血管活性肠肽真核表达质粒的构建及鉴定

目的:构建一种具有生物学活性的血管活性肠肽(VIP)的真核表达质粒.方法:利用RT-PCR从小鼠胸腺淋巴细胞中克隆有信号肽序列的VIP cDNA,插入真核表达载体pcDNA3.1,构建含VIP的重组质粒pcDNA3.1-VIP,转染COS-7细胞,用ELISA和Western blot鉴定表达的蛋白,细胞因子释放抑制法测定生物学活性.结果:经酶切和基因测序证实,克隆的基因片段为带有信号肽序列的VIP基因;经转染的COS-7细胞表达VIP蛋白,并能有效地抑制巨噬细胞的TNF-α释放.结论:成功构建了能够表达具有生物学活性的真核表达质粒pcDNA3.1-VIP.     

小鼠胰岛素样生长因子-1基因体外克隆及表达的研究

目的 探讨小鼠胰岛素样生长因子-1(IGF-1)基因提取、鉴定及重组质粒转染COS-7细胞表达.方法 通过RT-PCR获取小鼠骨骼肌IGF-1的cDNA,将该基因亚克隆入重组质粒p1 (pcDNA3.1-Nestin-EGFP)中,构建重组质粒p2 (pcDNA3.1-Nestin-EGFP- IGF-1),脂质体转染COS-7细胞,ELISA检测细胞培养基中IGF-1蛋白量.结果 克隆IGF-1基因cDNA与GenBank中该基因序列一致,重组质粒转染COS-7细胞培养基中均含有IGF-1蛋白.结论 IGF-1基因成功构建到重组质粒p2中,且能在COS-7细胞中过表达.     

大鼠SOCS-3基因真核表达载体的构建

目的:构建大鼠的细胞因子信号转导抑制因子-3(SOCS-3)真核表达载体,为慢性肝损伤建立相应的基因治疗途径提供基础。方法:从大鼠的肝脏中提取总RNA,通过RT-PCR法获得大鼠SOCS-3基因,将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1,构建重组质粒pcDNA3.1-SOCS-3,并进行酶切鉴定和测序分析。结果:通过RT-PCR法克隆大鼠SOCS-3基因为696bp,与目的基因大小片段一致,经酶切鉴定及测序证实大鼠SOCS-3真核表达载体与设计完全一致。结论:成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-SOCS-3,为进一步研究其在慢性肝损伤中的作用及基因治疗提供基础。     

突变型MYOC基因真核表达质粒的构建及在COS-7细胞中表达

目的构建Pro370Leu突变型MYOC基因真核表达质粒pcDNA3.1/myc-His（-）mMYOC,并在COS-7细胞中表达Pro370Leu突变型MYOC蛋白。方法以pGEM-T-MYOC质粒中MYOC为模板,用PCR介导的定点突变技术,得到Pro370Leu突变型MYOC基因（mMYOC）,并定向亚克隆到真核表达质粒pcDNA3.1/myc-His（-）B上,得到pcDNA3.1/myc-His（-）mMYOC重组表达质粒,再用限制性内切酶消化和DNA测序鉴定,最后用脂质体包埋转染法转染COS-7细胞,用特异性引物对转染的COS-7细胞的总RNA进行RT-PCR扩增,检测mMYOC基因表达,用抗标签基因His表达产物的特异性抗体,进行Western blot法检测蛋白分泌情况。结果经酶切和DNA序列测定,证实重组质粒构建成功,mMYOC基因能在COS-7细胞中表达,并且mMYOC蛋白不能分泌到培养液中。结论成功构建Pro370Leu突变型MYOC基因真核表达质粒pcDNA3.1/myc-His（-）mMYOC,mMYOC蛋白不能分泌到细胞外。     

肺炎链球菌CbpA基因疫苗的构建及免疫学特性

目的：构建含有肺炎链球菌（SPN）毒力因子CbpA抗原编码基因的重组质粒pcDNA3.1/CbpA,测定其诱导特异性免疫应答的能力并评价其保护效果.方法：PCR扩增SPN CbpA编码基因,将该编码基因克隆到pcDNA3.1（＋）真核表达载体中,构建pcDNA3.1/CbpA重组质粒,经测序鉴定后转染COS-7细胞,WesternBlot鉴定目的蛋白的表达,重组质粒免疫BALB/c小鼠,TIGR4型SPN攻击后,监测其生存时间.结果：CbpA能在COS-7细胞中表达;pcDNA3.1/CbpA重组质粒主动免疫BALB/C小鼠后,体内产生特异性IgG抗体,并诱导小鼠对SPN感染产生有效的保护.结论：成功构建了重组真核表达质粒pcDNA3.1/CbpA,可为SPN基因疫苗的研制提供依据.     

重组CD200基因在COS-7细胞中的瞬时表达

目的研究构建于重组真核表达载体pcDNA3-CD200上的CD200基因在COS-7细胞中的瞬时表达。方法体外扩增并酶切鉴定pcDNA3-CD200质粒；常规方法培养COS-7细胞；用电转染基因法将pcDNA3-CD200质粒转入COS-7细胞中，用流式细胞术（FCM）检测转染细胞CD200表达。结果转染COS-7细胞后72h，CD200基因表达阳性的细胞计数率为44．5％。结论成功的利用电转染基因法将重组真核表达载体pcDNA3-CD200转染到COS-7细胞中，并实现了在COS-7细胞中的瞬时表达，为进一步研究CD200的生物学活性以及信号传导奠定了基础。     

人CIDE3基因克隆和真核表达载体构建及促凋亡作用的研究

目的：克隆人诱导细胞死亡的DFF45样效应因子3（CIDE3）全长基因,构建真核表达质粒pcDNA3.1（＋）-CIDE3,并检测其促凋亡作用.方法：①提取人腹部皮下白色脂肪组织的总RNA,经RT-PCR获得CIDE3全长基因,克隆入真核表达载体pcDNA3.1（＋）,构建重组质粒pcDNA3.1（＋）-CIDE3,并进行序列测定.②用脂质体法将pcDNA3.1（＋）-CIDE3转染人宫颈癌细胞系HeLa细胞,通过TUNEL法检测细胞凋亡情况.结果：①经RT-PCR扩增得到特异性717 bp的目的片段,构建的重组质粒pcDNA3.1（＋）-CIDE3经序列测定,结果与Genbank发表的序列完全一致.②转染Hela细胞后,经Tunel染色法检测发现,转染pcDNA3.1（＋）-CIDE3后有大约25%的细胞发生了凋亡,与转染空质粒pcDNA3.1（＋）（＜5%）及未转染质粒的细胞相比,其凋亡细胞明显增多.结论：成功克隆了人CIDE3全长基因,构建了真核表达质粒pcDNA3.1（＋）-CIDE3,并验证了CIDE3基因可诱导细胞发生凋亡的生物学作用,为进一步研究CIDE3的生物学功能奠定了坚实基础.     

人cbl 基因真核表达载体的构建及表达

目的: 构建带有flag标签的人cbl 基因真核表达载体,并检测其在真核细胞中的表达.方法: 以含有人全长cbl cDNA的质粒pEFHAcbl 为模板,采用PCR方法扩增cbl基因,并在其N-末端带上含24 bp的flag标签,克隆到pGEM-T easy载体并测序,再亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1( ),酶切鉴定正确后采用脂质体法瞬时转染COS-7细胞,Western blot检测flag-cbl在细胞中的表达. 结果: 测序证实以pEFHAcbl 为模板获得的flag-cbl融合基因的序列以及读框全部正确;重组质粒pcDNA3.1( )-flag-cbl经酶切后产生与理论预期长度相符的片段;脂质体法转染COS-7后检测到预期目的蛋白的表达.结论: 成功构建了N-末端带flag标签的cbl真核表达载体,并使其在真核细胞COS-7中表达.     

WISP3基因突变体的构建及在COS-7细胞中的表达

目的:通过构建晚发型脊柱骨骺发育不良伴进行性骨关节病(spondyloepiphyseal dysplasia tarda with progressive arthropathy,SEDT-PA)致病型(1000T/C,840 delT)Wnt诱导分泌蛋白3(wnt-inducible secreted protein 3,WISP3)的真核表达载体,并将其表达于真核表达系统COS-7细胞系,为研究WISP3突变致SEDT-PA的机制奠定基础.方法:从正常人软骨细胞获得野生型WISP3基因的全长cDNA(WT-WISP3):用定点突变方法构建携带WISP3基因致病型的重组真核表达质粒MUT1000T/C/pcDNA3.1( )和MUT840delT/pcDNA3.1( );以空白载体pcDNA3.1( )为对照,脂质体转染法将重组质粒瞬时转染COS-7细胞,48 h后提取转染细胞的总RNA和总蛋白;半定量RT-PCR和免疫印迹方法检测WISP3基因的表达.结果:经测序证实,构建的野生型和突变型WISP3基因的全长cDNA序列分别与文献及前期报道的SEDT-PA患者WISP3基因突变类型一致;酶切鉴定证实,成功构建了3个重组真核表达质粒[WT-WISP3/pcDNA3.1( ),MUT1000T/C/pcDNA3.1( )及MUT840delT/pcDNA3.1( )];半定量RT-PCR和免疫印迹示,重组质粒在COS-7细胞中均高效表达.结论:成功构建了SEDT-PA致病基因WISP3的突变体并在COS-7细胞中得到表达,为进一步探讨SEDT-PA的发病机制创造了条件.     

野生型MLK3真核表达载体的构建及其表达

目的构建野生型MLK3真核表达质粒并转染至COS-7细胞中表达。方法以大鼠海马总RNA为模板,通过RT-PCR分段扩增MLK3的序列,采用酶切、链接的方法先将目的基因克隆至pGEM-T,筛选正确的质粒后,再亚克隆至pcDNA3.1（＋）。以脂质体转染法将构建好的重组质粒转染至COS-7细胞,通过免疫印迹鉴定重组质粒的表达。结果限制性内切酶酶切和测序结果表明,扩增出的野生型MLK3的序列正确。免疫印迹显示,转染的重组质粒在相对分子质量92×103处有相应条带出现。结论成功构建了MLK3的真核表达质粒,重组质粒在COS-7细胞中高效表达。     

人Fn14基因真核重组质粒的构建及其表达

目的构建人成纤维细胞生长因子诱导早期反应蛋白14（fibroblast growth factor—inducible 14，Fn14）基因真核重组质粒及其表达。方法从人肝细胞癌组织抽取总RNA，RT—PCR扩增出Fn14基因全长cDNA，经测序正确后，核酸内切酶EcoR I、Xba I酶切PCR产物，亚克隆人pcDNA3．1-Myc载体，重组质粒pcDNA3．1-Myc—Fn14经酶切及测序鉴定正确后转染COS-7细胞，通过免疫组织化学DAB法检测Myc—Fn14融合蛋白的表达。结果重组质粒pcDNA3．1-Myc—Fn14经EcoR I、Xba I酶切及测序鉴定正确，重组质粒包含人Fn14基因完整编码区。免疫组织化学检测结果显示，重组质粒转染COS-7细胞后成功表达Myc—Fn14融合蛋白，转染空载体pcD—NA3．1-Myc的COS-7细胞未见Myc—Fn14融合蛋白表达。结论构建了人Fn14基因真核表达载体，该重组质粒可表达含Myc-Fn14的融合蛋白，为研究Fn14功能奠定了基础。     

Construction and identification of eukaryotic eukaryotic expression plasmid pcdna3.1-bace and its transient expression in cells

Objective： To generate eukaryotic expression vector of pcDNA3.1-BACE and obtain its transient expression in COS-7 cells and high expression in the neuroblastoma SK-N-SH cells. Methods： A 1503 bp cDNA fragment was amplified from the total RNA of human neuroblastoma by RT-PCR method and cloned into plasmid pcDNA3.1. The vector was identified by digestion with restriction enzymes BamHI and XhoI and sequenced by Sanger-dideoxy：mediated chain termination. The expression of BACE gene was detected by immunocytochemistry method. Results： The results showed that the cDNA fragment included 1503 bp total coding region. The recombinant eukaryotic cell expression vector of pcDNA3.1-BACE was constructed successfully, and the sequence of insert was identical to the published sequence. The COS-7 cells and the neuroblastoma SK-N-SH cells transfected with the pcDNA3.1-BACE plasmid expressed high level of BACE protein in cytoplasm. Conclusion： The recombinant plasmid pcDNA3.1-BACE can provide very useful tool for researching the mason of Alzheimer＇s disease and lays the important foundation for preventing the AD laterly.     

真核表达载体pcDNA3-FHIT的构建及其在COS-1细胞中瞬时表达

目的 :构建FHIT基因的真核表达载体及测定其在COS 1细胞中的瞬时表达。方法 :应用RT PCR方法从正常人甲状腺组织中克隆出FHIT基因 ,在KpnⅠ和 BstXⅠ两个酶切位点插入真核表达载体 pcDNA3中 ,通过酶切分析、基因测序和免疫细胞化学方法鉴定插入基因片段的正确性。结果 :FHIT基因在载体 pcDNA3中插入的位点是正确的 ,没有缺失、插入等突变 ,并在COS 1细胞中有较高的瞬时表达。结论 :成功构建了FHIT基因的真核表达载体 ,并获得其在COS 1细胞中较高的瞬时表达 ,为该基因在基因治疗中的研究提供了有力的分子工具     

人宫颈癌Ca Ski 细胞 IL-24基因的克隆鉴定与真核表达

目的:克隆人IL-24基因并构建真核表达载体,转染Ca Ski细胞进行真核表达.方法:利用RT-PCR技术扩增出Ca Ski细胞中的IL-24基因.将IL-24基因克隆人pcDN3.1( )中,构建真核表达质粒pcDN3.1( )-hIL-24的表达.结果:PCR及测字结果均证实在功克隆了人IL-24,该质粒被转染人Ca Ski细胞中能表达出hIL-24蛋白.结论:成功构建了hIL-24基因的真核表达载体.     

海人藻酸受体亚基GluR6真核表达载体的构建及其表达

目的构建海人藻酸受体亚基GluR6的真核细胞表达载体,并在COS-7细胞中表达。方法根据GenBank数据库中GluR6的cDNA序列（Z11548）,分3段分别设计并合成3对引物。从大鼠海马组织中提取总RNA,采用RT-PCR方法获得目的基因片段,分别克隆至pGEM-T载体中。经测序确证后,将该3段cDNA片段依次与pcDNA3.1（＋）载体定向连接。将鉴定正确的重组体以脂质体法转染至COS-7细胞中,免疫印迹法检测GluR6蛋白质表达水平。结果克隆了GluR6的cDNA,并构建了其真核表达载体GluR6-pcDNA3.1,经限制性内切酶酶切鉴定及测序分析证实了其序列的正确性;免疫印迹分析显示,GluR6在COS-7细胞中表达水平较高。结论成功构建GluR6-pcDNA3.1真核表达载体,并且在COS-7细胞中得到高效表达。     

BC023882基因克隆及其对细胞周期的影响

目的获得基因BC023882全长真核表达载体及检测该基因对培养细胞生长的影响.方法利用逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)扩增基因BC023882的编码区序列,克隆到pcDNA3.1(-)/Myc-His( )/lac Z真核表达载体中,构建基因BC023882的真核表达载体;脂质体法转染小鼠胚胎成纤维细胞和COS-7细胞,并且通过细胞生长曲线测定和流式细胞仪观察该基因对细胞生长的影响.结果酶切并测序鉴定证明获得的重组子符合基因BC023882的编码序列;转染该基因后细胞增殖减慢,细胞增殖指数减低.结论成功构建了基因BC023882的真核表达载体,并且观察到该基因对细胞生长起到一定的抑制作用.