白花蛇舌草乙醇提取物逆转肺癌细胞化疗耐药的作用研究

摘 要 目的 探讨白花蛇舌草乙醇提取物（EEHDW）在肺癌化疗耐药中的作用及可能的机制。方法 EEHDW作用于多西他赛耐药细胞系A549/DTX后，采用集落形成、Transwell和CCK-8检测处理前后细胞的增殖、侵袭和半数抑制量（IC50）情况，Western blot检测上皮间质转化相关蛋白E-钙黏蛋白（E-cadherin）和波形蛋白（vimentin）的表达，同时分析PI3K/Akt信号通路中磷酸化PI3K（p-PI3K）和磷酸化Akt（p-Akt）蛋白表达变化情况。结果 与亲本A549细胞相比，多西他赛耐药的A549/DTX发生了上皮间质转化（EMT）；与对照组相比，EEHDW（2、4、6mg/mL）能抑制A549/DTX细胞的集落形成[(102±9.23)、(69±4.25)、(68±3.12)比(201±8.18), P<0.05]和侵袭能力[(42±5.58)、(21±3.25)、(22±4.36)比(129±9.23), P<0.05]；Western blot结果显示EEHDW（2mg/mL）能够上调E-cadherin蛋白表达，下调vimentin蛋白表达[(31.35±5.27)比(76.05±7.81)、(82.24±6.80)比(35.04±5.32)，P<0.05]；EEHDW（2mg/mL）处理A549/DTX细胞48h后，细胞对多西他赛的半数抑制量IC50显著降低[(81.36±7.58)比(45.38±6.82) ，P<0.05]；此外，与对照组相比，EEHDW（2mg/mL）能够抑制磷酸化(p)-PI3K[(45.62±6.15)比(22.85±4.29) ，P<0.05]和p-Akt[(43.51±3.18)比(23.25±3.67) ，P<0.05]蛋白的表达水平。结论 EEHDW能够抑制A549/DTX细胞增殖、侵袭，逆转多西他赛诱导的EMT和化疗耐药，其机制可能与PI3K/Akt信号通路有关。     

苦杏仁苷调控PI3K/Akt/mTOR通路对子宫内膜癌细胞增殖、侵袭及凋亡的影响

目的研究苦杏仁苷对子宫内膜癌细胞RL95-2及HEC-1B增殖、侵袭及凋亡的影响。方法使用8、16、32、64和128mg/L浓度苦杏仁苷处理RL95-2、HEC-1B细胞24、48和72h后,采用CCK-8法检测各组细胞增殖能力并计算苦杏仁苷的半数抑制浓度(IC50);Transwell试验检测苦杏仁苷对细胞侵袭能力的影响;流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况;Western blot试验检测凋亡相关基因Bcl-2、Bax蛋白以及PI3K/Akt/m TOR信号通路相关蛋白表达情况。结果苦杏仁苷呈浓度及时间依赖性抑制子宫内膜癌RL95-2、HEC-1B细胞生长活性,48h时半数抑制浓度(IC50)约为40mg/L;苦杏仁苷能抑制RL95-2、HEC-1B细胞穿膜细胞数[(227.67±11.06)个比(459.33±24.75)个,(188.67±11.14)个比(412.33±14)个,P均0.01];经苦杏仁苷处理后RL95-2、HEC-1B细胞凋亡率升高[(7.85±0.71)%比(1.49±0.08)%、(8.55±0.69)%比(1.61±0.13)%,P均0.01],凋亡蛋白Bcl-2表达下降[(0.19±0.03)比(0.36±0.04)、(0.25±0.04)比(0.39±0.05),P均0.01],Bax表达升高[(0.37±0.06)比(0.18±0.04)、(0.41±0.06)比(0.21±0.03),P均0.01];苦杏仁苷能显著下调RL95-2、HEC-1B细胞的PI3K[(0.42±0.04)比(0.78±0.05)、(0.36±0.05)比(0.63±0.03),P均0.01]、Akt[(0.73±0.05)比(0.92±0.05)、(0.65±0.03)比(0.86±0.04),P均0.01]及m TOR[(0.25±0.04)比(0.93±0.06)、(0.34±0.05)比(0.88±0.04),P均0.01]磷酸化水平,抑制PI3K/Akt/m TOR通路活化。结论苦杏仁苷通过抑制PI3K/Akt/m TOR信号通路活化,促进子宫内膜癌RL95-2、HEC-1B细胞凋亡,降低其增殖活性,抑制细胞侵袭功能,从而发挥抗肿瘤作用。     

川芎嗪对肺癌顺铂耐药细胞A549/DDP凋亡的影响

目的观察不同浓度川芎嗪(TMP)对肺癌顺铂耐药细胞株A549/DDP细胞的凋亡作用及其分子机制。方法应用不同浓度TMP(0.10、0.20、0.40、0.80、1.00mg·mL-1)处理A549/DDP细胞;噻唑蓝(MTT)比色法检测TMP对肺癌耐药细胞A549/DDP增殖抑制的影响,绘制细胞增殖抑制率曲线图;应用细胞流式技术检测A549/DDP的凋亡率;电子显微镜下观察A549/DDP细胞形态学特征的改变;提取A549/DDP细胞蛋白,并通过免疫印迹法检测应激活化蛋白激酶(JNK)、p38蛋白激酶、细胞外信号调节激酶(ERK)的蛋白表达变化。结果川芎嗪对A549/DDP细胞的增殖抑制率随着川芎嗪浓度的增加和作用时间的延长而逐渐增加,有时间和剂量依赖性(P0.05)。TMP(0.20、0.40、0.80mg·mL-1)处理耐药细胞A549/DDP 72h后,细胞早期凋亡(AV+/PI-)比例分别为13.02%、26.58%、29.84%;电子显微镜下观察到TMP应用后肺癌耐药细胞A549/DDP出现凋亡特征性的凋亡小体;细胞蛋白免疫印迹实验表明,与对照组比较,TMP(0.20、0.40mg·mL-1)处理后A549/DDP细胞磷酸化(p)-p38[(72.03±5.27)、(86.63±5.09)比(47.24±3.64),P0.05]和p-JNK的表达量[(143.79±3.88)、(163.02±6.35)比(130.18±5.37),P0.05]增加而p-ERK表现出减少趋势[(62.33±5.61)、(24.00±4.89)比(108.52±6.24),P0.05]。结论 TMP可能通过丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路诱导肺癌耐顺铂细胞株A549/DDP凋亡。     

CD133~+A549肺癌细胞的分选及其肿瘤干细胞和间质化相关基因的表达

目的 分离CD133+A549细胞并对其肿瘤干细胞和上皮间质转变(EMT)特性进行初步研究.方法 采用免疫磁珠法分离并鉴定A549细胞,Real-Time PCR法和Western blotting法鉴定分离的细胞.Real-Time PCR法测定CD133+ A549和CD133-A549细胞中肿瘤干细胞标志物(CXCR4、Oct4、CD44、Bmi1、EpCam)和EMT标志物(E-Cadherin和Zeb1)mRNA的表达.分选后的CD133+A549和CD133-A549细胞经不同浓度(0、0.25、0.5、1.0μg/mL)阿霉素处理72 h,采用细胞增殖实验检测细胞的相对存活率.结果 经CD133微小磁珠分离后、成功获得CD133+ A549和CD133-A549细胞,CD133+ A549细胞的CD133表达明显高于CD133-A549细胞.Real-Time PCR检测结果显示,CD133+ A549细胞中Oct4、CD44、Bmi1、EpCam mRNA的相对表达量均显著高于CD133 - A549细胞[(1±0.16)vs(0.66±0.12)、(1±0.07)vs(0.48±0.04)、(1±0.03)vs(0.49±0.06)以及(1±0.14)vs(0.38 ±0.12)(P＜0.05)],但CXCR4 mRNA的相对表达量比较差异无统计学意义[(1±0.13)vs(0.73±0.14),P＞0.05]; CD133+A549细胞中Zeb1 mRNA的相对表达量显著高于CD133- A549细胞[(1 ±0.09)vs(0.39±0.05),P＜0.05],但E-Cadherin mRNA的相对表达量显著低于CD133-A549细胞[(1±0.02)vs(4.98±0.04),P＜0.05].细胞增殖实验结果显示,采用0.5和1.0μg/mL阿霉素处理后,CD133+ A549细胞的相对存活率均显著高于CD133-A549细胞,差异有统计学意义[(85±9.4)％vs(67±13.1)％,P＜0.05;(80±14.9)％vs(56±6.3)％,P＜0.01].结论 采用免疫磁珠分离法可成功分离CD133+A549和CD133-A549细胞;CD133+ A549细胞中有其他肿瘤干细胞标志物的表达,并表现出EMT特性.CD133可能是肺癌肿瘤于细胞和EMT特征的标志物.     

基于PI3K/Akt/mTOR信号通路研究南葶苈子水提液对心力衰竭模型大鼠心室重构的影响

目的观察南葶苈子水提液对压力后负荷性心衰模型大鼠心室重构的影响,探讨PI3K/Akt/mTOR信号通路在其中的作用。方法雄性SD大鼠15只,按随机数字表法分为正常组、模型组和南葶苈子组,每组5只。SD大鼠心力衰竭动物模型建立后,正常组及模型组大鼠给予5mL·kg~(-1)·d~(-1)生理盐水灌胃,葶苈子组大鼠给予南葶苈子水提液10g·kg~(-1)·d~(-1)灌胃,共4周。4周后处死大鼠,测定各组大鼠心室肥厚指数;HE染色法和电镜观察心室组织病理变化;Western blot检测各组大鼠左心室心肌组织Bax、Bcl-2、Cleaved-caspase 3、p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR蛋白表达水平。结果南葶苈子组大鼠心室肥厚指数较模型组降低[(0.0033±0.0002)比(0.0037±0.0001),P0.05];HE染色和电镜显示,南葶苈子组心肌纤维排列不规则和心肌细胞肥厚程度较模型组减轻;Western blot证实,南葶苈子组大鼠Bcl-2/Bax蛋白表达灰度值较模型组上调[(0.75±0.20)比(0.54±0.18),P0.05];Caspase-3/GAPDH蛋白表达灰度值较模型组下调[(1.31±0.22)比(1.62±0.26),P0.05];p-Akt/Akt和p-mTOR/mTOR蛋白表达灰度值较模型组上调[p-Akt/Akt:(1.50±0.18)比(1.18±0.21),P0.05;p-mTOR/mTOR:(1.36±0.32)比(1.16±0.12),P0.05]。结论南葶苈子水提液能改善压力后负荷性心衰模型大鼠心室重构,其作用机制可能与激活PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制心肌细胞凋亡有关。     

AS-miR-21对非小细胞肺癌A549细胞增殖、迁移及对PTEN/PI3K/Akt信号通路的作用

目的 探讨miR-21的反义寡核苷酸(AS-miR-21)对非小细胞肺癌(NSCLC) A549细胞增殖和迁移能力的影响及对PTEN/PI3K/Akt信号通路的调控作用机制.方法 将NSCLC A549细胞分为3组,分别为AS-miR-21组、miR-NC组和Blank组,前两组分别应用阳离子脂质体LipofectamineTM 2000瞬时转染AS-miR-21及阴性对照miRNA(miR-NC),后者未进行任何干预.应用qRT-PCR检测AS-miR-21对NSCLCA549细胞中miR-21表达的影响;应用MTT检测NSCLC A549细胞增殖抑制率;Giemsa染色检测NSCLCA549细胞克隆形成;细胞划痕实验检测NSCLCA549细胞迁移潜能;qRT-PCR检测AS-miR-21对NSCLC A549细胞中PTEN mRNA表达水平的影响;蛋白质免疫印迹法检测AS-miR-21对NSCLC A549细胞中PTEN、PI3K、Akt蛋白表达水平的影响.结果 与miR-NC组和Blank组比较,AS-miR-21组miR-21表达水平下调(P ＜0.05);AS-miR-21显著抑制NSCLCA549细胞增殖能力(P＜0.05),显著减少NSCLCA549细胞克隆形成(P＜0.01)和迁移率(P＜0.01);AS-miR-21显著上调NSCLC A549细胞中PTEN蛋白表达水平(P＜0.01),而显著下调PI3K和Akt蛋白表达水平(P＜0.01).结论 AS-miR-21能抑制NSCLCA549细胞增殖及迁移,此外,AS-miR-21通过负调控PTEN/PI3K/Akt信号通路有可能成为NSCLC治疗新靶点.     

雷公藤红素逆转乳腺癌细胞对多柔比星的耐药性及机制研究

目的探讨雷公藤红素逆转乳腺癌细胞对多柔比星的耐药性及作用机制。方法将多柔比星耐药MDA-MB-231细胞(MDA-MB-231/R细胞)分为对照组、雷公藤红素组、多柔比星组、雷公藤红素+多柔比星组和雷公藤红素+多柔比星+Bim si RNA组,MTT法检测MDA-MB-231/R细胞活力,流式细胞术检测各组MDA-MB-231/R细胞的凋亡,免疫共沉淀法检测MDA-MB-231/R细胞Bim蛋白与Bak及Bax蛋白的相互作用,Western blot检测MDA-MB-231/R细胞色素C释放和Caspase-3活化。结果 MDA-MB-231/R细胞对多柔比星的半数有效浓度(IC50)显著高于常规MDAMB-231细胞[(18.4±1.1)g/mL比(1.5±0.1)g/mL,P0.05];雷公藤红素处理后,多柔比星对MDA-MB-231/R细胞活力抑制率和凋亡诱导率均显著提高,与对照组和多柔比星组比较,差异有统计学意义[(57.3±4.1)%比0、(13.0±1.0)%,(36.5±2.3)%比(1.6±0.2)%、(8.8±0.6)%,P均0.05];雷公藤红素处理能显著上调MDA-MB-231/R细胞Bim蛋白表达水平[(0.51±0.04)比(0.11±0.01)、(0.13±0.01),P均0.05];用Bim siRNA阻断Bim蛋白上调后,雷公藤红素对多柔比星的协同抗肿瘤效应受到明显抑制[(20.5±2.1)%比(57.3±4.1)%,(12.4±1.1)%比(36.5±2.3)%,P0.05];雷公藤红素处理后,与MDA-MB-231/R细胞Bim蛋白结合的Bak、Bax蛋白表达水平显著提高[(0.29±0.02)比(0.04±0.01)、(0.05±0.01),(0.35±0.02)比(0.05±0.01)、(0.04±0.01),P均0.05)];雷公藤红素处理后,多柔比星对MDA-MB-231/R细胞色素C的释放率和Caspase-3的活化率显著提高[(0.57±0.05)比(0.11±0.02)、(0.06±0.01),P均0.05;(0.43±0.04)比(0.09±0.02)、(0.03±0.01),P均0.05]。结论雷公藤红素可通过上调Bim蛋白表达,提高多柔比星耐药乳腺癌细胞对多柔比星的敏感性。     

Pirh2 shRNA增强肺腺癌细胞A549对顺铂敏感性的研究

目的 观察短发夹状RNA沉默泛素连接酶pirh2(P53 induced RING-H2 protein)基因表达后,肺腺癌细胞A549对顺铂敏感性及肺耐药蛋白(lung resistance-related protein, LRP)表达的变化.方法 构建靶向pirh2基因的短发夹状RNA(psiRNA-Pirh2)及阴性对照RNA(psiRNA-Con),并转染A549细胞,实时定量PCR和免疫印迹法检测A549细胞中pirh2基因和蛋白的表达变化.设立顺铂组(5 μg/ml)、psiRNA-Pirh2转染组和顺铂(5 μg/ml) psiRNA-Pirh2组,CCK-8法检测A549细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞周期,免疫印迹法检测肺耐药蛋白的表达,以正常A549细胞为对照.结果 psiRNA-Pirh2特异性抑制了A549细胞pirh2 mRNA和蛋白质的表达(均P＜0.05).顺铂及psiRNA-Pirh2组A549细胞增殖能力分别为正常对照组的(46.82± 6.14)%和(37.45±6.83)%,均P＜0.05,但均高于二者联合组[(28.24±6.49)%],且联合组细胞凋亡率最高,达(19.8±5.1)%,S期细胞最少,为(15.5±1.6)%(P＜0.05).顺铂处理组A549细胞LRP表达较正常对照组增强(P＜0.05),但联用psiRNA-Pirh2后,LRP蛋白水平有所下降(P＜0.05).结论 靶向pirh2的shRNA可特异性降低A549细胞中pirh2的表达,抑制A549细胞增殖,使其阻滞在G2/M期,诱导凋亡,下调肺耐药蛋白的表达并增强其对顺铂的化疗敏感性.     

川楝素对顺铂抗肺癌活性的影响及其机制研究

目的观察川楝素对顺铂抗肺癌活性的协同效应并研究其机制。方法人肺癌细胞系A549分为对照组、川楝素组、顺铂组、川楝素+顺铂组及川楝素+顺铂+X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)质粒组。MTT实验检测各组A549细胞活力抑制率;流式细胞实验检测各组A549细胞凋亡;免疫共沉淀及Western blot实验检测各组A549细胞XIAP表达水平及其与半胱天冬酶-9(Caspase-9)和半胱天冬酶-3(Caspase-3)的相互作用;Western blot实验检测各组A549细胞Caspase-9和Caspase-3的活化。结果川楝素+顺铂组A549细胞活力抑制率[(66.8±5.9)%]显著高于顺铂单治疗组[(15.2±1.2)%,P0.05]和川楝素+顺铂+XIAP质粒组[(20.4±1.8)%,P0.05];川楝素+顺铂组A549细胞凋亡率[(34.5±2.6)%]显著高于顺铂单治疗组[(9.7±0.8)%,P0.05]和川楝素+顺铂+XIAP质粒组[(13.3±1.2)%,P0.05];免疫共沉淀及Western blot实验显示川楝素能显著抑制A549细胞XIAP的表达及其与Caspase-9和Caspase-3的相互作用,川楝素促进顺铂对Caspase-9和Caspase-3的活化。结论川楝素通过下调XIAP表达增强顺铂抗肺癌活性。     

Torin2对人非小细胞肺癌A549细胞生长和迁移的影响

目的 观察Torin2对人非小细胞肺癌A549细胞生长和迁移的影响,初步探讨其作用机制.方法 实验分为空白对照组、阴性对照组和Torin2加药组,CCK-8检测Torin2对各组A549细胞的增殖抑制率;流式细胞仪检测细胞的凋亡及周期;Transwell检测细胞的迁移;Western blot检测相关蛋白的表达.结果 Torin2对A549细胞的增殖具有显著抑制作用,且呈明显的剂量依赖性,IC50为214.96 nmol/L;流式细胞仪检测对照组、加药组200 nmol/L和400 nmol/L细胞凋亡率分别为(4.51±1.32)％、(9.56±2.34)％、(16.40 ±3.57)％;各加药组凋亡率明显高于对照组(P＜0.05),且加药组与对照组比较:G1期细胞比例显著增多(P＜0.05),S期显著减少(P＜0.05).Transwell实验结果显示加药组(200 nmol/L和400 nmol/L)的A549细胞迁移能力较对照组显著下降.Western blot结果显示A549细胞经Torin2加药处理后,p-Akt473、p-4EBP1、Cyclin D1蛋白表达明显降低,Caspase 9蛋白酶切片段表达显著增加.结论 Torin2可以抑制A549细胞增殖,引起细胞周期G1/S期阻滞,抑制细胞迁移,促进细胞凋亡,其机制可能与Torin2抑制了PI3K/Akt/mTOR信号通路以及周期相关蛋白Cyclin D1的表达有关.     

蛇床子素通过c-met/PI3K/AKT途径提高顺铂对肺癌细胞的杀伤活性

目的探讨蛇床子素是否能提高顺铂对肺癌细胞的杀伤活性并研究其机制。方法 A549非小细胞肺癌细胞按对照组、蛇床子素组、顺铂组、蛇床子素+顺铂组及蛇床子素+顺铂+c-met质粒组进行分组后,MTT法检测A549细胞活力,Western blot实验检测A549细胞蛋白酪氨酸激酶(cmet)表达水平,磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKT)磷酸化水平及半胱天冬酶(caspases)活化水平的影响,流式细胞术检测A549细胞的凋亡。结果顺铂+蛇床子素组A549的细胞活力抑制率[(59.8±3.5)%]显著高于顺铂单治疗组[(16.9±1.2)%,P0.05]和蛇床子素+顺铂+c-met质粒组[(21.6±1.5)%,P0.05]。蛇床子素处理可诱导A549细胞c-met蛋白的下调并抑制A549细胞PI3K和AKT的磷酸化。顺铂+蛇床子素组对A549细胞的凋亡诱导率[(29.7±2.1)%]显著高于顺铂组[(7.8±0.9)%,P0.05]和蛇床子素+顺铂+c-met质粒组[(10.1±1.5)%,P0.05]。顺铂+蛇床子素组A549细胞的Caspase-9、Caspase-3活化水平显著高于顺铂组和蛇床子素+顺铂+c-met质粒组。结论蛇床子素通过下调c-met表达提高肺癌细胞对顺铂的敏感性。     

肝癌干细胞样细胞的分离及其耐药性受PI3K/Akt通路调节

目的 分离肝癌干细胞样细胞,初步探讨PI3 K/Akt通路调节其对化疗药物阿霉素的敏感性.方法 将人肝癌细胞株PLC、HepG2、Hep3B置于无血清条件培养基中培养,形成细胞球,选用PLC细胞株进行后续实验.采用流式细胞仪、克隆形成实验、SCID小鼠体内成瘤实验鉴定PLC细胞球(肝癌干细胞样细胞)的肿瘤干细胞特性.MTT法、流式细胞仪测定PLC细胞球对化疗药物阿霉素的敏感性.流式细胞仪分析加入PI3 K/Akt通路特异性抑制剂LY294002、阿霉素共同孵育细胞球后,其凋亡率的变化.Western blot法比较PLC细胞球、PLC贴壁细胞中p-Akt1(Ser473)蛋白分子表达量及加入抑制剂LY294002作用于细胞球后,p-Akt1(Ser473)、Akt1蛋白分子表达量的变化.结果 肝癌干细胞标志物CD90在细胞球中的表达较贴壁细胞显著升高(P＜0.01).细胞球的克隆形成数目(123.00±28.48)为贴壁细胞(56.33±7.37)的2.18倍(P＜0.05).同样细胞数接种于SCID小鼠皮下7周后,细胞球的致瘤率明显大于贴壁细胞.以5μg/mL的阿霉素分别处理细胞球和贴壁细胞48 h后,细胞球的增殖率明显高于贴壁细胞[(71.83±12.30)％ vs (45.68±5.95)％,P ＜0.05],凋亡率显著低于贴壁细胞[(11.73 ±3.77)％ vs (41.22±6.73)％,P＜0.01],而以阿霉素5μg/mL和LY294002共同孵育细胞球后,其凋亡率[(35.44±6.65)％]显著增加(P＜0.01).Western blot检测到细胞球的p-Akt1(Ser473)蛋白分子表达量显著高于贴壁细胞(P＜0.01),加入抑制剂LY294002处理细胞球后,p-Akt1(Ser473)蛋白表达量明显降低(P＜0.05),Akt1的表达量无明显变化(P＞0.05).结论 肝癌干细胞样细胞对化疗药物阿霉素具有耐药性,其耐药机制与Akt信号通路第473位点磷酸化Akt1分子有关.     

姜黄素对肺腺癌A549细胞P13K/Akt/Bcl-2信号通路的作用

目的：研究姜黄素对肺腺癌A549细胞增殖率、凋亡和P13K/Akt/Bcl-2信号通路的影响。方法：采用细胞计数法绘制肺腺癌A549细胞生长曲线,MTF法测定姜黄素对肺腺癌A549细胞抑制率。将不同浓度姜黄素作用于肺腺癌A549细胞24h后,显微镜下观察细胞形态;TUNEL法检测细胞凋亡率;免疫组化法检测P13K/Akt/Bcl-2蛋白表达。结果：姜黄素能够抑制肺腺癌A549细胞增殖,且呈一定剂量和时间依赖性;随着药物浓度上升细胞凋亡率明显增高（P〈0．05）;P13K、Akt和Bcl-2蛋白表达明显下降（P〈0．05）。结论：姜黄素对肺腺癌A549细胞增殖具有抑制作用,其作用可能是诱导细胞凋亡及抑制P13K/Akt/Bcl-2信号通路来实现的。     

EGFR和HER-3在人肺腺癌细胞及培美曲塞二钠耐药细胞中的表达差异

目的 探讨EGFR和HER-3基因在人肺腺癌细胞株A549和培美曲塞二钠(PEM)诱导的耐药细胞株A549/PEM中的表达变化.方法 用大剂量PEM诱导、建立耐药细胞株A549/PEM,CCK-8法检测A549和A549/PEM细胞的增殖抑制率,流式细胞术检测细胞的周期分布,RT-PCR检测EGFR与HER-3 mRNA在A549和A549/PEM细胞中的表达量.结果 CCK-8法测得PEM对A549细胞的半数抑制浓度(IC50)为3.43×10-6mol/L,用PEM反复处理细胞4个月,成功诱导出耐药指数(RI)为5.15倍的耐药细胞株A549/PEM.流式细胞术检测结果显示,A549和A549/PEM细胞处于G1/G0期的比例分别为(56.25±0.10)％和(65.12±0.40)％(P＜0.05),处于S期的细胞比例分别为(40.87±0.30)％和(31.74±0.40)％(P＜0.05).EGFR mRNA在A549和A549/PEM细胞中的相对表达量分别为0.55±0.08和0.64±0.07,HER-3 mRNA在A549和A549/PEM细胞中的相对表达量分别为1.29±0.03和1.56±0.12,其差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 与A549细胞相比,A549/PEM中EGFR和HER-3的表达量均增高,提示这两种基因表达量的变化可能与PEM耐药相关.     

基于miR-15a-5p/P53信号通路探讨EMT与肺癌细胞阿霉素耐药的关系

目的 探讨miR-15a-5p在肺癌细胞对阿霉素(DOX)耐药中的作用,并阐明其与DOX耐药之间的功能和机制联系。方法 分别采用si-miR-15a-5p、miR-15a-5p模拟物转染A549、A549/DOX抗性细胞(A549/D)。采用MTT法测定细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blots检测上皮间充质转化(EMT)相关蛋白及P53蛋白表达,qRT-PCR检测miR-15a-5p表达。通过生物信息学预测与双荧光素酶报告子分析miR-15a-5p潜在靶基因。采用A549/D细胞构建裸鼠移植瘤模型,分析miR-15a-5p过表达促进DOX的体内抗肿瘤作用。结果 MTT分析结果显示,miR-15a-5p的敲低提高了A549细胞的细胞活力(IC50值:8.86±0.32μmol/L),miR-15a-5p的过表达降低了A549/D细胞的细胞活力(IC50值:1.92±0.11μmol/L)。并且在A549细胞中阻断miR-15a-5p减少凋亡(P <0.001),在A549/D细胞中增加miR-15a-5p表达促进凋亡(P <0.001)。Western b...     

P13K抑制剂对肺癌Akt2、p-Akt表达影响的试验研究

目的探讨P13K抑制剂LY294002对肺癌Akt2、p-Akt表达的影响。方法体外实验是取对数生长期的A549细胞制备细胞爬片,体内实验先用裸鼠建立移植瘤模型,通过P13K抑制剂LY294002干预后,分别用免疫组织化学法和W estern b lot法检测Akt2、p-Akt蛋白的表达。结果肺腺癌细胞株A549细胞中存在Akt2和p-Akt蛋白的高表达,应用P13K抑制剂LY294002可抑制该细胞株细胞中Akt2和p-Akt蛋白的表达,而且其表达呈浓度依赖型降低。LY294002组移植瘤组织Akt2和p-Akt蛋白的表达用免疫组织化学法检测较对照组染色变淡,用W estern b lot法检测显示其蛋白表达量低于对照组。结论LY294002可通过抑制P13K活性,抑制Akt的表达及活化,使Akt2和p-Akt蛋白的表达降低,提示抑制P13K/Akt途径可能是LY294002发挥抗癌作用的重要机制,P13K/Akt可能成为肺癌治疗的靶点。     

长链非编码RNA PAPPA-AS1在人肺腺癌细胞铂类耐药中的作用

目的: 研究长链非编码RNA（long noncoding RNA,lncRNA）PAPPA-AS1在人肺腺癌细胞铂类耐药中的作用,并初步探讨其可能的调控机制。方法: 采用RNA测序（RNA-seq）技术检测人肺腺癌细胞A549及其铂类耐药细胞中lncRNA和mRNA的差异表达谱;qRT-PCR检测lncRNA PAPPA-AS1在A549/DDP和A549/NDP细胞中的表达水平;利用siRNA技术下调铂类耐药人肺癌细胞中PAPPA-AS1的表达,CCK-8实验检测肺腺癌细胞对铂类药物的敏感性;克隆形成实验检测细胞的增殖能力;流式细胞术检测细胞凋亡分布;蛋白质印迹法检测Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9、p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白在A549/DDP和A549/NDP细胞中的表达水平。 结果： 与亲代敏感细胞A549相比,lncRNA PAPPA-AS1在A549/DDP和A549/NDP细胞中呈高表达;与对照组比较,si-PAPPA-AS1组的肺腺癌细胞对铂类药物的敏感性增强,细胞增殖活力下降,细胞凋亡率增加（P均<0.05）;与对照组比较,si-PAPPA-AS1组的细胞中Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9蛋白表达明显升高,磷酸化PI3K、Akt和mTOR蛋白表达明显降低。结论： 下调PAPPA-AS1可以通过抑制PI3K/Akt信号通路逆转肺腺癌细胞对铂类药物的抵抗性。     

miR-194对非小细胞肺癌A549/DDP细胞顺铂耐药性的影响

目的:探讨microRNA-194(miR-194)对非小细胞肺癌A549/DDP细胞顺铂耐药性的影响及其可能的作用机制?方法:采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测非小细胞肺癌耐药细胞A549/DDP及其亲本细胞株A549中miR-194的表达差异,并在A549/DDP细胞中转染miR-194-inhibitor后检测miR-194的表达变化;应用MTT法?克隆形成实验?流式细胞术检测转染后A549/DDP细胞对DDP的敏感性?细胞增殖能力及凋亡变化;Western blot检测转染后A549/DDP细胞中Bax和Bcl-2的表达变化?结果:miR-194在耐药细胞A549/DDP中的表达量显著高于其亲本细胞株A549(P < 0.05),A549/DDP在转染miR-194-inhibitor 24 h后miR-194的表达水平较对照组显著下降(P < 0.05)?抑制miR-194表达后,相对于对照组,DDP对转染miR-194-inhibitor的A549/DDP细胞的半数抑制浓度(half inhibition concentration,IC50)减低(P < 0.05),转染miR-194-inhibitor的A549/DDP细胞增殖能力减弱,经DDP处理后凋亡细胞增多(P < 0.05)?Western blot结果显示,与对照组相比,转染miR-194-inhibitor的A549/DDP细胞Bax表达水平升高,Bcl-2表达水平降低?结论:miR-194可能通过抑制细胞凋亡,上调Bcl-2蛋白及下调Bax蛋白表达而增加A549/DDP细胞对DDP的耐药性,抑制miR-194的表达可逆转A549/DDP细胞的耐药性?     

长链非编码RNA牛磺酸上调基因1调节脓毒症患者炎症反应的分子机制研究

目的探讨长链非编码RNA(lncRNA)牛磺酸上调基因1(TUG1)对脓毒症炎症反应的调节作用及分子机制。方法选取2018年1月—2018年12月浙江省温州市人民医院收治的脓毒症患者(脓毒症组)30例,及同期健康志愿者(健康对照组)30名,实时定量PCR检测血清lncRNA TUG1和高迁移率族蛋白B1(HMGB1)表达水平,酶联免疫吸附反应(ELISA)检测炎症因子γ干扰素(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)和白介素-10(IL-10)浓度。过表达TUG1慢病毒感染细菌脂多糖(LPS)处理的单核巨噬细胞THP-1,噻唑蓝(MTT)检测细胞活力改变,免疫蛋白印迹(Western blot)检测细胞中HMGB1蛋白表达变化,ELISA检测巨噬细胞炎性因子浓度改变。结果与健康对照组比较,脓毒症组患者外周血lncRNA TUG1水平显著降低[(0.49±0.02)比(1.01±0.02),P0.01],HMGB1水平升高[(1.62±0.03)比(0.98±0.02),P0.01],两者呈负相关;促炎因子浓度显著升高[IFN-γ(33.91±5.81)pg/mL比(26.26±4.22)pg/mL、TNF-α(18.51±2.29)pg/mL比(13.89±2.12)pg/mL、IL-6(37.42±5.22)pg/mL比(19.12±3.34)pg/mL,P均0.05],抗炎因子水平明显下降[IL-10(8.71±1.59)pg/mL比(17.63±2.73)pg/mL,P0.05];LPS处理的THP-1细胞过表达TUG1,细胞活力显著增强[(84.17±4.32)%比(49.18±3.28)%,P0.01];lncRNA TUG1靶向抑制HMGB1表达,促炎因子水平降低[IL-6(211.38±7.87)pg/mL比(602.21±10.08)pg/mL、TNF-α(206.75±8.39)pg/mL比(483.13±13.48)pg/mL,P0.01]。结论 lncRNA TUG1抑制LPS诱导的巨噬细胞促炎因子分泌及HMGB1表达,调控脓毒症炎症反应。     

多西他赛对乳腺癌细胞中Cav-1表达及细胞增殖的影响

目的 研究多西他赛对乳腺癌细胞中Cav-1(Cav-1)表达及细胞增殖的影响.方法 通过Real-time PCR和Western-blot检测不同浓度多西他赛作用下乳腺癌细胞MCF-7中Cav-1的表达情况;野生型MCF-7细胞株为对照组,通过基因转染技术建立Cav-1 过表达的MCF-7细胞株(转染组)及空载体的MCF-7细胞株(空载体组),利用CCK-8比色法分析多西他赛对各组细胞增殖的影响.通过Western-blot分别检测多西他赛作用下各组细胞中凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的表达情况以及PI3K/AKT 信号转导通路的活化情况.结果 在5~40 μg/mL浓度范围内,随着多西他赛作用浓度的增大,MCF-7细胞中Cav-1的蛋白表达量逐渐增加.不同浓度多西他赛对MCF-7细胞的增殖均有明显的抑制作用;在同一浓度多西他赛作用下,转染Cav-1组细胞的增殖抑制率明显高于对照组和空载体组(P<0.01).与对照组和空载体组相比,20 μg/mL多西他赛作用后转染组细胞中Bax的表达升高(P<0.01),而Bcl-2的表达降低(P<0.01),并且磷酸化AKT (p-AKT)蛋白的表达水平下降(P<0.01),而对照组和空载体组之间Bax、Bcl-2以及p-AKT蛋白的表达则无明显差异(P>0.05).结论 多西他赛可以通过促进Cav-1的表达影响PI3K/AKT 信号转导通路,进而调节凋亡相关蛋白的表达抑制MCF-7 细胞的增殖.