重叠区扩增基因拼接法在构建膜锚定金黄色葡萄球菌肠毒素A融合基因上的应用

目的：将超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因与人胎盘碱性磷酸酶(hPLAP-1)C末端信号肽序列进行拼接，形成融合基因。方法：利用重叠区扩增基因拼接法，分别扩增hPLAP-1C末端信号肽序列和SEA基因序列。然后，将二段基因拼接并与pGEM-T克隆栽体连接，酶切和测序鉴定。结果：成功扩增出hPLAP-1C末端信号肽序列131bp和SEA基因序列796bp；经测序证实，二段基因序列成功拼接(901bp)。结论：重叠区扩增基因拼接法能将SEA基因与hPLAP-1C末端信号肽序列拼接，形成融合基因。     

小鼠IFN-γ基因佐剂对分泌型柯萨奇病毒B3 VP1核酸疫苗免疫作用的影响

目的: 构建小鼠IFN-γ真核表达质粒,观察其对分泌型柯萨奇病毒B3(CVB3)核酸疫苗的影响. 方法: 以RT-PCR扩增小鼠IFN-γ基因,构建真核表达重组质粒pcDNA3/mIFN-γ,检测其在cos-7细胞内的表达;将分泌型pcDNA3/sVP1, pcDNA3/sVP1 pcDNA3/mIFN-γ肌注免疫小鼠,每2 wk注射1次,共3次,每次免疫后13 d取血测血清抗体水平. 末次免疫后2 wk,以500 TCID50的CVB3腹腔内感染,观察小鼠的存活情况. 结果: 成功构建了pcDNA3/mIFN-γ并能有效表达;pcDNA3/sVP1组和pcDNA3/sVP1 pcDNA3/mIFN-γ组均能诱导小鼠产生中和抗体,抗体滴度随免疫次数的增加而提高,但两组小鼠抗体滴度和生存率无显著性差异;混合质粒注射组血清的病毒滴度明显低于pcDNA3/sVP1组,且心肌病理损伤明显减轻. 结论: IFN-γ作为基因佐剂,在一定程度上增强了分泌型 CVB3 VP1基因疫苗的免疫保护作用.     

CVB3VP1与IL-2基因双表达重组质粒的构建及免疫效果

目的 探讨白细胞介素-2(intefleukin-2，IL-2)基因佐剂对柯萨奇病毒B3(Coxsackievirus B3，CVB3)基因疫苗的免疫增强作用。方法 从CVB3VP1基因的重组质粒peDNA3／VP1上扩增出带有完整表达构件的VP1基因，克隆至pcDNA3／IL-2，构建成CVB3VP1基因和IL-2基因双表达质粒pcDNA3／VP1-IL-2，转化DH5a大肠杆菌。将peDNA3／VP1-IL-2、peDNA3／IL-2 peDNA3／VP1、pcD．NA3／VP1、peDNA3／IL-2、空白质粒peDNA3和生理盐水分别肌肉注射BALB／C小鼠，每周注射1次，共注射3次，每次注射后的第6天，断尾取血，用微量中和试验方法检测血清中和抗体；第3次注射后的第7天，用800TCID50CVB3感染小鼠，观察各组小鼠的生存情况。结果pcDNA3／VP1-IL-2、pcDNA3／IL-2 pcDNA3／VP1和pcDNA3／VP1组小鼠能产生中和抗体，抗体滴度随免疫次数增加而提高，pcDNA3／VP1-IL-2和pcDNA3／IL-2 pcDNA3／VP1组抗体水平高于同期pcDNA3／VP1组抗体水平，但各组小鼠的生存率无明显差异。结论IL-2基因单独或与VP1基因共表达对pcDNA3／VP1诱导抗体产生均有一定免疫增强作用。     

柯萨奇病毒B1/B3型二价VP1基因疫苗的构建及其免疫试验

目的 构建柯萨病毒（CV）B1／B3型二价VP1免疫质粒,并探讨其免疫原性。方法 通过逆转录聚合酶链反应（RT－PCR）技术扩增CVB1的主要中和抗原VP1基因,将分别由CMV和SV40启动子控制的 CVB1和CVB 3的VP1基因反向串联插入到真核表达载体pCR3-Uni中。将该质料一转染鼠NIH3T3细胞,于转染后24、48、96h进行免疫荧光及RT－PCR检测,应用重组质粒免疫BALB／c小鼠,于免疫前、免疫后2 、4、6周分别断尾采血,用ELISA方法检测CVB特异性抗体。结果 获得了含有CVB1和CVB3的VP1南粒,RT－PCR及免疫荧光检测结果表明该质粒在NIH3T3细胞获得瞬时表达,小鼠免疫后4、6周均有特异性抗体产生。结论 本研究构建的CVB1／B3型二价VP1基因疫苗能诱导小鼠产生CVB特异性抗体,可以作为候选基因疫苗。     

C3d对分泌型柯萨奇病毒B组3型VP1 DNA疫苗的免疫增强作用

目的 构建分泌型柯萨奇病毒B组3型（CVB3）衣壳蛋白1（sVPl）与三拷贝补体3片段（C3d3）融合基因疫苗,并观察其免疫效果。方法 将C3d3 cDNA与带有白细胞介素2（IL-2）信号肽的CVB3VPl基因拼接,构建真核表达质粒pcDNA3／sVP1-C3d3。BALB／c小鼠随机分为3组,分别肌肉注射pcDNA3／sVP1-C3d3、pcDNA3／sVP1和pcDNA3质粒,于不同时间检测小鼠血清中和抗体滴度、特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）杀伤活性、血中病毒滴度,并观察疫苗的免疫保护作用。结果 小鼠的中和抗体滴度随免疫次数增加而提高,第3次免疫后pcDNA3／sVP1-C3d3组中和抗体滴度（33．6±1．7）和特异性CTL杀伤率（66．1％±2．9％）均明显高于pcDNA3／sVP1组（28．3±1．7,52．8％±3．3％,均P〈0．05）;以致死量CVB3感染小鼠后,经融合基因免疫的小鼠血中病毒滴度显著降低,生存率达50％,而pcDNA3／sVP1组仅为25％,pcDNA3组无存活。结论 C3d可以显著增强sVPI基因免疫诱导的特异性免疫应答。     

轮状病毒新型VP6基因的拼接合成和序列测定

目的：设计获得轮状病毒（RV）新型VP6基因．方法：本研究在前期工作的基础上,对RV VP6基因的优化合成方法进行了探索研究．我们应用改良的嵌套式PCR策略,通过逐步拼接法对RV VP6基因进行了优化改造．结果：成功地合成了优化的RV VP6基因cDNA序列,该序列长约1220bp,（G＋C）含量达55％．结论：与野生型RV VP6基因相比,优化合成的RV VP6基因（G＋C）含量提高了约20％,这一工作为新型高效口服RV基因工程疫苗的深入研究奠定了基础．     

人白细胞介素12两个亚基基因p35、p40拼接的新方法

目的: 探讨人白细胞介素12(IL-12)两个亚基基因通过连接肽基因进行拼接的新方法。为进一步研究IL-12基因的生物学功能以及应用提供实验基础。方法：采用两个牛弹性蛋白基序（10个氨基酸）的基因序列为两个亚基基因拼接的连接肽基因。根据人IL-12 p35、p40两个亚基基因片段以及连接肽基因核苷酸序列设计引物,其中p40基因下游引物包括部分连接肽基因序列以及Kpn Ⅰ 酶切位点,p35基因上游引物包括部分连接肽基因序列以及Kpn Ⅰ 酶切位点。通过聚合酶链反应(PCR)方法分别获得人IL-12 p35与p40基因片段。利用Kpn Ⅰ内切酶对p35与p40基因的PCR产物进行酶切,酶切产物回收后利用T4 DNA连接酶进行连接,应用p40基因上游引物与p35基因下游引物对连接产物进行PCR扩增。利用Kpn Ⅰ内切酶对连接产物进行酶切鉴定。将扩增的连接产物克隆入T载体,挑选阳性克隆并进行酶切鉴定,酶切鉴定正确的克隆进行拼接产物的核苷酸序列测序。结果：通过PCR分别获得约1 000 bp大小的p40基因片段与600 bp大小的p35基因片段,两个基因酶切片段连接后PCR扩增获得1 600 bp左右的拼接产物,采用Kpn I 内切酶对拼接产物进行酶切后获得约1 000和600 bp大小的基因片段,分别与p40和p35基因片段大小一致。拼接产物的T载体经酶切鉴定可见1 600 bp 大小的酶切产物,拼接产物测序结果与GenBank核酸数据库上的p40基因、p35基因以及连接肽基因核苷酸序列完全一致。结论：利用该基因分子拼接技术成功地将人白介素12两个亚基基因通过连接肽基因进行拼接。建立了一种简单、方便、有效进行人白细胞介素12两个亚基基因拼接的新方法,为进一步研究IL-12的生物学功能以及基因治疗提供实验基础。     

柯萨奇B组病毒3型VPI基因疫苗免疫效果的研究

目的为研制防治病毒性心肌炎的基因疫苗打下基础。方法以带有CVB。P1、P2区核酸序列的pGEM质粒为模板,用PCR方法克隆CVB3VP1基因cDNA,插入真核表达载体pcDNA3中的HindⅢ和XbaⅠ位点之间,构建成重组质粒。经大量扩增纯化后,肌肉注射免疫BALB／c小鼠3次,用CVB3毒株攻击小鼠,取血及脾细胞检测其免疫效果。结果小鼠经3次免疫后,虽未测出明显免疫应答指标,但诱导了T、B细胞的免疫记忆反应,免疫组鼠在CVB3毒株攻击后,迅速诱导产生了强烈的二次免疫应答。结论CVB3VP1基因疫苗对CVB3毒株的攻击有一定程度的保护作用。     

柯萨奇病毒B组3型VP1基因真核表达重组质粒的构建及免疫效果

目的构建柯萨奇病毒B组 3型 (CoxsackievirusesgroupB3,CVB3)VP1基因的真核表达重组质粒pcDNA3/VP1,并观察它对小鼠的免疫保护作用。方法从CVB3感染细胞中扩增出VP1片段 ,构建真核表达重组质粒 pcDNA3/VP1,经大量扩增纯化后 ,肌内注射免疫BALB/c小鼠 ,每次免疫后的第 6天 ,断尾取血检测CVB3中和抗体 ;3次免疫后用致死量 (10 0 0TCID50 )的CVB3感染小鼠 ,观察 pcDNA/VP1对小鼠的免疫保护作用。 结果pcDNA3/VP1重组质粒免疫小鼠后 ,能诱导机体产生中和抗体 ,各次免疫后抗体滴度分别为 <1∶5 ,1∶5 .7和1∶34.8;用致死量CVB3感染小鼠 ,pcDNA3/VP1重组质粒免疫组、pcDNA3质粒对照组及生理盐水对照组生存率分别为 30 %、2 0 %及 15 % ,3组小鼠生存率无明显差异 (P >0 .0 5 )。结论 pcDNA3/VP1重组质粒在小鼠体内能够表达并能诱导机体产生中和抗体 ,抗体滴度随免疫次数增加 ,但免疫小鼠对致死量的CVB3感染无明显保护作用     

抗CD_3单克隆抗体激活的杀伤细胞的细胞化学研究

采用抗ＣＤ_３单克隆抗体和重组白细胞介素２共刺激外周血单个核细胞并经重组白细胞介素２扩增制备抗ＣＤ３单克隆抗体激活的杀伤细胞（ＣＤ３ＡＫ）。细胞化学研究表明５６．５％的ＣＤ３ＡＫ为酸性非特异性酯酶阳性淋巴细胞，糖原过碘酸雪夫反应阳性细胞和酸性磷酸酶阳性细胞较对照增多。     

当归A3活性部位的抗炎作用及其对大鼠离体子宫环氧化酶-2表达的影响

目的研究当归A3活性部位(A3)的抗炎作用及其对脂多糖(LPS)诱导离体大鼠子宫环氧化酶-2(Cox-2)表达增高的影响。方法采用二甲苯致小鼠耳廓肿胀和角叉菜胶致大鼠足趾肿胀法进行抗炎药效学实验;采用RT-PCR和Westernblotting法检测Cox-2mRNA及蛋白表达水平。结果A3(1、5、10mg/kg)可剂量依赖性地抑制二甲苯所致的小鼠耳廓肿胀和角叉菜胶所致的大鼠足趾肿胀。LPS1μg/mL可显著增加离体大鼠子宫Cox-2mRNA和蛋白表达水平。A3(10~320mg/L)剂量依赖性地抑制LPS诱导的子宫Cox-2mRNA和蛋白表达水平增高。结论A3具有较强的抗炎作用,其抗炎作用机制可能与抑制Cox-2mRNA及蛋白表达有关。     

2型糖尿病人群中血清维生素 D水平对同型半胱氨酸的影响

目的：研究2型糖尿病人群中不同的血清维生素D2、D3水平下同型半胱氨酸的变化。方法：采用高效液相设谱－质谱联用法（ LC－MS／MS）定量测定糖尿病人群中血清维生素D 2和D 3、同型半胱氨酸（ Hcy）,并同时测定叶酸、维生素B 12,分析维生素D 2和D 3、维生素B 12、叶酸与同型半胱氨酸的关系。结果：根据血清总维生素D浓度水平分4组,第1组（25（OH）D＜10ng／mL）,第两组（10≤25（OH）D＜20ng／mL）,第3组（20≤25（OH）＜30ng／mL）,第4组（25（OH）D≥30ng／mL）。各组的同型半胱氨酸浓度存在显著差异,第1组同型半胱氨酸浓度最高,第4组最低,4组间的维生素B 12、叶酸亦存在显著差异。同型半胱氨酸与血清维生素D2、D3呈显著负相关,与维生素B12、叶酸亦显著负相关。结论：2型糖尿病人群中同型半胱氨酸浓度与血清维生素B 12、叶酸、维生素D2、维生素D3浓度存在一定的关系,糖尿病患者同型半胱氨酸的降低不仅需补充维生素B12、叶酸,维生素D的干预可起一定的作用。     

亚硒酸钠拮抗氯化高汞的致微核作用

本文应用微核试验方法对亚硒酸钠(Na_2SeO_3)拮抗氯化高汞(HgCl_2)致小白鼠骨髓嗜多染红细胞的微核作用进行了研究,其主要结果为:(1)Na_2SeO_3(lmg/kg)可显著地降低HgCl_2(lmg/kg)致微核作用(P<0.001);(2)Na_2SeO_3(lmg/kg)在HgCl_2染毒前2h内给予时,其微核率均较单纯HgCl_2对照组为低,但提前4h给予则未显示拮抗作用;(3)Na_2SeO_3在HgCl_2染毒后的30min内给予时具有一定的拮抗致微核作用;(4)给予小白鼠自由饮用含Na_2SeO_3(5mg/L)水一个月后也可明显地减少HgCl_2的致微核作用。     

白细胞介素2和3活化的骨髓细胞杀灭肿瘤细胞和造血的作用

肺癌患者的骨髓有核细胞用IL-2活化后对自身肺脓癌细胞具有很强的杀伤能力,与外周血相比,杀伤活性高、有效活性时间长,表明可用骨髓有核细胞制备高能长效杀瘤活性细胞,进行癌的过继性细胞免疫治疗。先用IL-2培养,48h后加入IL-3培养,既可保持IL-2诱导的杀瘤活性,又有与新鲜骨髓同样的造血能力,可用本文方法净化骨髓中的肿瘤细胞作自身骨髓移植。     

99m Tc-MAG3-ASON的制备及其在荷乳腺癌裸鼠中的分布

目的:探讨99mTc标记的反义寡核苷酸(ASON)的制备及其在荷乳腺癌裸鼠中的分布.方法:一步法合成巯基乙酰三甘氨酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS-MAG3),并与c-erbB2 mRNA互补的5'末端氨基修饰的15个碱基的ASON偶联;随后进行99mTc的标记,并用SephadexG25分离纯化99mTc-MAG3-ASON,并评价其稳定性;最后检测其在荷乳腺癌BALB/c裸鼠体内的分布.结果:99mTc-MAC3-ASON平均标记率为70.6%;纯化后,在室温下放置4h,其放化纯度为94.3%;与人血清孵育后,其放化纯度为93.8%;与血浆蛋白结合率为11.8%.乳腺癌组织的摄取率2h达峰值(6.09% ID/g).结论:以NHS-MAG3为螯合剂制备的99mTc-MAG3-ASON具有良好的稳定性,在乳腺癌部位高浓聚,可望用于肿瘤的显像诊断和治疗.     

动态三维超声造影在肝局灶性病变诊断中的应用

 目的 探讨动态三维超声造影（three-dimensional contrast-enhanced ultrasound,3D-CEUS）技术对肝局灶性病变（focal liver lesions,FLLs）动脉期增强表现的显示能力。方法 根据入选及排除标准,最终210例经病理确诊或临床随访证实的FLLs患者,共210个病灶纳入研究。对同一肝内病灶依次行常规二维超声造影（two-dimensional contrast-enhanced ultrasound,2D-CEUS）和动态3D-CEUS检查,观察两种造影模式下所得声像图,并对两种成像技术显示的动脉期病灶周围滋养血管、病灶增强模式和病灶内部血管形态进行比较。结果 动态3D-CEUS显示病灶增强模式与2D-CEUS无明显差异（P=0.887）。和2D-CEUS相比,动态3D-CEUS可观察到病灶周围更多的滋养血管,显示血管连续性更好、血管形态更清晰（P均<0.001）。动态3D-CEUS显示瘤内血管形态也优于常规2D-CEUS（P<0.001）。结论 动态3D-CEUS可用于观察FLLs的动脉期增强模式。与2D-CEUS相比,动态3D-CEUS能更好地显示FLLs的血管特征。     

1-羟基-2，3，5-三甲氧基[口山]酮对脂多糖致小鼠急性肺损伤的保护作用

目的探讨1-羟基-2,3,5-三甲氧基■酮(QGS)对脂多糖(LPS)致小鼠急性肺损伤的保护作用及其机制。方法采用ipLPS的方法建立小鼠急性肺损伤模型。检测肺脏指数,酶法检测支气管及肺泡灌洗液(BALF)中NO水平,Western blotting法检测核转录因子κB抑制蛋白IκB-α,诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)及环氧合酶Ⅱ(COX-2)等蛋白的表达,HE染色观察肺组织病理学改变。结果QGS500mg/kg组能显著降低LPS引起的小鼠的肺脏指数(P<0.05)。QGS250、500mg/kg组均能显著降低LPS致伤小鼠BALF中NO水平,抑制率分别达到了37%和48.1%。同时QGS500mg/kg组还能够明显增加肺组织中IκB-α蛋白表达量并下调iNOS及COX-2蛋白表达量。结论QGS对LPS引起的小鼠急性肺损伤有保护作用,该作用与其增加IκB-α蛋白表达而抑制iN-OS和COX-2蛋白的表达有关。     

Ficolin-3、TRF及hs-CRP联合检测在2型糖尿病早期诊断中的价值

目的 检测2型糖尿病(T2DM)患者,T2DM的期人群及健康人群血清中纤维凝胶蛋白-3 (Ficol-in-3)、转铁蛋白(TRF)、超敏C反应蛋白(hs-CRP)水平,来探讨血清中Ficolin-3、TRF及hs-CRP水平与T2DM的关系.方法 选择大连医科大学附属第一医院T2DM患者33例,T2DM前期组41(包括29例糖耐量减低者和12例空腹血糖受损者)及健康对照组30例,比较各组间Ficolin-3、TRF及hs-CRP的水平,分析3者与T2DM间的关系.结果 (1)血清Ficolin-3水平:在T2DM前期组(26.1±10.5) μg/mL及T2DM组(28.1±8.5)μg/mL均高于正常对照组(20.8±11.7 μg/mL,P＜0.05),T2DM前期组与T2DM组无显著性差异(P＞0.05);(2)血清TRF水平:T2DM前期组(261.3±51.1) mg/dL明显高于正常对照组(236.5±31.9 mg/dL,P＜0.05),T2DM组(242.0±57.7) mg/dL与正常对照组、T2DM组与T2DM前期组均无显著性差异(P＞0.05);(3)血清hs-CRP水平:T2DM组(3.12±3.47) mg/L明显高于正常对照组(1.19± 1.41) mg/L和T2DM前期组(1.70±1.97mg/L,P＜ 0.05),T2DM前期组与正常对照组无显著性差异(P＞0.05).结论 血清Ficolin-3、TRF和hs-CRP的水平可以有助于2型糖尿病的早期诊断,对T2DM的早期预防及病情发展有一定的预测价值.     

孕妇血清IGF-1、IGF-2、IGFBP-3水平与正常胎儿生长的相关性

 目的 探讨孕妇血清胰岛素样生长因子1(insulin like growth factor 1,IGF-1)、IGF-2、IGF结合蛋白3(IGF binding protein 3,IGFBP-3)与正常胎儿生长的关系。 方法 选择2010年1月至2011年5月于上海市浦东新区人民医院产前检查并分娩正常体重儿的初产妇66例,分为妊娠16～18周、妊娠26～28周、妊娠37～40周3个阶段进行纵向观察,放射免疫法测定孕妇各阶段血清中IGF-1、IGF-2、IGFBP-3水平并进行对比分析。 结果 孕期母血IGF-1水平随着孕周增加明显上升,其中IGF 1水平在妊娠37～40周高于妊娠26～28周,妊娠26～28周高于妊娠16～18周,差异均有显著统计学意义(P均＜0.01)。孕期母血IGF 2水平随孕周增加无明显改变,妊娠3阶段差异无统计学意义(P＞0.05)。母血IGFBP 3水平妊娠37～40周高于妊娠26～28周及妊娠16～18周期,差异有统计学意义(P＜0.05),而妊娠26～28周与妊娠16～18周无显著差异。妊娠16～18周、26～28周和37～40周3阶段母血IGF-1、IGF-2、IGFBP-3水平与正常新生儿出生体重无显著相关性。 结论 孕妇血清IGF-1、IGFBP-3水平与正常胎儿生长密切相关,IGF-1可作为临床评价不同阶段正常胎儿生长的指标,而IGFBP-3更多地反映了妊娠中晚期正常胎儿的生长。