日本血吸虫成虫呕吐物的生化及免疫学特性分析

目的：分析日本血吸虫成虫呕吐物与感染血清的免疫反应性，寻找特异性的血吸虫病诊断抗原。方法：采用SDS-PAGE和免疫印迹分析呕吐物的免疫反应性，过碘酸钠氧化处理以鉴定呕吐物的抗原决定簇的性质。结果：日本血吸虫成虫呕吐物中存在能被血吸虫感染血清识别的特异抗原子1/32、47、60/62kDa蛋白及67kDa蛋白；31/32kDa蛋白和67kDa蛋白的抗原表位为蛋白，而47kDa蛋白和60/62kDa蛋白的抗原表位为糖基。结论：日本血吸虫成虫呕吐物中存在血吸虫感染血清识别的特异抗原，其中31/32kDa蛋白已报告可用于血吸虫病诊断，47kDa蛋白和60/62kDa蛋白含糖基表位并具有潜在的诊断价值。     

日本血吸虫生殖相关抗原31～32kDa分子的质谱分析与鉴定

目的利用蛋白质组学技术分离、鉴定日本血吸虫天然分子31～32kDa抗原组分。方法收集感染后32d的日本血吸虫成虫，制备成虫蛋白，经一维电泳、固相pH梯度双向凝胶电泳分离，选取31-32kDa附近的蛋白点进行质谱分析鉴定，通过凝胶图像分析软件进行结果比较。结果二维电泳结果显示31～32kDa附近有13个蛋白点，经MALDI-TOF-MS鉴定及分析，发现3个蛋白分子分别与曼氏血吸虫Actine-2、日本血吸虫3-磷酸甘油脱氢酶、曼氏血吸虫组织蛋白酶B肽链内切酶有高度的同源性。结论31-32kDa组分中含有这3个蛋白点，它们与日本血吸虫31～32kDa天然分子中起保护性的有效分子密切相关。同时，它们的发现也为天然分子疫苗向基因工程疫苗的推进奠定了基础。     

日本血吸虫成虫31/32 kDa蛋白的纯化及保护性免疫力的研究

本文采用制备型聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和电渗析方法分离纯化日本血吸虫成虫 31/32 kDa 蛋白(Sj 31/32蛋白)。SDS-PAGE、免疫印迹试验(EITB)和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测结果表明采用该方法分离纯化的 Sj 31/32 蛋白纯度高,且具有较高的活性。用纯化的 Sj 31/32 蛋白加福氏佐剂免疫的小鼠,不仅可减少虫负荷(减虫率 28.1％),还可降低血吸虫成虫的产卵量(减卵率 71.4％),抑制虫卵肉芽肿的形成。结果提示:Sj 31/32 蛋白具有较高的减卵率,可望作为混合多价疫苗候选组分。     

日本血吸虫成虫31/32KD诊断蛋白:与血吸虫单克隆抗体和病人血清的免疫印斑反应

应用免疫印斑试验观察日本血吸虫成虫蛋白与感染日本血吸虫病人和鼠血清的反应证实:日本血吸虫和曼氏血吸虫具有相同的31/32KD诊断蛋白;两者均来源于成虫肠管:与抗血吸虫单克隆抗体的反应基本相同。但是,两种血吸虫蛋白至少有一个抗原决定簇不同。日本血吸虫诊断蛋白与血吸虫病人和其他寄生虫病患者血清检测结果,证实了血吸虫成虫31/32KD蛋白可应用于日本血吸虫病的血清学诊断。     

日本血吸虫和曼氏血吸虫成虫31/32kD蛋白的纯化及在诊断中的应用

本研究以前染蛋白为指示,将制备型SDS—PAGE和电渗析技术相结合,分离、纯化日本血吸虫和曼氏血吸虫成虫31/32kD蛋白,用于ELISA中诊断血吸虫病。结果:纯化日本血吸虫成虫31/32kD蛋白(Psj31/32)与急、慢性日本血吸虫病和曼氏血吸虫病人血清反应的阳性率分别为100％、100％和98.4％;纯化曼氏血吸虫成虫31/32kD蛋白(Psm31/32)与上述病人血清反应的阳性率均为100％。与NHS和其它寄生虫病人血清反应的特异性较高。Psj31/32和Psm31/32检测同种血清,它们的OD值具有高度的正相关关系,但OD值与曼氏血吸虫病人粪便中虫卵数量(EPG)无相关关系。结果提示:两种纯化的31/32kD蛋白在血吸虫病诊断中具有较高的敏感性和特异性,并具有共同抗原决定簇存在,不仅可用于诊断急、慢性日本血吸虫病,而且Psj31/32也可作为诊断曼氏血吸虫病的候选抗原,用于我国输入性曼氏血吸虫病的诊断。     

曼氏血吸虫62kDa条带:一种放射致弱疫苗T细胞抗原和钙网蛋白

曼氏血吸虫成虫可溶性抗原(SAWA)的62/60kDa条带可被照射致弱尾蚴免疫的小鼠血清所识别,并可诱导T细胞应答。为证实并进一步研究上述发现,本研究用曼氏血吸虫SAWA 62/60kDa免疫的小鼠血清对曼氏血吸虫成虫cDNA表达文库进行筛选,并对纯化后的62kDa和60kDa蛋白进行氨基酸测序,以鉴定其作为疫苗免疫后T细胞抗原决定簇的性质和可能性。     

抗日本血吸虫生殖功能分子SIEA26-28kDa单链抗体与EGFP的融合表达及靶向性研究

目的 体外观察抗日本血吸虫生殖功能分子SIEA26～28kDa单链抗体与日本血吸虫各阶段的靶向部位,探讨单链抗体在抗血吸虫病疫苗研究中的应用价值.方法 扩增增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因,克隆至PET32a/SIEA26～28kDa-scFv质粒,构建PET32a/EGFP-scFv质粒.转化至感受态E.coli BL21(DE3)中,并诱导表达单链抗体融合蛋白,分析单链抗体融合蛋白与SIEA26～28kDa的结合特异性.单链抗体融合蛋白与日本血吸虫成虫、虫卵切片孵育,荧光显微镜下观测GFP信号,确定特异性单链抗体的靶向性.结果 重组质粒PET32a/EGFP-scFv构建成功,Trx-EGFP-scFv融合蛋白高效表达,与SIEA26～28kDa特异性结合.GFP信号主要集中在未成熟卵卵胚,雌虫卵巢、卵黄腺及与生殖系统邻近的肠腔组织.结论 SIEA26～28kDa单链抗体与血吸虫未成熟卵胚胎及雌虫生殖系统具有较强的靶向性,具有潜在抗卵胚发育、抗雌虫生殖作用,为SIEA26～28kDa单链抗体在抗日本血吸虫病疫苗免疫靶向方面的研究奠定了基础.     

日本血吸虫与斯氏狸殖吸虫交叉抗原的筛选和鉴定

目的筛选和鉴定可与斯氏狸殖吸虫病患者血清产生交叉反应的日本血吸虫成虫抗原或其排泄分泌（ES）抗原组分,为筛选血吸虫病特异性诊断抗原奠定基础。方法首先采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离日本血吸虫成虫蛋白和ES蛋白,然后采用Western blot鉴定其中能够与斯氏狸殖吸虫病人血清反应的蛋白条带,最后取下对应的阳性条带进行质谱检测,对该蛋白进行分析和鉴定。结果成功采用SDS-PAGE对日本血吸虫成虫蛋白和ES蛋白进行了分离。Western blot结果显示,在ES蛋白中出现了一阳性条带,分子量约为53kDa;质谱检测结果显示该蛋白为未知蛋白。结论日本血吸虫成虫ES成分中的53kDa蛋白可能是日本血吸虫和斯氏狸殖吸虫的交叉抗原。     

日本血吸虫不同病期血清抗体对虫源性及卵源性组分抗原的识别及鉴定

目的分析不同病期感染兔血清所识别的日本血吸虫成虫抗原(adult worm antigen,AWA)和可溶性虫卵抗原(soluble egg antigen,SEA)的组分蛋白,探索可能与Th1/Th2极化相关的主要功能性抗原。方法常规方法制备成虫和虫卵抗原,用SDS-PAGE电泳和Western blotting技术,分析鉴定感染动物血清抗体识别的虫源性及卵源性组分抗原。结果不同病期血清抗体识别的AWA、SEA组分蛋白谱不同。其中AWA中的11kDa、37kDa、57kDa、79kDa、95kDa a组分分子能被各病期(2~20w)感染血清抗体所识别;SEA中的10kDa、18kDa、41kDa、47kDa、74kDa则可被急性期及以后各病期(6~20w)血清抗体所识别,25kDa、32kDa仅为急性期(6~12 w)血清抗体所识别,提示这些组分抗原可能为血吸虫免疫应答的主要功能性抗原,并且同感染血清的反应性明显与病期相关。结论以上AWA和SEA的组分蛋白和不同病期感染血清的反应与血吸虫感染后的Th1/Th2免疫偏移相关,其中能被急性期及以后各病期血清抗体共同识别的SEA主要功能性组分抗原中可能存在诱导Th2极化反应的重要抗原分子。     

日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶基因克隆和序列分析

目的克隆日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶（SjTGR）基因,并进行序列分析。方法制备日本血吸虫成虫mRNA,反转录合成cDNA,采用聚合酶链反应（PCR）技术,从日本血吸虫成虫cDNA中扩增出SjTGR基因片段。通过TA克隆技术将该基因片段克隆到pGEM-T载体中进行DNA序列测定和生物信息学分析。结果采用PCR技术成功地从日本血吸虫成虫cDNA中扩增出TGR基因片段,TA克隆后DNA序列分析显示该基因长度为1791bp,编码596个氨基酸残基,理论分子质量65kDa,生物信息学分析显示与曼氏血吸虫TGR氨基酸序列同源性为82%,含有吡啶核苷酸二硫化物氧化活性中心CVNVGC序列,在氨基端含有谷氧还蛋白特征性的活性位点CPFC基序。结论SjTGR基因克隆获得成功,为发展抗日本血吸虫新药及疫苗候选分子奠定了基础。     

日本血吸虫24-26kDa抗原和重组Sj26抗原的抗原性和免疫原性比较研究

本文报告从日本血吸虫大陆株成虫抽提的24—26kDa抗原与源于日本血吸虫菲律宾株的重组Sj26抗原之间在抗原性和免疫原性上所进行的一系列比较研究。ELISA、IFA和Westernblotting等方法观察结果均表明,24—26kDa和rSj26抗原免疫后所诱导的特异性抗体与其对应的抗原之间具有明显的抗原交叉反应,而与其它血吸虫抗原如可溶性虫卵抗原也有交叉反应。若以两种抗原加福氏佐剂分别免疫小鼠,以日本血吸虫大陆株尾蚴攻击感染,减虫率相似(26～32％),表明两种抗原存在一定程度的交叉免疫保护性。这些研究结果为开发rSj26抗原,或是根据已知Sj26 cDNA核苷酸序列制备DNA探针,从已构建的日本血吸虫(大陆株)cDNA库筛选相关目的基因,加速血吸虫疫苗的研制起着重要作用。     

吡喹酮治疗对日本血吸虫31/32 kDa抗体的影响

为探讨化疗对日本血吸虫31/32kDa抗体的影响，应用纯化日本血吸虫31/32kDa抗原（Sj31/32）和可溶性虫卵抗原（SEA）对94例经吡喹酮治疗后不同时期血吸虫病患者血清抗体进行检测。结果治疗后3和6个月血清31/32kDaIgG水平分别为1.26±0.15和0.65±0.14(治疗前为2.03±0.20,P<0.01)，而SEAIgG水平则分别为2.87±0.19和2.30±0.20（治疗前为3.01±0.17,P>0.05）。各年龄组治疗前后血吸虫抗体水平均随治疗进展而降低，其中儿童和青少年（3～20岁年龄组）Sj31/32IgG水平下降最快，治疗后6个月时几乎接近正常值。治疗前Sj31/32IgG与SEAIgG水平之间高度相关（r=0.90），治疗后3和6个月两者之间的相关程度降低（r分别为0.30和0.40）。结果表明，吡喹酮治疗后患者血清中Sj31/32IgG下降较快，Sj31/32IgG似可作为一种短期抗体用于疗效考核。     

日本血吸虫32kDa重组抗原的进一步研究

用慢性日本血吸虫病病人血清筛选以βgill构建的日本血吸虫中国大陆株成虫cDNA表达库，获得一阳性克隆Sjgt4，将其插入片段经聚合酶链反应（PCR）法扩增后亚克隆入表达载体pTrcHisB并进行表达，获37kDa融合蛋白，它可溶于8M尿素，并可被日本血吸虫病病人血清中特异抗体所识别。以此37kDa融合蛋白免疫家免所得的抗血清，可特异地识别日本血吸虫成虫抗原的67kDa分子。     

一种裂体吸虫与日本血吸虫蛋白质差异研究

目的 探讨裂体吸虫x(S.x)和日本血吸虫（S.j)的蛋白质有无差异。方法 采用SDSPAGE法。感染S.x和S.j尾蚴的兔45d后剖杀，从肠系膜静脉血管中取出成虫，各20对，匀浆，高速离心后取上清液电泳，分离胶和浓缩胶分别为10％和4％。电泳完成后以考马斯兰R250染色应用分子分析软件系统Gel Doc1000(BIO-RAD)进行分析，并计算出S.x与S.j的比值（S.x/S.j)。结果 S.x和S.j蛋白带各有26条，其中35.0kDa和109．8kDa为S.x和S.j分别特有的蛋白带，它们之间存在明显的差异；S.x和S.j和873kDa，40．9kDa和32．2kDa蛋白质量差异达2倍。15．2kDa蛋白质量差异1．9倍，73．2kDa蛋白质量差异1．7倍。结论．S.x和S.j成虫可溶性蛋白所分出的带数经定性，定量分析，差异明显。     

日本血吸虫成虫呕吐和排泄分泌物的蛋白质组学分析

目的探讨日本血吸虫成虫呕吐物和排泄分泌物的蛋白质组成,寻找高丰度蛋白分子。方法将日本血吸虫成虫浸泡于无菌水中15～30min,收集成虫的呕吐和排泄分泌物。通过蛋白质二维电泳,考马斯亮蓝染色与飞行质谱分析,确定各蛋白点的基因种类。结果日本血吸虫成虫的呕吐及排泄分泌物的二维电泳获得1012个蛋白斑点,456个斑点的蛋白质种类被质谱分析成功鉴定。这些蛋白可归为139种,其中76种为虫源性蛋白,主要是由一些与血吸虫生命代谢、生长发育、免疫调控相关的蛋白组成,其中烯醇化酶、70kDa热休克蛋白(HSP70)、果糖二磷酸醛缩酶、三磷酸甘油醛脱氢酶、磷酸甘油酸激酶、谷胱甘肽转移酶、抑免蛋白、硫氧还蛋白过氧化物酶、14-3-3蛋白等含量丰富,是高丰度的排泄分泌蛋白。结论本研究揭示了日本血吸虫成虫呕吐和排泄分泌物的蛋白组成,为进一步开发用于控制血吸虫病或其他寄生虫病的疫苗、新的治疗药物及诊断方法创造了条件。     

致弱尾蚴免疫血清与日本血吸虫不同发育阶段抗原免疫反应性的研究

目的　通过比较分析日本血吸虫不同发育阶段抗原的异同 ,并以致弱尾蚴免疫血清识别不同发育阶段抗原 ,筛选具有保护性免疫作用的抗原分子。方法　分离制备日本血吸虫未成熟虫卵、成熟虫卵、尾蚴、雄性成虫、雌性成虫等不同发育阶段的抗原 ;采用ELISA分别测定正常尾蚴感染兔血清、紫外线照射致弱尾蚴免疫兔血清抗原的抗体水平 ;通过SDS PAGE电泳和免疫印迹技术 ,分析正常尾蚴感染血清与紫外线照射致弱尾蚴免疫兔血清对不同发育阶段的免疫反应性。结果与结论　SDS-PAGE结果显示未成熟虫卵抗原、成熟虫卵抗原、尾蚴抗原、雄性成虫抗原、雌性成虫抗原蛋白之间互有异同。间接ELISA试验显示致弱尾蚴免疫血清同样能诱导宿主产生高滴度的抗体水平。致弱尾蚴免疫血清共筛选出 2 3种具免疫学活性的抗原分子 ,分子量分别为 :2 4 .5kDa、2 8kDa、36kDa、4 3kDa、4 4kDa、4 8kDa、5 4kDa、5 8.5kDa、6 0kDa、6 2kDa、6 6kDa、6 8kDa、70kDa、75kDa、79kDa、85kDa、87kDa、91kDa、95kDa、97kDa、10 5kDa、10 8kDa、110kDa。其中未成熟虫卵和成熟虫卵抗原各占 11种 ,尾蚴抗原分子 4种 ,雄性成虫抗原分子 3种 ,雌性成虫抗原分子 6种 ,提示这些抗原分子可能为抗日本血吸虫病疫苗候选分子的重要靶标     

日本血吸虫普遍性结合酶E基因的获得和分析

目的从日本血吸虫(Schistosoma japonicum)成虫cDNA文库中获得并分析日本血吸虫新基因,为日本血吸虫病的防治提供候选疫苗和药物靶点.方法构建日本血吸虫成虫cDNA文库,随机挑取重组阳性克隆进行测序,对部分序列进行步移法测序获取全长cDNA,登录GenBank,利用BLAST程序对同源性高的基因进行核苷酸和氨基酸水平的同源性比较;并利用pcgene软件对其蛋白质结构进行初步分析.结果获得了1个日本血吸虫新基因普遍性结合酶E基因(ubiqui-tin-conjugating enzyme E,AY251608),长854bp,编码149个氨基酸,与人类普遍性结合酶E具有55%的同源性,编码蛋白的理论分子量为7.149 8 kDa,等电点为8.01;抗原表位可能位于氨基酸序列373～396处.结论步移法测序和生物信息学技术相结合有利于发现日本血吸虫新基因.     

曼氏血吸虫诊断抗原(Sm31/32):在苏丹的血清流行病学研究

用曼氏血吸虫成虫抗原(Sm31/32),在苏丹一个曼氏血吸虫病(无埃及血吸虫病)流行村进行血清流行病学研究并与粪检作了比较。     

日本血吸虫成虫体内脂肪酸结合蛋白(Sj-FABPc)的免疫定位

血吸虫不能合成脂肪酸或固醇物质,但在其重要的代谢过程中需要这些分子,这可能有赖于宿主的提供。应用生化及遗传学方法,可从血吸虫成虫体内检出脂肪酸结合蛋白(FABPs)。据报道,其同源Sm14.7kDa脂肪酸结合蛋白是一种重要的抗曼氏血吸虫的疫苗靶分子。为此,本文作者采用透射电镜对日本血吸虫脂肪酸结合蛋白(Sj-FABPc)进行了免疫定位研究。     

日本血吸虫硫氧还蛋白编码基因的克隆和表达

目的克隆和表达日本血吸虫大陆株硫氧还蛋白(SjcTrx)的编码基因。方法根据日本血吸虫菲律宾株硫氧还蛋白基因序列设计一对引物,上游引物引入BamHI酶切位点和起始密码子ATG,下游引物引入SalI酶切位点和终止密码子TAA。以日本血吸虫大陆株成虫总RNA为模板,经反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增SjcTrx基因。经双酶切并纯化的PCR产物与同样双酶切并纯化的pET28a质粒DNA片段用T4 DNA连接酶连接,构建重组质粒pET28a-SjcTrx,转化BL21感受态菌并大量扩增。重组质粒DNA经限制性内切酶双酶切、PCR、琼脂糖凝胶电泳和核苷酸序列测定进行鉴定。pET28a-SjcTrx/BL21用IPTG诱导表达。结果SjcTrx编码基因RT-PCR产物约334 bp,构建的重组pET28a-SjcTrx表达质粒DNA经限制性内切酶双酶切和PCR扩增产物于琼脂糖凝胶电泳均观察到相同大小基因片段。根据核苷酸序列测序结果推导的氨基酸序列与日本血吸虫菲律宾株和曼氏血吸虫Trx分别有97%和43%的同源性。表达的重组蛋白经SDS-PAGE分析,约14kDa。Western blotting显示该重组蛋白可被日本血吸虫感染兔血清和重组抗原免疫小鼠血清所识别。结论SjcTrx基因的表达获得成功,并获得纯化蛋白,为开展动物保护性免疫试验创造了条件。