阳离子脂质体介导的肺癌细胞基因转染效率的比较研究

目的 提高阳离子脂质体介导的肺癌细胞基因转染效率。方法 采用表达Ｅ．ｃｏｌｉβ－半乳糖苷酶的ｐＣＭＶβ报告基因质粒及组化染色评价阳离子脂质体的转染效率。优化脂质体介导肺癌细胞基因转染效率的条件包括：脂质体：ＤＮＡ电荷比率，ＤＮＡ转染剂量，阳离子脂质体的类型。结果 当阳离子脂质体：ＤＮＡ电荷比率（＋／－）为３：１时，ｐＣＭＶβ的剂量为４ｕｇ／孔（２４孔板）时，阳离子脂质体ＤＯＳＰＥＲ介导肺癌细胞株Ｓ     

脂质体介导的融合基因pCEAcd/tk转染肺癌细胞株效率的差异性

对脂质体介导的体外肺癌细胞DAN转效率的差异性进行研究。方法 :提取质粒 pCEAcd/tk ,脂质体包裹后转染 6种肺癌细胞株 ,G418筛选 ,计数细胞阳性克隆数。结果 :6种肺癌细胞株中 ,导入了pCEAcdt/tk并获得稳定表达的细胞阳性克隆数差异较大 ;脂质体ESCORT -DNA混合物与细胞孵育时间不同对转染效率也有一定的影响。结论 :脂质体介导的方法把融合自杀基因表达体系导入到肺癌细胞的效率存在细胞差异性     

t－PA cDNA基因在CHO细胞中的稳定表达

建立稳定表达人组织型纤溶酶原激活剂（ｔｉｓｓｕｅ－ｔｙｐｅｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎａｃｔｉｖａｔｏｒ，ｔ－ＰＡ）的细胞株。将ｔ－ｐＡｃＤＮＡ连接在真核表达载体ｐｃＤＮＡ３的ＨｉｎｄⅢ位点，构建成重组质粒ｐｃＤＮＡ３ｔＰＡ，用磷酸钙介导的贴壁细胞转染法导入哺乳动物中国仓鼠卵巢（ＣＨＯ）细胞中，Ｇ４１８筛选培养后形成阳性克隆。结果：培养液中重组ｔ－ｐＡ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｔ－ｐＡ，ｒｔ－ｐＡ）活性＞６０００ＩＵ／１０６细胞ｄ－１．Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交证实ｔ－ＰＡｃＤＮＡ基因的转录。高表达细胞连续传代１０次后，培液中ｒｔ－ｐＡ活性未见明显变化。结论：转染ｔ－ＰＡｃＤＮＡ基因的ＣＨＯ细胞已形成稳定的工程细胞。     

6A8 cDNA编码一种α-甘露糖苷酶

目的 探讨６Ａ８ ｃＤＮＡ编码的蛋白质的性质。方法 依据Ｃｏｎ Ａ的配体是基露糖,而α－甘露糖苷酶的作用是剪细胞糖蛋白聚糖中苷露糖的原理,采用细胞免疫荧光染色法以及激光共聚焦显微镜观察经转染６Ａ８ｃＤＮＡ正义或反义重组表达载体后,细胞结合ＣｏｎＡ的强弱,验证６Ａ８ｃＤＮＡ编码的蛋白质是否为一种α－甘露－糖苷酶。结果 ＣＯＳ－６ 人鼻咽癌细胞株ＣＮＥ－２Ｌ２转染ｐＲｃ／ＣＭＶ－正交６Ａ８ｃＤＮＡ后与     

HCV核心蛋白DNA疫苗诱导的小鼠体液免疫应答

目的：观察丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）核心蛋白ＤＮＡ疫苗诱导ＢＡＬＢ／ｃ小鼠体液免疫应答的效力，为研制应用于人类的ＨＣＶ ＤＮＡ疫苗提供实验依据。方法：将全长ＨＣＶ核心蛋白基因插入真核表达质粒载体ｐｃＤＮＡ３．１，构建ＨＣＶ核心蛋白重组表达质粒ｐｃＤＮＡ３．１ＨＣＶｃｏｒｅ，肌注ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，以ＥＬＩＳＡ法检测小鼠血清ＨＣＶ抗体。以此重组质粒转染小鼠ＮＩＨ３Ｔ３细胞，以ＨＣＶ抗体阳性小鼠血清为捕获抗     

重组人促红细胞生成素在COS-7细胞内表达的研究

目的：研究不同真核载体对人促红细胞生成素ｃＤＮＡ的表达效率。方法：人促红细胞生成素ｃＤＮＡ分别用真核表达载体ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＩ、ｐＡｄＣＩ进行重组，脂质体法转化ＣＯＳ ７细胞，以ＴＦ １细胞检测ＥＰＯ的表达活性。结果：感染ｐｃＤＮＡ３ ＥＰＯ，ｐｃＤＩ ＥＰＯ，和ｐＡｄＣＩ ＥＰＯ的ＣＯＳ ７细胞培养上清中人促红细胞生成素活性分别为０５×１０２，１５×１０３和２２×１０２。结论：已构建成可表达具生物活性的重组人促红细胞生成素的真核表达克隆，嵌合内含子序列可增强人促红细胞生成素ＣＤＮＡ的表达效率     

抑癌基因MTS1真核表达载体的构建及其在卵巢癌细胞系HO-8910中的表达

目的：构建多肿瘤抑制基因１（ＭＴＳ１）的真核表达载体,将其转入人源性卵巢癌细胞株ＨＯ－８９１０中,并得到稳定表达,为进一步研究其对卵巢癌细胞的影响奠定实验基础．方法：利用ＢａｍＨⅠ与ＥｃｏＲⅠ从ｐＵＣ１９－ｐ１６质粒上切下ＭＴＳ１ｃＤＮＡ片段并克隆到真核表达载体ｐｃＤＮＡ３上,构建成ＭＴＳ１真核表达载体ｐｃＤＮＡ３－ｐ１６;利用脂质体（Ｆｕ－ＧＥＮＥＴＭ６）介导的基因导入法将ｐｃＤＮＡ３－ｐ１６导入人源性卵巢癌细胞株ＨＯ－８９１０中;采用ＡＢＣ法对转染后的不同代数细胞进行免疫细胞化学检测,观察ｐ１６蛋白的表达．结果：成功构建了ＭＴＳ１真核表达载体ｐｃＤＮＡ３－ｐ１６,并进行酶切鉴定;转染后经Ｇ４１８筛选２ｗｋ出现阳性克隆８９１０－ｐ１６,并检测到其中有ｐ１６蛋白的稳定表达．结论：成功构建ＭＴＳ１真核表达载体ｐｃＤＮＡ３－ｐ１６,并可在人源性卵巢癌细胞株ＨＯ－８９１０中得到稳定表达．     

转染p21^WAF1／CIP1对肾癌细胞系GRC—1促凋亡作用

研究转染ｐｗｑ＾２１ＷＡＦ１／ＣＩＰ１对肾癌失足 凋亡作用。方法：采用脂质体介导的逆录病毒载体将ｐ２１＾ＷＡＦ１／ＣＩＰ１转入无Ｐ２１蛋白表达的肾癌细胞ＧＲＣ－１中,通过是,流式细胞仪,ＤＮＡ梯电泳检测细胞凋亡。结果：电镜检测到凋亡细胞,ＤＮＡ电泳呈梯状。所检测细胞中１５．３％出现凋亡。结论：ｐ２１＾ＷＡＦ１／ＣＩＰ１过表达有促进ＧＲＣ－１细胞凋亡作用。     

重组人促红细胞生成素cDNA在CHO-dhfr-细胞中的高效表达

目的：使重组人促红细胞生成素（ｒｈＥＰＯ）在ＣＨＯ细胞中获得高效表达。方法：利用基因重组构建了两个人促红细胞生成素ｃＤＮＡ重组表达质粒ｐＥＤ－ＥＰＯ和ｐＥＦ－ＥＰＯ，分别用ＤＥＡＥ－ｄｅｘｔｒａｎ法转染ＣＯＳ７细胞，作瞬时高表达，选ｐＥＦ－ＥＰＯ用磷酸钙共沉淀法转染ＣＨＯ－ｄｈｆｒ－细胞，加入氨甲喋呤（ＭＴＸ）扩增、选择，作稳定性高表达。结果：ｐＥＤ－ＥＰＯ和ｐＥＦ－ＥＰＯ转染ＣＯＳ７细胞后７２ｈ表达量分别为１７．８和２１．０ｎｇ／ｍｌ，ｐＥＦ－ＥＰＯ转染ＣＨＯ－ｄｈｆｒ－细胞，随着ＭＴＸ浓度的增加，ＣＨＯ－ｄｈｆｒ＋的克隆数减少，而混合克隆的ＥＰＯ表达量逐渐升高。筛选了一株稳定性高表达ｒｈＥＰＯ的细胞株，其３ｄ表达量为１６μｇ／ｍｌ。结论：ｒｈＥＰＯ在ＣＨＯ细胞中获得了高表达     

HPV16E6羧基端编码基因的克隆及真核细胞表达

目的：探讨用人乳头瘤病毒１６型（ＨＰＶ１６）早期基因Ｅ６羧基端基因片段（Ｅ６Ｃ）研制ＤＮＡ疫苗的可行性。方法：采用ＰＣＲ方法从质粒ｐＨＰＶ１６中获得Ｅ６Ｃ端基因片段,将其克隆入含巨细胞病毒（ＣＭＶ）启动子的真核表达载体,脂质体介导基因转染ＬＡ７９５小鼠肺腺癌细胞并检测Ｅ６Ｃ的表达。结果：成功构建了真核表达质粒ｐＬＮＣＥ６Ｃ,免疫组化结果显示真核表达质粒ｐＬＮＣＥ６Ｃ在ＬＡ７９５细胞中获得有效表达。     

转染p53抑癌基因体外抑制K562细胞克隆的形成

目的：构建ｐ５３表达质粒，研究ｐ５３基因对白血病细胞Ｋ５６２细胞生长的抑制作用。方法：以Ｔ４连接酶把２１６０ｂｐ的ｐ５３ｃＤＮＡ片段插入ｐＲｃ／ＣＭＶ质粒，重组构建ｐＲｃ／ｐ５３表达质粒，以Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ介导ｐＲｃ／ｐ５３质粒转染Ｋ５６２细胞，以甲基纤维素半固体培养方法作Ｋ５６２细胞体外克隆培养，观察转染ｐ５３基因后Ｋ５６２细胞克隆形成改变。结果：ｐ５３ｃＤＮＡ质粒转染的Ｋ５６２细胞，体外培养克隆形成能力明显减低。在接种１×１０４细胞时，未转染的空白对照组及空质粒对照组白血病细胞集落数分别是２７９７±２６４和２７２５±２６１；而ｐ５３质粒转染组细胞集落数是１０６１±１６０；与空质粒转染组及未转染的Ｋ５６２细胞组比较有非常显著性差异（Ｐ＜０００１，ｎ＝１０）。结论：转染ｐ５３基因能抑制Ｋ５６２细胞的生长。     

乙型肝炎病毒DNA转染细胞的一种内参标准:真核细胞报告基因SEAP

目的 建立用真核细胞报告基因ＳＥＡＰ转染人肝癌细胞系及鸡肝癌细胞系（ＬＭＨ）的表达系统,供研究ＨＢＶ基因功能应用。方法 分别将带有分泌性碱性磷酸酶（ＳＥＡＰ）报告基因的ｐＢＣ１２／ＰＬ／ＳＥＡＰ及ｐＢＣ１２／ＣＭＶ／ＳＥＡＰ质粒ＤＮＡ转染Ｈｕｈ７、ＨｅｐＧ２及ＬＭＨ细胞,并用ｐＢＣ１２／ＣＭＶ／ＳＥＡＰ质粒ＤＮＡ与Ｓ基因区变异体的克隆ＨＢＶ ＤＮＡ共转染ＨｅｐＧ２细胞。培养后收取细胞培养液,用ＥＬ     

rhG-CSF cDNA高表达质粒的构建及其在COS7细胞中的表达

目的：构建一个能在哺乳动物细胞中高表达人粒细胞集落刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）ｃＤＮＡ的重组质粒。方法：利用化学合成引物，进行ＰＣＲ，对人Ｇ－ＣＳＦｃＤＮＡ５＇ＡＵＧ侧翼序列进行翻译优化突变。测序确证后，重组入表达载体ｐＥＤ，构建成质粒ｐＥＤ－ＧＣＳＦ，用ＤＥＡＥ－Ｄｅｘｔｒａｎ法转染ＣＯＳ７细胞，ＥＬＩＳＡ法定量测定ｒｈＧ－ＣＳＦ表达水平。结果：转染ＣＯＳ７细胞后４８ｈ收集的上清ｒｈＧ－ＣＳＦ表达量为５２ｎｇ／ｍｌ，７２ｈ为２３０ｎｇ／ｍｌ，显示ｒｈＧ－ＣＳＦ获得了暂时性高表达。结论：ｐＥＤ－ＧＣＳＦ是一个能在哺乳动物细胞中高效表达ｒｈＧ－ＣＳＦ的真核表达质粒。     

人血小板生成素cDNA的克隆及在COS-7细胞中的表达

目的：克隆人血小板生成素（ｈＴＰＯ）ｃＤＮＡ，并研究其在ＣＯＳ－７细胞中的表达。方法：通过ＲＴ－ＰＣＲ法获得ｈＴＰＯ ｃＤＮＡ，测序后克隆到真核表达载体ｐＥＤ上，以ＤＥＡＥ－ｄｅｘｔｒａｎ法转染ＣＯＳ－７细胞，巨核细胞集落形成培养法测表达产物活性。结果和结论：获得的ｈＴＰＯ ｃＤＮＡ和献报道的序列一致。转染细胞ＲＮＡ斑点杂交结果显示ＴＰＯ ｃＤＮＡ获得转录，转染后４８和７２ｈ的细胞上清均可测到Ｔ     

AdCMVtk／GCV系统诱导肿瘤细胞死亡途径

探讨ＡｄＣＭＶｔｋ／ＧＣＶ系统诱导肿瘤细胞死亡的途径。方法：Ｅ要用台盼蓝染色检测坏死细胞数，吖啶橙荧光染检测凋亡细胞数，同时观察凋亡细胞的形态学改变。结果：ＡｄＣＭＶｔｋ／ＧＣＶ系统诱导肺癌细胞死亡形式有两种，即坏死和凋亡，行出现凋亡，后引起坏死。结论ＨＥ染色及吖啶橙荧光染色可见黄型的凋亡形态学改变。     

Fas基因在卵巢癌细胞凋亡中的作用

目的：检测Ｆａｓ基因表达并观察转染Ｆａｓ基因对卵巢癌细胞凋亡的影响,探讨其在卵巢癌发生、发展中的作用。方法：经流式细胞术、ＲＴ－ＰＣＲ方法检测６种卵巢癌细胞Ｆａｓ的表达水平。构建ｐｃＤＮＡ３－Ｆａｓ真核表达载体。经脂质体转染细胞,通过流式细胞仪检测Ｆａｓ基因表达变化。应用ＰＩ染色经流式细胞术检测观察转染Ｆａｓ基因对３ＡＯ细胞凋亡的影响。结果：６种卵巢癌细胞均表达Ｆａｓ均属中低表达,经ｐｃＤＮＡ３－     

反义6A8cDNA转染肿瘤细胞生物学行为的研究

目的 探讨反义６Ａ８对肿瘤细胞恶性行为的影响。方法 选用来自人鼻咽癌细胞系ＣＮＥ－２Ｚ的高转移克隆ＣＮＥ－２１２细胞,分别用ｐＲＣ／ＣＭＶ－反义６４８ｃＤＮＡ表达载体及空质粒转染并检测了反义６Ａ８ｃＤＮＡ转染,空载体转染及未转染细菌自身及基质的粘附性,运动性和水解酶活性,体外侵袭性及体内生长转移能力。     

脂质体介导c—myc反义核酸对HL—60细胞作用的研究

原癌基因ｃ－ｍｙｃ参与调控细胞的增殖、分化和凋亡过程,在白血病细胞株ＨＬ－６０ 中有很高的表达。ｃ－ｍｙｃ通过扩增活化或基因重排而异常激活,在白血病的发生和发展中可能起着重要的作用。　目的　通过脂质体介导ｃ－ｍｙｃ反义核酸转染ＨＬ－６０ 细胞,观察其抑制细胞生长增殖、促进分化、诱导凋亡,降低ｃ－ｍｙｃｍ ＲＮＡ 和蛋白表达水平,探讨反义核酸的抗肿瘤作用机制。　方法　ＨＬ－６０ 细胞在３７℃、５％ＣＯ２ 条件下,培养于１０％ 小牛血清１６４０ 培养液中,细胞接种密度为４×１０７／Ｌ,反义核酸终浓度为１μｍ ｏｌ／Ｌ,反义核酸与脂质体比例为１ μｍ ｏｌ（６．５ μｇ）∶１０ μｇ,无血清转染６ ｈ。实验同时设置空白组、无义组、反义组、脂质体组、脂质体无义组等对照组。连续培养４ 天。通过锥虫蓝拒染实验测定细胞的生长能力;ＮＢＴ还原实验和瑞特－姬姆萨染色测定细胞的分化能力;免疫细胞化学染色检测ｃ－ｍｙｃ蛋白表达;ＲＴ－ＰＣＲ法检测ｃ－ｍｙｃ ｍ ＲＮＡ 水平;吖啶橙／溴化乙锭染色观察凋亡细胞形态;流式细胞仪检测凋亡率;ＤＮＡ抽提及电泳观察凋亡细胞ＤＮＡ降解片段的形成。　结果　脂质体转染ｃ－ｍｙｃ反义核酸的作用：（１）抑制ＨＬ－６０     

腹膜小细胞恶性肿瘤光镜、免疫组化及超微结构观察

获取稳定表达重组人血小板生成素（ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ, ＴＰＯ）的ＮＩＨ３Ｔ３成纤维细胞克隆,为开展成纤维细胞介导的 ＴＰＯ基因治疗研究提供细胞学基础。方法：以重组人ＴＰＯ ｃＤＮＡ为目的基因,构建真核细胞表达重组体ｐｃＤＮＡ３／ＴＰＯ,藉脂质体将其转染于ＮＩＨ３Ｔ３细胞,经Ｇ４１８筛选,获得稳定表达重组人ＴＰＯ的细胞克隆,应用ＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲ及 Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹等技术鉴定目的基因的导入及表达。 结果：ｐｃＤＮＡ３／ＴＰＯ可藉脂质体转染ＮＩＨ３Ｔ３细胞,转染细胞可稳定表达并分泌ＴＰＯ。结论：已获得所需细胞克隆,为应用人ＴＰＯｃＤＮＡ进行基因治疗奠定了基础。     

大鼠GDNF真核表达载体的构建及其真在核细胞中的表达

目的：构建ｐｃＤＮＡ３／ＧＤＮＦ真核表达质粒并了解其在真核细胞内的表达．方法：将ＧＤＮＦ逆转录聚合酶链式反应产物克隆至ｐｃＤＮＡ３真核表达载体上,经酶切鉴定及测序分析并以脂质体介导法转染真核细胞,了解其在细胞内的表达及其表达蛋白的生物学活性．结果：酶切鉴定及测序分析表明重组ｐｃＤＮＡ３／ＧＤＮＦ表达质粒克隆成功,转染实验表明重组质粒能在真核动物细胞中表达出具有活性的ＧＤＮＦ蛋白．结论：以脂质体介导