吉西他滨对放射相关DNA损伤修复的影响

目的研究吉西他滨（GEM）在体外对胰腺癌细胞的放疗增敏作用及机制。方法体外培养胰腺癌Pancl细胞株,将其分为空白对照组、单纯照射组、吉西他滨组及吉西他滨联合放疗组（联合放疗组）。采用源皮距（SSD）为100cm,剂量2、4和6Gy的4MV—X线进行细胞照射;运用MTT实验方法选出细胞生长抑制率≤10％的药物浓度（IC10）,即GEM的最佳实验浓度;克隆形成实验观察空白对照组、GEM组、单纯放疗组及联合放疗组胰腺癌细胞Pancl体外增殖情况。流式细胞仪分析上述各组细胞的细胞周期和凋亡改变。免疫印迹法分别检测空白对照组、GEM组、单纯放疗组及联合放疗组DNA损伤以及损伤修复指标ν-H2AX、Rad51、Ku80及p-ATM蛋白的表达。结果GEM在体外具有放射增敏作用。MTT结果显示,GEM在0．04～0．06μmol／L之间为最佳实验浓度。射线照射后,GEM能显著降低胰腺癌细胞的克隆形成能力,即增殖能力。凋亡结果显示,与GEM组及单独放疗组比较,联合放疗组Pancl细胞的凋亡数明显增加,其凋亡率差异有统计学意义（P＜0．05）;细胞周期检测结果表明,GEM作用于胰腺癌细胞后,S期细胞水平明显升高。胰腺癌细胞DNA损伤指标ν-H2AX蛋白表达水平在GEM组,单纯放疗组及联合放疗组均增加,联合放疗组较GEM组有进一步升高。与空白对照组、单纯照射组、GEM组比较,联合放疗纽胰腺癌细胞中DNA损伤修复指标Rad51、Ku80及p-ATM蛋白的表达均降低。结论GEM对胰腺癌放射治疗有增敏作用。其机制涉及诱导细胞凋亡,改变Pancl细胞生长周期,并通过抑制射线照射后胰腺癌细胞DNA损伤修复,间接对胰腺癌的放疗起增敏作用。     

普伐他汀对人胰腺癌细胞SW1990的影响及其协同吉西他滨的抑瘤作用

目的研究普伐他汀(pravastatin,Pra)对人胰腺癌细胞SW1990增殖和凋亡的影响及其联合吉西他滨(gemcitabine,GEM)对该细胞的作用。方法MTT比色法测定普伐他汀对SW1990细胞生长的抑制作用。不同浓度普伐他汀处理细胞48 h后,流式细胞仪测定细胞凋亡率,光学显微镜下观察细胞形态学改变。吉西他滨、普伐他汀联合吉西他滨作用细胞48 h,MTT法测定各处理组的OD值,并计算相互作用指数。结果 MTT比色法显示普伐他汀对SW1990细胞具有抑制增殖的作用,5、15、25μmol/L普伐他汀处理SW1990细胞后,SW1990细胞出现典型的形态学改变,且凋亡百分率随浓度增大而逐渐增加。普伐他汀联合吉西他滨作用细胞后,GEM的IC50值降低。结论普伐他汀具有抑制胰腺癌细胞SW1990增殖和诱导该细胞凋亡的作用,普伐他汀联合吉西他滨对SW1990细胞具有协同抗瘤作用。     

托瑞米芬联合吉西他滨对肺癌细胞株A549生长和凋亡的影响

目的研究托瑞米芬(TOR)联合吉西他滨(GEM)对人肺癌株A549的影响,为肺癌的临床治疗提供新的方向。方法用MTT比色法检测各组药物对细胞生长的抑制作用,用HE染色观察用药后细胞形态,用细胞凋亡试剂盒检测细胞凋亡率。结果托瑞米芬能直接抑制肺腺癌细胞A549的生长,低剂量托瑞米芬(5、10μmol/L)与吉西他滨联用后的抑制率较单用吉西他滨明显提高,并且随药物浓度增高而增高。联合用药组较单用化疗药物组凋亡率提高,而单用托瑞米芬对细胞的凋亡率与对照组比无明显变化。结论托瑞米芬可抑制肺腺癌细胞A549的生长,但不能直接促进细胞凋亡;托瑞米芬与吉西他滨有明显的协同作用。     

吉西他滨对人舌鳞癌Tca8113 细胞的 放射增敏作用及其机制研究

目的 研究吉西他滨（GEM）对人舌鳞癌Tca8113 细胞的放射增敏作用及其相关机制。 方法 用不同浓度GEM 处理人舌鳞癌Tca8113 细胞24 h，测定细胞存活率并确定后续实验浓度。对Tca8113 细胞进行单独放疗或联合GEM 处理，MTT 法测定细胞存活率；平板克隆形成实验研究各组细胞集落形成 的能力；流式细胞术验证Tca8113 细胞对放射的敏感性变化。Western blotting 检测Bcl-2、Bax、 Cleaved Caspase-3 及Cleaved Caspase-9 蛋白的表达。结果 不同浓度GEM 作用时的细胞存活率比较，经方差分析， 差异有统计学意义（P <0.05）。与0.00μmol/L 组比较，GEM 浓度为0.01、0.02、0.03、0.10 及1.00μmol/L 时细胞存活率降低（P <0.05）。照射剂量为4 Gy 时，与单纯放疗组比较，GEM 联合放疗组细胞存活率降低 （P <0.05）。克隆形成实验显示，GEM 联合放疗组集落形成能力最弱（P <0.05）；流式细胞术进一步证实， GEM 联合放疗组较单纯放疗组凋亡率升高（P <0.05）。GEM 联合放疗组Tca8113 细胞凋亡高于其他各组，且 Tca8113 细胞中Bax、Cleaved Caspase-3 及Cleaved Caspase-9 蛋白表达水平高于其他组（P <0.05）；而Bcl-2 蛋白表达则低于其他各组（P <0.05）。结论 GEM 对舌鳞癌Tca8113 细胞的增殖有抑制作用，联合放射治疗 能有效提高放射敏感性；两者可能具有协同抗肿瘤作用。     

托瑞米芬联合吉西他滨对肺癌细胞株A549 生长和凋亡的影响

目的研究托瑞米芬（TOR）联合吉西他滨（GEM）对人肺癌株A549的影响，为肺癌的临床治疗提供新的方向。方法用MTT比色法检测各组药物对细胞生长的抑制作用，用HE染色观察用药后细胞形态，用细胞凋亡试剂盒检测细胞凋亡率。结果托瑞米芬能直接抑制肺腺癌细胞A549的生长，低剂量托瑞米芬（5、10μmol／L）与吉西他滨联用后的抑制率较单用吉西他滨明显提高，并且随药物浓度增高而增高。联合用药组较单用化疗药物组凋亡率提高，而单用托瑞米芬对细胞的凋亡率与对照组比无明显变化。结论托瑞米芬可抑制肺腺癌细胞A549的生长，但不能直接促进细胞凋亡；托瑞米芬与吉西他滨有明显的协同作用。     

多西紫杉醇对非小细胞肺癌细胞株A-549放疗增敏作用及机制

目的:研究多西紫杉醇对体外培养非小细胞肺癌细胞的细胞周期改变和凋亡影响,及其放疗增敏的作用及机制.方法:以非小细胞肺癌细胞株A-549为实验对象,MTT法观察多西紫杉醇对A-549细胞增殖抑制;克隆形成实验分析细胞放射敏感性;流式细胞技术检测细胞周期及凋亡率.结果:多西紫杉醇对A-549细胞有生长抑制作用,且呈剂量依赖性,在较低浓度(1μg/ml)时即可降低A-549细胞的克隆形成率.各处理组细胞的细胞周期和凋亡率结果表明,多西紫杉醇+放疗组G2/M期细胞比例较其他组明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);细胞凋亡率差异亦有统计学意义(P<0.05).结论:多两紫杉醇在低细胞毒性浓度下对非小细胞肺癌细胞株A-549有放射增敏作用;多西紫杉醇对A-549细胞增敏其机制可能与其能改变细胞生长周期并诱导其凋亡有关.     

顺铂耐药卵巢癌细胞化疗敏感性实验

【目的】 研究顺铂(DDP)。洛铂(LBP)。紫杉醇(PTX)。吉西他滨(GEM)对卵巢癌SKOV3细胞及顺铂耐药SKOV3 /DDP细胞增殖的影响。【方法】 培养基中不含药物的处理组为对照组,加入不同浓度化疗药物的处理组为实验组。在相差显微镜下观察细胞形态变化;用MTT法测定单药应用。双药联合使用对两种细胞生长的影响;流式细胞仪分析细胞周期和凋亡率的变化。【结果】 SKOV3∕DDP细胞耐药指数为7.10 ± 2.19。紫杉醇。洛铂。吉西他滨对两种细胞的抑制率无明显差别。洛铂。紫杉醇。吉西他滨两药联合组与相应单一用药组相比,能显著抑制肿瘤细胞的生长,其中吉西他滨 + 洛铂及紫杉醇 + 洛铂组抑制率明显增高。相同浓度顺铂作用48 h后,SKOV3/DDP细胞的凋亡率低于SKOV3细胞。洛铂。紫杉醇。吉西他滨作用两种细胞48 h后,细胞凋亡率差异无统计学意义。顺铂。洛铂与紫杉醇。吉西他滨主要作用于不同的细胞周期。【结论】 SKOV3/DDP细胞对紫杉醇。洛铂。吉西他滨无交叉耐药。联合用药有高效协同抑制细胞生长作用,临床治疗卵巢癌顺铂耐药患者可考虑选择吉西他滨 + 洛铂。紫杉醇 + 洛铂联合化疗。     

维生素K3增强吉西他滨诱导人膀胱癌T24细胞凋亡的研究

目的 探讨维生素K3(VK3)是否能影响吉西他滨诱导人膀胱癌T24细胞凋亡.方法 用噻唑蓝(MTr)法筛选出吉西他滨作用T24细胞72 h后的适宜作用浓度,再用该浓度联合不同浓度的VK3(2,5,10,20 μnol/L)筛选出作用72 h后的适宜联合用药浓度.分为三组:空白对照组,吉西他滨组,药物联用组.用PI流式细胞术观察各组细胞凋亡情况,并通过流式软件分析细胞周期变化.结果 MTT法筛选出吉西他滨与VK3的适宜药物浓度分别是1.0 μg,/ml和10 μmol/L.药物联用组与吉西他滨组相比,可显著提高细胞抑制率和细胞凋亡率(均P<0.05).VK3可显著增强吉西他滨诱导细胞集中于S期的作用.结论 联用维生素K3可增强吉西他滨诱导人膀胱癌T24细胞凋亡的作用,可能与细胞周期s期阻滞增高有关.     

顺铂耐药卵巢癌细胞化疗敏感性实验

【目的】研究顺铂（DDP）、洛铂（LBP）、紫杉醇（PTX）、吉西他滨（GEM）对卵巢癌SKOV3细胞及顺铂耐药SKOV3/DDP细胞增殖的影响。【方法】培养基中不含药物的处理组为对照组,加入不同浓度化疗药物的处理组为实验组。在相差显微镜下观察细胞形态变化;用MTT法测定单药应用、双药联合使用对两种细胞生长的影响;流式细胞仪分析细胞周期和凋亡率的变化。【结果】SKOV3∕DDP细胞耐药指数为7.10&#177;2.19。紫杉醇、洛铂、吉西他滨对两种细胞的抑制率无明显差别。洛铂、紫杉醇、吉西他滨两药联合组与相应单一用药组相比,能显著抑制肿瘤细胞的生长,其中吉西他滨＋洛铂及紫杉醇＋洛铂组抑制率明显增高。相同浓度顺铂作用48h后,SKOV3/DDP细胞的凋亡率低于SKOV3细胞。洛铂、紫杉醇、吉西他滨作用两种细胞48h后,细胞凋亡率差异无统计学意义。顺铂、洛铂与紫杉醇、吉西他滨主要作用于不同的细胞周期。【结论】SKOV3/DDP细胞对紫杉醇、洛铂、吉西他滨无交叉耐药。联合用药有高效协同抑制细胞生长作用,临床治疗卵巢癌顺铂耐药患者可考虑选择吉西他滨＋洛铂、紫杉醇＋洛铂联合化疗。     

FTY720联合吉西他滨对非小细胞肺癌肿瘤相关细胞株增殖和凋亡作用的研究

目的 探讨FTY720与吉西他滨用药对人非小细胞肺癌(NSCLC)肿瘤细胞株A549和H520增殖和凋亡的影响作用.方法 分别选取0、2、4、6、8、10 μmol/L浓度的FTY720对体外培养得到NSCLC细胞株A549及H520做干预影响,于培养24、48、72 h后分别检测吸光度值,观察各浓度条件下FTY720对A549及H520的抑增殖作用;对A549及H520细胞株加分别单独加7 μmol/L FTY720和0.2 μmol/L吉西他滨及37 μmol/L FTY720结合0.2μmol/L吉西他滨,观察各组细胞培养48 h后抑制和凋亡差异.结果 不同浓度FTY270抑制NSCLC细胞株A549、H520增殖,差异有统计学意义(P＜0.05),FTY720对NSCLC细胞株A549、H520的增殖抑制作用和浓度、时间具有相关性,FTY720联合吉西他滨抑制A549、H520细胞和凋亡率显著强于两种药品的单独使用(P＜0.05).结论 FTY720联合吉西他滨可显著抑制人NSCLC细胞株A549及H520的增殖,并可有效促进癌细胞凋亡的作用,临床价值较高.     

放疗联合TK/GCV自杀基因系统对肺腺癌细胞凋亡活性的影响

目的研究放疗联合高效表达的胸苷激酶/丙氧鸟苷(TK/GCV)自杀基因系统对人肺腺癌细胞株A549细胞凋亡活性的影响,探寻肺腺癌放化疗联合治疗的新途径。方法利用前期研究成功构建的可调控自杀基因TK高效表达的pfos-iNOS/TK治疗载体转染A549细胞筛选阳性克隆。将阳性转染细胞(转染治疗载体组)和未转染的对照细胞(未转染组)分别给予2 Gy的X射线照射和10μmol/L、1000μmol/L的GCV。荧光显微镜观察细胞凋亡情况,检测各组细胞的凋亡率。结果给予10μmol/L、1000μmol/L的GCV作用后,治疗载体组凋亡率高于未转染(P<0.05);X射线照射联合GCV作用后,转染治疗载体组大量细胞发生凋亡,而未转染组仅有少量细胞发生凋亡(P<0.01)。结论放疗联合高效表达的TK/GCV自杀基因系统显著提高了对肺腺癌细胞的杀伤作用,为肺癌治疗带来了新的希望。     

姜黄素与顺铂联合对人肺腺癌A549细胞增殖和凋亡作用

目的:研究姜黄素、顺铂和两者联合应用对人肺癌A549细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响。方法:采用MTT法观察姜黄素和顺铂对人肺癌A549细胞增殖的影响;采用流式细胞仪检测姜黄素、顺铂和两者联合应用对人肺癌A549凋亡和细胞周期的影响。结果:①姜黄素及顺铂能抑制人肺腺癌A549细胞的增殖,并呈浓度及时问依赖性;姜黄素10,15,20μmol/L分别与顺铂1,2 mg/L联合24,48,72 h的抑制率显著高于单用顺铂、姜黄素组(均为P<0.05),两者呈现出相加的抗瘤效果。②姜黄素和顺铂均可在一定程度上诱导细胞凋亡,并且凋亡率与浓度呈正相关。两种药物联用后,诱导细胞凋亡作用显著增强。③姜黄素将细胞周期阻滞在G2/M期(P<0.01),顺铂将细胞周期阻滞在S期(P<0.01)。结论:姜黄素、顺铂均可抑制人肺癌A549细胞的增殖、诱导细胞的凋亡,在一定浓度范围内,呈量-效关系,而且两者联合应用具有相加或协同作用。     

MicroRNA-204 在非小细胞肺癌患者组织中的表达及对癌细胞增殖和凋亡的影响

目的 观察microRNA-204（miR-204）在非小细胞肺癌（NSCLC）患者体内的表达水平及对癌细胞增殖的影响,探讨miR-204 在非小细胞肺癌中的临床意义及可能分子机制。方法 实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测miR-204 在肺癌及癌旁组织中的表达情况;用化学合成的miR-204 模拟物和抑制物转染人非小细胞肺癌A-549 肺癌细胞,CCK-8 法检测细胞增殖的情况,流式检测细胞凋亡情况,qRT-PCR、Western blot 法分别检测Bcl-2 的mRNA 和蛋白表达。结果 miR-204 在肺癌组织中表达水平与对应癌旁组织比较,差异有统计学意义（P <0.05）,肺癌组织低于癌旁组织;肺癌组织中miR-204 低表达与分期、肿瘤大小、肿瘤淋巴结转移相关（P <0.05）;miR-204 可抑制A-549 细胞的增殖,促进细胞凋亡,并下调Bcl-2 的mRNA 与蛋白表达水平。结论 miR-204 在非小细胞肺癌组织中表达下调并与肺癌恶性临床病理特征有关,miR-204 可能通过调节Bcl-2 的表达从而影响非小细胞肺癌细胞的增殖及凋亡。     

三氧化二砷逆转A549细胞对TRAIL耐药的研究

目的探讨三氧化二砷(As2O3)逆转人非小细胞肺癌A549细胞对肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)耐药的机制。方法将处于对数生长期的A549细胞分为对照组(仅加入DMEM)及实验组,实验组又分为As2O3组(1μmol/LAs2O3处理)、TRAIL组(100μg/L TRAIL处理)及联合组(1μmol/L As2O3、100μg/L TRAIL联合处理)。采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测细胞增殖;流式细胞仪检测细胞凋亡;用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测A549细胞核因子kappa B(NF-κB)、caspase-3、survivin mRNA的表达。结果作用24、48、72h后,联合组A549细胞的增殖抑制明显增强(P<0.05),且呈时间依赖性。As2O3、TRAIL联合作用48h可明显下调NF-κB、survivin mRNA,上调caspase-3mRNA的表达。结论 As2O3通过NF-κB通路下调survivin,上调caspase-3,从而增强TRAIL诱导A549细胞的凋亡。     

含神经纤毛蛋白-1靶向序列的细胞穿透肽的合成及其与非小细胞肺癌的特异性结合研究

目的 设计一类具有C末端基序的新型肿瘤穿透肽YCCS,并检测其对非小细胞肺癌的靶向结合能力。方法 设计了融合肺癌靶向肽段CS及神经纤毛蛋白-1靶向肽段CRMP-1的新型多肽YCCS,采用Fmoc固相合成法合成多肽,并在多肽上标记荧光素FITC,以神经纤毛蛋白-1阳性的非小细胞肺癌A549、人乳腺癌MDA-MB-231,以及神经纤毛蛋白-1阴性的正常人肺成纤维细胞HBE135-E6E7、正常人肝细胞HL-7702为研究对象,观察荧光标记的多肽与A549细胞的特异性结合能力。结果 成功设计并合成了肿瘤穿透肽FITC-YCCS用于细胞结合研究,荧光细胞结合实验证实,在5 μmol/L浓度下,YCCS多肽能特异性的与非小细胞肺癌A549结合,而基本不与乳腺癌细胞及正常细胞结合。随多肽浓度升高,在20 μmol/L浓度下,YCCS多肽与乳腺癌细胞MDA-MB-231和肝细胞HL-7702出现少量结合。结论 本研究设计的肿瘤穿透肽YCCS在5 μmol/L浓度下,可检测到对非小细胞肺癌A549具有特异性结合能力。     

结核分枝杆菌RelE毒素蛋白对肺癌A-549细胞的生长抑制作用

目的探索结核分枝杆菌RelE毒素蛋白是否对肺癌A-549细胞有生长抑制作用。方法采用PCR技术克隆结核分枝杆菌RelE、RelB、RelBE基因,分别构建真核质粒PcDNA3.1-RelE、PcDNA3.1-RelB和PcDNA3.1-RelBE。经酶切分析和DNA测序证实重组质粒构建成功后,采用脂质体转染方法分别转入肺癌A-549细胞,经RT-PCR鉴定后,建立稳定表达相关蛋白的细胞株。通过细胞生长曲线、活细胞蛋白含量测定、MTT细胞增殖实验、HE染色观察细胞凋亡、流式细胞术检测瞬时转染细胞的凋亡率等,观察结核分枝杆菌RelE毒素蛋白是否对肺癌A-549细胞具有生长抑制和促凋亡的作用。结果结核分枝杆菌RelE毒素蛋白组的肺癌A-549细胞增殖速度低于其他各组,对营养缺乏更为敏感,相同范围视野下凋亡细胞多于其他各组,瞬时转染细胞的凋亡率也高于其他组(P<0.05)。结论结核分枝杆菌RelE毒素蛋白对肺癌A-549细胞具有生长抑制和促凋亡的作用。     

得力生诱导肺癌细胞株A549细胞凋亡及其对survivin基因表达的影响

目的探讨中成药得力生诱导肺癌细胞株A549细胞凋亡及其对survivin基因表达的影响。方法采用MTT法测定细胞增殖抑制率,在显微镜下观察细胞凋亡的形态特点,应用流式细胞仪检测细胞凋亡率,采用逆转录聚合酶连反应（RT—PCR）法测定survivin mRNA的表达。结果（1）得力生在4mL／L-100mL／L浓度范围内可抑制A549细胞增殖,此作用与药物体积浓度无明显相关关系,但该作用具有时间依赖性（r=0．991,P=0．001）。（2）20mL／L浓度的得力生在体外可诱导A549细胞凋亡,且其作用具有时间依赖性（r=0．997,P=0．049）。（3）RT—PCR结果显示,得力生可明显抑制A549细胞中表达survivin,与对照组相比,差异具有统计学意义（r=4．333,P〈0．05）。结论得力生可抑制A549细胞增殖,诱导A549细胞凋亡,其作用机制可能与抑制survivin基因表达有关。     

MicroRNA 122促进吉西他滨对体外非小细胞肺癌细胞系A549的杀伤作用

目的 探讨microRNA 122（miRNA122）对细胞毒性化疗药吉西他滨对体外杀伤非小细胞肺癌细胞株的影响.方法 利用脂质体转染miRNA122的表达载体;CCK-8测定系列浓度梯度吉西他滨检测对非小细胞肺癌细胞株A549的抑制率,计算IC50值;平板克隆实验检测吉西他滨对A549细胞杀伤的影响;流式细胞仪-Annexin/PI双染实验检测吉西他滨诱导A549细胞凋亡率.结果 吉西他滨对A549细胞具有明显地体外杀伤作用,其IC50值为（78.65±5.25）nmol/L,转染miRNA122能够上调吉西他滨的活性,其IC50值为（10.26±1.18）nmol/L;流式细胞术结果显示：A549细胞凋亡率诱导转染空载体组为26.24％±1.94％,诱导转染miRNA122组为63.30％±3.96％.miRNA122能够显著上调吉西他滨诱导A549细胞凋亡率.RT-PCR和蛋白印迹实验表明,转染miRNA122能够显著上调A549细胞内miRNA122的表达水平,降低miRNA122靶基因和调控基因的表达水平.结论 miRNA122能够上调吉西他滨对非小细胞肺癌细胞系A549的体外杀伤作用.