环介导同温扩增检测全血日本血吸虫DNA的研究

目的建立一种检测全血标本中日本血吸虫DNA的环介导同温扩增(LAMP)方法。方法选择日本血吸虫基因组重复序列DNA SjR2(839~1 138 bp、563~764 bp)、SjSH7(204~399 bp)和Sj-nonLTR1(1 678~1 877 bp)的4段DNA序列作为扩增片段,根据LAMP原理设计合成4组引物,通过对此4组引物用于DNA LAMP扩增的敏感性和特异性进行比较分析和检测条件的优化,建立特异、敏感,可用于检测全血日本血吸虫DNA的LAMP方法。应用此方法对10只日本血吸虫感染前及感染后不同时间同一家兔的配对全血DNA进行扩增,观察其应用价值。结果 4组引物中,以日本血吸虫SjR2(839~1 138 bp)作为扩增靶片段,可特异性扩增日本血吸虫中国大陆株(检出限为10-4ngDNA)、菲律宾株和曼氏血吸虫的基因组DNA,人全血基因组DNA、华支睾吸虫基因组DNA、疟原虫基因组DNA不能扩增。以Sj-nonLTR1(1 678~1 877 bp)为靶片段,LAMP扩增无特异性。以SjR2(563~764 bp)和SjSH7(204~399bp)为靶片段,可特异性扩增日本血吸虫中国大陆株基因组DNA(检出限为10-6ng和10-3ng)及菲律宾株基因组DNA,人全血基因组DNA、华支睾吸虫基因组DNA、曼氏血吸虫基因组DNA和疟原虫基因组DNA不能扩增。用SjR2(839~1 138 bp)引物对10只日本血吸虫感染兔不同时间的配对全血标本进行扩增,感染前血样均为阴性,感染后连续5周全血基因组DNA的浓缩标本均为阳性,非浓缩标本部分阳性。结论本研究建立了检测兔全血日本血吸虫兔基因组DNA的LAMP方法。该方法对浓缩DNA标本的检出效率高于非浓缩标本,具有血吸虫感染早期诊断价值。     

基于Google Earth的消除疟疾疫点示意图制作

目的 利用Google Earth制作疟疾疫点示意图,为判断疟疾疫点类型及开展疫点处置提供参考依据。 方法 在Google Earth平台上,以溧阳市2012—2016年疟疾疫情为例,通过搜索寻找疟疾病例所在位置并加以标注;利用多边形对溧阳市2017年8月份1例间日疟病例进行疫点示意图绘制;通过点击边界来完成疟疾疫点调查与处置措施的位点或范围,通过调整多边形边界线或面积的颜色和透明度来进行不同层次的渲染。 结果 在Google Earth地图标注每例疟疾病例所在地的经纬度,可产生1年或多年的全部病例或分虫种的疟疾疫情分布图。同时,在每个疫点的周围可以添加所开展的主动病例侦查、健康宣教、媒介监测的位置、杀虫剂喷洒的范围等疟疾疫点调查与处置措施的信息,还可通过标尺来完成不同病例居住地之间距离的测量。 结论 基于Google Earth制作的疟疾疫点示意图清晰直观、操作简单,适合在基层消除疟疾工作中推广使用。     

预警哨鼠抗Sj23HD IgG抗体Western blot检测方法的改进及应用

目的改进检测预警哨鼠血清抗日本血吸虫23ku膜蛋白大亲水肽段（Sj23HD）IgG抗体的Western blot方法,并观察其现场应用价值。方法预先制备转印有重组si23HD蛋白的NC膜条,采用化学发光Western blot检测哨鼠血清抗sj23HD IgG,观察方法的稳定性和敏感性,并对2012年江苏省潜在血吸虫感染高风险水域监测预警哨鼠回收后第14、21、35d血样进行检测,同时以ELISA检测方法作为对照,对免疫检测结果与解剖查虫结果进行统计学分析。结果改进后的Western blot操作简便,比常规方法节省142周时间。预制NC膜条至少可低温保存6个月,其敏感性与新鲜制备的NC膜条的敏感性相似。使用改进后的Western blot方法检测预警哨鼠14、21和35d血清标本,阳性率分别为0．90％,3．50％和5．06％,ELISA阳性率分别为0．45％、3．00％和5．06％,差异无统计学意义（P〉0．05）。两种免疫学方法的敏感性均高于解剖查虫法。结论改进后的Western blot操作简便,敏感性高,可用于预警哨鼠血吸虫感染检测。     

非洲学员对我国援非疟疾防治培训的需求分析

目的了解非洲学员对我国援非疟疾防治培训的需求,为援非培训班的对象选择和课程设置提供参考。方法采用整群抽样调查方法,对2014年和2015年参加江苏省寄生虫病防治研究所疟疾防治研修班的4期非洲学员进行问卷调查,对调查对象基本情况、从事疟疾工作情况和培训需求关系等进行统计分析。结果共调查培训学员161人,其中法语培训班学员占41.6%,英语培训班学员占58.4%。培训班学员构成以男性为主(69.3%),受教育专业背景以临床类专业为主(40.0%),工作年限在10年以内居多(56.4%)。48.2%的调查对象平时从事的疟疾预防和控制工作占总工作量的76%以上,80%以上的调查对象在市级及以上机构工作。调查对象工作类型集中在临床类(41.4%)和官员类(29.9%),其他为研究类职位(11.9%)。调查显示,非洲亟需的培训以疟疾防控策略为主(65.5%),对象以临床类人才(39.2%)为主。从语种上看,法语班学员更希望得到策略类培训(χ~2=12.528,P0.01);从工作级别看,在国家级机构工作的学员也更希望得到策略类培训(χ~2=10.508,P0.05)。结论目前我国援非疟疾防治培训项目可基本满足学员的需求,但应进一步根据学员职业背景、国家情况、参加疟疾工作年限和级别来制定有针对性的课程。     

弓形虫感染对大鼠海马BDNF和NMDA表达的影响

目的观察弓形虫慢性感染对大鼠海马组织脑源性神经营养因子(BDNF)和N-甲基天冬氨酸受体(NMDA)亚单位NR2A、NR2B表达的影响。方法将4w雄性Wistar大鼠随机分成3组:A组腹腔感染2 mL弓形虫速殖子2×107/mL;B组腹腔感染2 mL弓形虫速殖子2×105/mL和C组正常对照腹腔感染2 mL灭菌生理盐水。4w大鼠感染弓形虫速殖子9w后,应用免疫组化染色、原位杂交技术和图像处理方法分析海马BDNF,CA1、CA3和齿回状NR2A和NR2B的表达。结果BDNF的表达:弓形虫感染A组和B组大鼠免疫组化海马BDNF阳性染色颗粒均高于对照组,分别为(54.27±23.18)、(50.39±19.34)和(44.68±22.74)mm2(P<0.05);原位杂交显示弓形虫感染A组和B组大鼠脑组织中BDNF mR-NA表达均增加,海马阳性杂交信号高于对照组,为(0.13±0.02)、(0.12±0.02)和(0.09±0.01)(P<0.05);NR2A蛋白的表达:弓形虫感染A组和B组大鼠在CA3区表达的免疫反应灰度值较正常组相比较,差异均具有统计学意义(P<0.05),而在CA1区和齿状回表达的免疫反应灰度值与对照组相比较差异均无显著性(P>0.05)。NR2B蛋白的表达:弓形虫感染A组和B组大鼠在CA1和CA3区表达的免疫反应灰度值分别与对照组相比较,差异均具有统计学意义(P<0.05);而在齿状回表达的免疫反应灰度值差异无显著性(P>0.05)。结论弓形虫慢性感染大鼠海马组织BDNF和BDNF mRNA表达增强,弓形虫感染可影响其海马NMDA受体的表达。     

检测抗Sj23HD IgG在监测预警哨鼠血吸虫感染早期诊断中的价值

目的探讨检测抗日本血吸虫23ku膜蛋白大亲水肽段(Sj23HD)抗体IgG对血吸虫感染监测预警哨鼠进行早期诊断的价值。方法在潜在高风险血吸虫感染水域投放哨鼠,第一批哨鼠分别于回收后第14、35d采血,分离血清,第35d解剖查虫,第二批哨鼠分别于第21、50d采血,分离血清,第50d解剖查虫。以重组Sj23HD为抗原,通过常规ELISA和Western blot方法检测哨鼠血清抗Sj23HD抗体IgG,并与解剖查虫结果进行比较。结果 ELISA检测第一批预警哨鼠回收后第14d特异性抗体IgG阳性率为0.4%,第35d阳性率为3.7%;Western blot检测阳性率分别为1.7%和3.7%;第35d解剖,成虫阳性率为0.92%。ELISA检测第二批预警哨鼠回收后第21d特异性抗体IgG阳性率为2.4%,第50d阳性率为12.5%,Western blot阳性率分别为为5.2%和12%。第50d解剖,成虫阳性率为8.2%。两批哨鼠回收后14d、21d,Western blot法阳性率均比常规ELISA法高,两种免疫学方法的阳性率与解剖查虫法阳性率比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论抗Sj23HD抗体IgG ELISA和Western blot检测的敏感性高于解剖查虫法,能提前哨鼠预警的时间,提高预警效果;Western blot法敏感性和特异性均显著高于ELISA法,更具实用价值。     

快速检测日本血吸虫感染性钉螺LAMP试剂盒的建立及应用

目的构建快速检测日本血吸虫感染性钉螺环介导同温DNA扩增（LAMP）试剂盒,用于血吸虫病流行区感染性钉螺调查。方法采用碱裂解法制备钉螺基因组DNA样品,以缩短检测过程中样品DNA制备时间;对LAMP试剂进行组合优化,采用染料显色方法判定LAMP结果,以减少LAMP检测的操作步骤,避免污染,减少假阳性结果产生;建立批量检测钉螺的LAMP方法,以适用于血吸虫病防治现场大规模钉螺筛查与有感染性钉螺地块的调查。将以上优化技术及试剂整合成快速检测日本血吸虫感染性钉螺LAMP试剂盒。结果制备的日本血吸虫感染性钉螺LAMP检测试剂盒可用于血吸虫流行区现场钉螺快速检测,检测时间可由原来的6h缩短为2h,方法的灵敏性与常规LAMP法相似。该试剂盒能检测出感染后1周钉螺,能对现场钉螺进行大批量检测。结论建立的LAMP试剂盒用于日本血吸虫感染性钉螺检测快速、特异、操作简便,适用于日本血吸虫病流行区感染性钉螺调查。     

重组日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶动力学分析

目的对重组的日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶(SjTGR)进行酶动力学特征分析。方法用阿糖胞苷-2’,5’-二磷酸琼脂糖凝胶通过亲和层析纯化重组SjTGR蛋白。利用紫外分光光度计(UV-2550,SHIMADZU),在25℃条件下分别以5-联硫代-双-2-硝基苯甲酸(DTNB)、胰岛素、氧化型谷胱甘肽(GSSG)、β-羟乙基二硫化物(HED)为底物,测定SjTGR的硫氧还蛋白还原酶(TrxR)、谷胱甘肽还原酶(GR)、谷氧还蛋白(Grx)活性及其米氏常数。以金诺芬为抑制剂,测定其对SjTGR活性的抑制作用及抑制常数。结果 SjTGR是一种具有TrxR,GR,Grx活性的多功能酶,酶活性分别为8.11、2.19和12.10μmol·min-1mg-1。不同的酶底物得到的Km值分别为(21.42±0.44)μmol·L-1(NADPH)、(3.24±0.40)μmol·L-1(Trx)(、145.05±6.31)μmol·L-1(DTNB)(、49.55±6.31)μmol·L-1(GSSG)、(2 792±231)μmol·L-1(HED)(、1 698±54)μmol·L-1(GSH)。金诺芬对SjTGR活...     

日本血吸虫核糖核酸酶T2的表达及其功能分析

目的制备重组151本血吸虫核糖核酸酶T2蛋白（rSj RNase T2）,并分析其生物学功能。方法根据编码RNase T2开放阅读的基因序列设计、合成一对5’端带有酶切位点的引物。采用PCR方法从质粒CP1412/PEu—GST中扩增编码RNase T2蛋白成熟肽的基因片段,亚克隆到表达载体pET28a（＋）中,构建重组表达质粒Sj RNase T2-pET28a。将重组表达质粒转化到E．coli BL21中,用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）进行诱导表达,用镍螯合亲和层析胶在变性条件下纯化rSj RNase T2蛋白。纯化蛋白通过尿素浓度梯度透析的方法进行复性,制备可溶性rSj RNase T2。以酵母RNA为底物进行消化,采用琼脂糖凝胶电泳的方法检测rSj RNase T2酶活性。用纯化的rSj RNase T2免疫小鼠,采用酶联免疫法（ELISA）检测小鼠血清特异抗体水平,观察其抗原性;采用检测Western blot抗rSj RNase T2抗体IgG与成虫可溶性虫抗原、成虫外分泌抗原、虫卯可溶性抗原和虫卵外分泌抗原的反应性,并观察Sj RNase T2在虫体中的分布。以rSj RNase T2刺激巨噬细胞RAW264．7,通过流式分析观察RAW264．7细胞表面标志物CD16／32、CD206表达水平的变化,采用RTPCR检测RAW264．7细胞内诱导型一氧化氮合酶与精氨酸酶基因mRNA的表达水平,采用ELISA检测RAW264．7细胞培养上清液中IL-12及IL-10水平的变化,以观察Sj RNase T2的免疫凋节功能。结果重组表达质粒Sj RNase T2-pET28a构建成功,经IPTG诱导,能表达重组Sj RNase T2蛋白。该蛋白以包涵体形式存在,经过复性能获得部分可溶性蛋白。rSj RNaseT2具有酶活性,能够水解酵母RNA。ELISA检测rSj RNase T2免疫小鼠血清特异性抗体滴度为1：200000,该抗血清能识别来源于血吸虫虫卯及虫卯外分泌抗原中的天然RNase T2。rSj RNase T2可诱导巨噬细胞向M2型方向转化,表达高水平的IL-10、精氨酸酶及CD206表面分子。结论rSj RNase T2表达成功。该蛋白具有天然的酶学特性和抗原性,能调节巨噬细胞向M2型方向分化。     

电脑检索全国中草药名鉴数据库的研制与应用

<正> 电脑检索全国中草药名鉴数据库为1985年卫生部、国家中医药管理局第1批中标课题,是以《全国中草药名鉴》(简称《名鉴》)编订研究为基础建立的一个大型数据库。至1991年5月为止,收