基于TMT和PRM技术的湿性年龄相关性黄斑变性泪液蛋白质组学研究

目的 研究未经诊治湿性年龄相关性黄斑变性(age related macular degeneration,AMD)患者的泪液蛋白质组学,绘制蛋白质图谱,筛选差异表达蛋白以鉴定潜在的生物标志物.方法 以2017年7月至2018年3月于重庆医科大学附属第二医院眼科门诊就诊的33例未经诊治湿性AMD(nAMD)患者和同时期及地点的30例排除眼底疾病的正常老年人泪液为对象,采用串联质谱标签法(tandem mass tag,TMT)对鉴定两组样本的差异表达蛋白进行定量,对所鉴定的差异表达蛋白进行生物信息学分析,并筛选出有潜在研究前景的候选蛋白,并使用平行反应监测(parallel reaction monitoring,PRM)技术靶向验证候选蛋白在人群泪液nAMD中的表达情况.结果 通过TMT相对定量蛋白质组学从未经诊治的湿性AMD患者和正常老年人的泪液中共定量到3 473个蛋白质,其中包含差异表达蛋白382个(122种蛋白上调,260种蛋白下调,P＜0.05),通过GO功能富集分析和KEGG通路富集分析发现这些差异表达蛋白主要参与免疫反应和氧化应激的调节.选择MAOA、Transaldolase和LAMP-2作为潜在的生物标记物,并通过PRM成功验证到这3个候选蛋白的表达情况与TMT定量蛋白质组结果一致.结论 采用TMT相对定量结合PRM靶向验证技术能有效地筛选出湿性AMD与正常人泪液中的382个差异蛋白,并验证提供3种潜在的生物标记物.     

基于iTRAQ技术的肝细胞生长因子促进乳腺癌细胞侵袭的蛋白质组学研究

目的基于i TRAQ多重标记串联质谱技术系统性筛选乳腺癌患者血清蛋白表达的差异。方法提取血清蛋白,采用i TRAQ标记和ESJ-QTOF-QⅡ质谱检测,搜库和Scqffold软件分析得到各组间血清差异表达蛋白,采用蛋白质印迹法即免疫印迹法(Western Blot)对差异蛋白进行验证。结果 i TRAQ标记图谱显示乳腺癌组与健康对照组之间血清肝细胞生长因子(HGF)表达水平比较差异有统计学意义,Western Blot验证结果证实,乳腺癌患者血清中HGF表达水平同健康对照组比较,明显较高(P0.05)。结论通过i TRAQ技术系统性筛选乳腺癌患者血清蛋白表达的差异,发现乳腺癌细胞高表达HGF。     

乳腺癌化学治疗敏感与耐药组织相关蛋白表达差异

目的:研究乳腺癌化学治疗(化疗)敏感及耐药相关蛋白。方法:根据新辅助化疗效果筛选出化疗敏感与耐药组,应用蛋白质组学技术研究两组间的差异蛋白并采用蛋白质印迹方法对部分差异蛋白进行验证。结果:在化疗敏感组及耐药组乳腺癌组织蛋白质谱中找到13种差异蛋白质,其中3种在耐药组上调,10种下调。对其中7种蛋白质进行验证,角蛋白I型细胞骨架19(keratin type I cytoskeletal 19,KIC19)、胸苷磷酸化酶(thymidinephosphorylase,TYPH)在耐药组表达上调, 而热休克蛋白27(heat shock protein 27,HSP27)、角蛋白I型细胞骨架9(keratin type I cytoskeletal 9,KIC9)、胶原蛋白α-2(六)链[collagen alpha-2(VI),CO6A2]、波形蛋白(vimentin,VIME)、β肌动蛋白(actin cytoplasmic 1,ACTB)等表达下调,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:KIC19和TYPH可能与乳腺癌化疗耐药相关,而HSP27,KIC9,CO6A2,VIME以及ACTB可能与化疗敏感相关。     

应用二维电泳和质谱技术筛选乳腺癌相关差异表达蛋白质的初步研究

目的:通过分离并鉴定乳腺癌、癌旁和正常乳腺组织的差异表达蛋白质,以发现可能用于早期诊断的乳腺癌肿瘤标志物.方法:提取人乳腺癌、癌旁和正常乳腺组织的总蛋白质,用双向电泳分离蛋白并进行比较.选择在乳腺癌组织中明显差异表达的蛋白点,行质谱分析.结果:获得了分辨率和重复性均很好的凝胶蛋白图谱.对筛选出的在乳腺癌组织中明显差异表达的20个蛋白点,共有13个蛋白点被成功鉴定,其中在乳腺癌组织巾高表达的为8个,低表达的为5个.结论:乳腺癌组织相对于癌旁、正常乳腺组织蛋白存在明显的差异,过蛋白质组学方法筛选并鉴定出的这些蛋白质可能成为用于早期诊断和评价预后的乳腺癌标志物.     

HSP27在左侧结肠癌和右侧结肠癌差异表达的实验研究(英文)

目的:应用蛋白质组学技术筛选左侧结肠癌和右侧结肠癌组织中差异表达的蛋白,为左侧结肠癌(1eft sided colon cancer,LSCC)和右侧结肠癌(right sided colon cancer,RSCC)在肿瘤生物学方面的差异提供分子遗传学依据.方法:收集人LSCC和RSCC组织标本,置-80℃超低温冰箱中保存.应用双向凝胶电泳、质谱分析和生物信息学分离和鉴定ISCC和RSCC中差异表达的蛋白质.应用RT-PCR,Western印迹和免疫组织化学技术检测差异表达蛋白的表达状态.结果:筛选出55个差异蛋白质点,成功鉴定出21种差异蛋白质.与RSCC比较,14种蛋白在LSCC表达上调,7种蛋白在LSCC表达下调,其中LSCC中HSP27表达下调.通过RT-PCR,Western印迹和免疫组织化学方法证实:在mRNA和蛋白水平,LSCC中HSP27的表达均低于RSCC.结论:LSCC和RSCC的蛋白质组存在差异表达,特别是HSP27在mRNA和蛋白水平均存在差异,这些可能是LSCC和RSCC生物学行为差异的分子遗传学基础.     

结直肠癌患者与正常人血清蛋白质双向凝胶电泳差异分析

目的 利用血清蛋白质组学技术分析结直肠癌患者与正常人血清蛋白质表达谱的差异,寻找结直肠癌相关血清标志物.方法 分别采用pH3～10和pH4～7的IPG干胶条,在优化的实验条件基础之上,利用双向凝胶电泳(2-DE)分离结直肠癌患者和正常人血清蛋白质,硝酸银染色,获取图像后PDQuest软件分析差异表达的血清蛋白质点.结果 采用pH值3～10的胶条分离血清蛋白共有17个,结直肠癌组表达量上调的蛋白质点7个,表达量下调的蛋白质点7个.采用pH值4～7的胶条分离血清蛋白共有13个,结直肠癌组表达量上调的蛋白质点8个,表达量下调的蛋白质点5个.结论 所筛选的差异蛋白质点为进一步结直肠癌相关血清蛋白质的鉴定和其他肿瘤血清蛋白质学研究奠定了良好的基础.     

乙型肝炎病毒相关肝癌血清差异表达蛋白的筛选、鉴定及其诊断价值

目的:筛选、鉴定乙型肝炎病毒(HBV)相关肝癌的血清差异表达蛋白,探讨其可能的早期诊断价值.方法:采用蛋白芯片及表面增强激光解析电离飞行时间质谱(surface-enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,SELDI-TOF-MS)技术对正常人、HBV相关肝炎、肝硬化患者及原发性肝癌患者术前血清分别进行检测,筛选肝癌血清差异表达蛋白;通过离子交换柱分离纯化其中表达差异最明显的蛋白,并进行质谱鉴定.根据筛选结果,建立肝癌诊断决策树模型,评价其诊断肝癌的准确性和敏感度.结果:与正常组相比,肝癌组有44个差异蛋白质波峰(P＜0.05),其中21个上调,23个下调;与肝硬化组相比,肝癌组有51个差异蛋白质波峰(P＜0.05),其中47个上调,4个下调.质荷比为5 805的蛋白质表达在正常人群＜慢性肝炎组＜肝硬化组＜肝癌组,在肝癌组中表达最高,差异具有统计学意义(P＜0.01);对其酶解消化产物进行肽指纹谱(PMF)鉴定发现其中有2条肽段序列与硫酸软骨素合酶Ⅱ部分序列相匹配.根据筛选的差异表达蛋白成功建立肝癌诊断决策树模型,其判断肝癌的准确率为94.82%[(23 32)/58]、敏感性88.46%(23/26)、特异性100%(32/32).结论:成功筛选HBV相关肝癌血清差异表达蛋白,其中差异最显著蛋白(质荷比为5 805)酶解产物中有2条肽段与硫酸软骨素合酶Ⅱ部分序列相匹配;根据筛选结果建立的肝癌诊断决策树模型有助于早期诊断HBV相关肝癌.     

结直肠癌有无肝转移血清差异蛋白质表达的研究

目的:利用蛋白质组学技术分离、鉴定结直肠癌有无肝转移患者血清中差异蛋白质,筛选诊断肝转移的血清蛋白标志物。方法:根据入组条件,收集结直肠癌无肝转移病例、有肝转移病例,在两组中随机抽取12例血清样本,同组血清等量混合进行双向凝胶电泳,建立两组血清蛋白质双向电泳图谱,用Image-Master V5.0软件寻找两组差异蛋白质点,MALDI-TOF-MS对差异蛋白质进行鉴定,查询生物信息数据库对差异蛋白质进行初步分析。结果:两组比较差异在2倍以上蛋白质有8种,其中5个蛋白质表达上调,3个蛋白质表达下调;两组每个差异蛋白灰度体平均值比较差异均有统计学意义(P0.05)。通过数据库搜索鉴定出7种蛋白质,上调的5个蛋白质分别是Transferrin、Complement component C9、RNA directed DNA polymerase(RNA指导的DNA合成酶)、Conserved hypothetical-protein(假定蛋白质)、SEC14L1 7 kDa protein;下调的2个蛋白质分别是Haptoglobin和Isoform 1 of Serum albumin。结论:结直肠癌有无肝转移患者血清中的蛋白质表达谱有一定的差异性,这些差异蛋白质可能成为诊断肝转移的血清标志物。     

应用激光捕获显微切割和蛋白质组学技术筛选鼻咽癌的差异表达蛋白质

目的:筛选鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)的差异表达蛋白质,为寻找NPC的分子标志物提供科学依据. 方法:采用激光捕获显微切割技术(laser capture microdissection,LCM)分别从NPC组织和正常鼻咽上皮组织(normal nasopharyngeal epithelial tissue,NNET)中纯化NPC细胞和正常鼻咽上皮细胞(normal nasopharyngeal epithelial cells,NNEC),应用二维凝胶电泳(2-DE)分离LCM 纯化细胞的蛋白质,图像分析识别差异表达的蛋白质点,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)和电喷雾电离串联质谱(ESI-Q-TOF-MS)鉴定差异蛋白质点,Western 印迹和组织芯片(tissue microarray,TMA)免疫组织化学验证差异蛋白鳞状细胞癌抗原1(SCCA1)在两种组织中的表达水平.结果:建立了LCM 纯化的NPC细胞和NNEC的2-DE图谱,质谱鉴定了36个差异蛋白质,其中20个蛋白只在NPC表达或表达上调,16个蛋白在NPC中表达下调或缺失. Western 印迹和组织芯片免疫组织化学结果显示:SCCA1在NPC中的表达水平较NNET明显下调,与比较蛋白质组学结果一致.结论:36个差异蛋白可能与NPC的发病有关,为筛选NPC分子标志物奠定了基础.     

HSP27在左侧结肠癌和右侧结肠癌差异表达的实验研究

目的：应用蛋白质组学技术筛选左侧结肠癌和右侧结肠癌组织中差异表达的蛋白,为左侧结肠癌（1eft sided coloncan cer,LSCC）和右侧结肠癌（right sided colon cancer,RSCC）在肿瘤生物学方面的差异提供分子遗传学依据。方法：收集人LSCC和RSCC组织标本,置-80℃超低温冰箱中保存。应用双向凝胶电泳、质谱分析和生物信息学分离和鉴定LSCC和RSCC中差异表达的蛋白质。应用RT—PCR,Western印迹和免疫组织化学技术检测差异表达蛋白的表达状态。结果：筛选出55个差异蛋白质点,成功鉴定出21种差异蛋白质。与RSCC比较,14种蛋白在LSCC表达上调,7种蛋白在LSCC表达下调,其中LSCC中HsP27表达下调。通过RT—PCR,Western印迹和免疫组织化学方法证实：在mRNA和蛋白水平,LSCC中HSP27的表达均低于RSCC。结论：LSCC和RSCC的蛋白质组存在差异表达,特别是HSP27在mRNA和蛋白水平均存在差异,这些可能是LSCC和RSCC生物学行为差异的分子遗传学基础。     

Luminal亚型乳腺癌细胞与正常乳腺细胞的circRNA表达谱差异分析

目的探讨环状RNA（circRNA）在Luminal亚型乳腺癌细胞与正常乳腺细胞中表达谱的差异。方法分别提取Luminal亚 型细胞MCF7和正常乳腺细胞MCF10A的总RNA;使用NanoDrop ND-1000对total RNA质量进行检测,用核糖核酸酶R分解 total RNA以除去线性RNA并富集circRNA;利用随机引物法扩增富集的circRNA并转录成荧光cRNA;将荧光标记cRNA杂交 到circRNA微阵列芯片上,扫描得到两种细胞的circRNA表达谱;在Agilent Feature Extraction软件中进行原始数据提取,并对 采集到的阵列图像进行分位数归一化和后续数据处理,进行火山图和聚类热图分析;最后,选取差异表达倍数较高的3 条 circRNA进行实时荧光定量PCR（qPCR）鉴定。结果提取的MCF7和MCF10A细胞总RNA纯度高、完整度较好;扫描微阵列 芯片上标记的荧光信号,发现两种细胞的circRNA 表达谱明显不同;与MCF10A细胞相比,在MCF7 细胞的全部12 910 条 circRNA表达归一化结果中,有5964条上调,81条表达水平一致,6865条下调;表达差异（Log fold change）在2倍以上的有343 条,其中213 条上调,130 条下调;表达差异在5 倍以上的有9 条,其中8 条上调,分别为：hsa_circRNA_061260（6.02 倍）、 hsa_circRNA_103933（5.96倍）、hsa_circRNA_005239（5.84倍）、hsa_circRNA_100689（5.69倍）、hsa_circRNA_004087（5.60倍）、 hsa_circRNA_104420（5.25 倍）、hsa_circRNA_104421（5.13 倍）和hsa_circRNA_101222（5.03 倍）,1 条下调：hsa_circRNA_ 104864（5.09倍）;经qPCR鉴定hsa_circRNA_100689、hsa_circRNA_005239和hsa_circRNA_104864的差异表达趋势与芯片结 果相符。结论Luminal亚型乳腺癌细胞与正常乳腺细胞的circRNA表达差异较大,其中表达上调或下调的circRNA有望成为 Luminal亚型乳腺癌诊断的新靶标。     

应用差异凝胶电泳及质谱技术筛选肺癌患者血浆差异蛋白

目的 建立健康者、肺部炎症患者和肺癌患者的血浆蛋白表达谱,寻找与肺癌早期发生相关的差异蛋白.方法 应用差异凝胶电泳（DIGE）和基质辅助激光解吸飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）对健康者、肺部炎症患者和I期肺癌患者血浆进行蛋白质组学比较研究,寻找肺癌相关差异蛋白.结果 应用DIGE进行分离后,成功获得了蛋白质组分辨率高、重复性好的双向凝胶电泳图谱;Decyder 6.5软件分析获得差异大于2倍的蛋白质点共有72个;质谱鉴定去冗余后确定了12种蛋白质,其中7种与肿瘤相关,分别为酰基辅酶A合成酶家族成员3、抗血小板膜糖蛋白I b特异性抗体、γ-纤维蛋白原、4型血清淀粉样蛋白A、补体因子H、钙结合微丝蛋白、载脂蛋白I.结论 应用DIGE及MALDI-TOF-MS分离并初步鉴定了12种蛋白质,筛选出7种在肺癌患者血浆中高表达的肿瘤相关蛋白.     

应用液体蛋白芯片-飞行时间质谱系统研究乳腺癌血清差异蛋白表达

目的：分析乳腺癌与健康人血清蛋白质谱差异,筛选特异性蛋白标志物,建立乳腺癌诊断预测模型,评价其诊断价值。方法将58例乳腺癌和57例健康女性的血清,随机分为建模组和验证组,应用弱阳离子纳米磁珠（MB-WCX）结合基质辅助激光解吸离子飞行质谱（MALDI-TOF-MS）技术建立血清蛋白质谱,选择遗传算法建立乳腺癌诊断预测模型,利用诊断模型对验证组进行盲筛验证。结果通过蛋白质谱,筛选出29个显著差异蛋白质峰（P＜0．05）。其中乳腺癌中表达上调2个,表达下调27个,利用其中8个差异峰（质荷比分别为698．3、797.37、1449.56、1466．65、1520．74、1584．55、2379．26、2739．69）建立诊断模型,获得了96．55％（28/29）的敏感性和96.42％（27/28）的特异性,经独立样本双盲验证,得到灵敏度为93．10％（27/29）,特异度为96．55％（28/29）。结论应用弱阳离子纳米磁珠联合MALDI-TOF-MS技术可筛选出血清蛋白质谱中的差异蛋白质,据此建立的诊断模型具有较高的敏感性和特异性,对于乳腺癌的辅助诊断有一定的临床意义。     

宫颈癌癌组织中差异表达蛋白的蛋白组学研究

目的 通过蛋白组学技术探讨宫颈癌癌组织中的差异表达蛋白。方法 纳入于新乡市中心医院就诊的12例宫颈癌患者和12例宫颈活检结果正常者作为研究对象。将24例研究对象分为实验组和验证组，其中10例宫颈癌患者和10例宫颈活检正常者构成实验组，其余2例宫颈癌患者和2例宫颈活检正常者构成验证组。通过蛋白组学技术探讨宫颈癌患者(n=10例)癌组织与正常宫颈组织(n=10例)中的差异表达蛋白，并将差异表达蛋白进行GO富集和KEGG富集分析，通过蛋白互作(protein protein interaction, PPI)分析筛选出与宫颈癌发病机制相关的关键蛋白，选取5种相关度最为显著的蛋白在验证组中进行Western blot验证。结果 共有4 718个蛋白被定量分析，相对于正常宫颈组织，宫颈癌癌组织中显著上调的蛋白有190个，显著下调的蛋白有163个。对发生显著改变的353个蛋白进行GO富集分析和KEGG富集分析，结果显示，差异蛋白涉及的生物学过程主要为中性粒细胞活化、氧化应激、免疫应答及急性相反应等，差异蛋白主要涉及IL-17信号通路、人乳头瘤病毒感染相关通路、PI3K-AKT信号通路、氧化磷酸化、...     

TGFβ1/Smads信号通路相关蛋白在乳腺癌组织中的表达及其临床意义

目的：研究TGFβ1/Smads信号通路相关蛋白在乳腺癌组织中的表达,阐明其与乳腺癌临床病理学特征的关系。方法：采用免疫组化EnVision方法检测121例乳腺导管癌和21例正常乳腺导管上皮组织芯片中TGFβ1、TGFβRⅠ、 TGFβRⅡ、Smad2/3和Smad4蛋白的表达水平,分析其与乳腺癌临床病理学特征的关联性。结果：免疫组化染色,TGFβ1、TGFβRⅠ、Smad2/3和TGFβRⅡ在乳腺癌组织均呈高表达,Smad4在乳腺癌组织表达水平明显低于正常导管上皮中的表达水平(P<0.01）;≤55岁乳腺癌患者TGFβ1表达水平明显高于>55岁患者（P<0.05）;孕激素受体(PR)阴性乳腺癌患者TGFβ1表达水平明显高于PR阳性患者（P<0.05）,未发生淋巴结转移乳腺癌患者TGFβ1、TGFβRⅠ和TGFβ RⅡ的表达水平明显高于淋巴结转移患者（P<0.05或P<0.01）;不同临床分期乳腺癌患者TGFβRⅡ和Smad2/3表达水平具有明显差异,Ⅱa、Ⅱb和Ⅲa期乳腺癌患者TGFβRⅡ表达水平明显低于0期（P<0.01）,Ⅰ期和Ⅱb期乳腺癌患者Smad2/3表达明显低于在0期（P<0.01）。TGFβ1表达水平分别与TGFβRⅠ和TGFβRⅡ表达水平呈正相关关系（r=0.46,P<0.01;r=0.44,P<0.01）。结论：TGFβ1/Smads信号通路相关蛋白的高表达可以作为乳腺癌的辅助诊断指标,提示TGFβ1/Smads信号通路相关蛋白检测可作为判定乳腺癌预后的指标。     

乳腺癌组织及血清MICA表达特点

目的检测乳腺癌组织及血清中主要组织相容性复合体I类相关基因A（MICA）水平,研究其对于乳腺癌诊断的意义。方法RT—PCR检测32例乳腺癌及癌旁组织MICAmRNA表达水平,ELISA法检测56例乳腺癌血清、69例乳腺良性病血清及75例健康体检者血清中MICA浓度,分析其与临床病理参数的关系。结果乳腺癌组织MICA阳性表达率81．25％（26／32）显著高于癌旁组织9．38％（3／32）,乳腺癌组MICAmRNA相对表达量（1．36±0．18）显著高于乳腺癌旁（0．76±0．09）,差异均具有统计学意义（P〈0．05）;患者血清中MICA浓度显著高于乳腺良性疾病患者及健康体检者;与临床病理特征关系分析表明,I期＋Ⅱ期乳腺癌组织MICAmRNA表达显著高于Ⅲ期＋Ⅳ期,与血清中不一致（Ⅲ期＋Ⅳ期乳腺癌患者血清中MICA蛋白表达量显著高于I期＋Ⅱ期）;乳腺癌组织MICAmRNA水平与淋巴结转移与否无明显相关性,转移组血清MICA蛋白浓度显著高于未转移者,与年龄及分级无明显相关性。结论MICA可作为乳腺癌诊断的辅助指标,并与临床分期相关;早期肿瘤组织高表达MICA,从而诱导NK细胞杀灭肿瘤细胞,晚期肿瘤组织表面MICA脱落至血液中导致其高表达。     

乳腺癌中α-1,6岩藻糖基转移酶表达的相关性研究及其临床意义

目的探讨乳腺癌组织中α-1,6岩藻糖基转移酶mRNA和蛋白的表达水平及其临床意义。方法应用蛋白免疫印迹法、实时荧光定量PCR法检测40例乳腺癌患者术后的癌组织、癌旁组织以及40名健康者的正常乳腺组织中α-1,6岩藻糖基转移酶在的表达情况,并分析其与乳腺癌之间的关系。结果 FUT8 mRNA和蛋白在乳腺癌组织中的表达水平高于癌旁组织和正常乳腺组织,差异有统计学意义（P〈0.05）;Ⅲ期乳腺癌组织中FUT8蛋白表达水平明显高于Ⅰ-Ⅱ期,差异有统计学意义（P〈0.001）;有淋巴结转移的乳腺癌组织中FUT8蛋白表达水平明显高于无淋巴结转移组,差异有统计学意义（P〈0.001）。结论高FUT8蛋白的表达与乳腺癌密切相关,其可能的调控机制及生物学效应有待进一步研究。