rAd5/Luc/GFP,检测血清中和抗体最佳实验方法, 分析小型灵长类动物普通棉耳狨猴体内腺病毒5型中和抗体水平,为评价腺病毒载体疫苗提供实验动物基础数据。方法利用 ADMax包装系统,首先构建穿梭质粒pDC315-Luc-GFP,将所得的穿梭质粒和骨架质粒pBHGloxΔE1,3Cre共转染293A细胞, 进行重组人5型腺病毒（rAd5/Luc/GFP）的包装。通过3次空斑形成实验筛选出单克隆重组腺病毒,并在大量扩增单克隆腺病毒 后用CsCl密度梯度离心法进行浓缩纯化。采用TCID50法测定纯化后病毒滴度,并挑选进行中和实验的最优病毒滴度。将合 适病毒滴度的rAd5/Luc/GFP与狨猴血清混合预孵育后感染293A细胞,分别采用化学发光法及流式细胞术,对14只普通棉耳狨 猴血清中腺病毒5型中和抗体进行检测。结果PCR、酶切和测序结果均表明穿梭质粒pDC315-Luc-GFP构建成功;GFP检测 结果证明重组人5型腺病毒rAd5/Luc/GFP包装扩增成功,病毒滴度可达6.9×1011.5 PFU/mL。两种不同方法检测检测14只狨猴 的中和抗体结果一致性较好（P<0.05,Kappa=0.811）,化学发光法或流式细胞术检测阳性狨猴比率分别为28.6%（4/14）或21.4% （3/14）,化学发光法检测得其中2只狨猴中和抗体滴度为1/16,另2只为1/32,而流式细胞术检测得滴度均为1/16。结论化学发 光法是一种快速,准确,适用于多物种的方法,其灵敏度略高于以GFP为报告基因的流式细胞术（7.2%）。普通棉耳狨猴体内 Ad5血清阳性率较低,有望应用基于此型或其他型别腺病毒作为载体进行基因治疗和基因疫苗研究。     

密码子优化的HIV-1型gp120基因重组腺病毒载体疫苗的构建与鉴定

目的 构建密码子优化型gp120基因重组腺病毒载体（rAden-mgp120）,为研发新型HIV预防性疫苗奠定基础.方法 首先利用PCR的方法扩增mgp120基因,将目的基因克隆入载体pENTR/D-TOPO以获得重组穿梭载体克隆pENTR/D-TOPO-mgp120.经过穿梭载体克隆与表达载体（pAd-CMV/VS-DEST）间的重组反应获得表达克隆质粒pAden-mgp120,表达克隆线性化后转染HEK293A包装细胞,得到复制缺陷型重组腺病毒rAden-mgp120.结果 经PCR和测序鉴定,重组载体rAden-mgp120构建正确,转染HEK293A细胞并扩增后获得的病毒滴度为6.8x1011pfu/ml,该重组腺病毒载体能正确表达mgp120蛋白.结论 成功构建了重组腺病毒rAden-mgp120为HIV-1预防奠定了基础.