小鼠囊胚体外植入恶性肿瘤细胞和容受性子宫内膜上皮细胞的比较性研究

目的 在已建立的小鼠囊胚-恶性肿瘤细胞体外共培养的基础上,将小鼠囊胚体外植入恶性肿瘤细胞的生物学行为和小鼠囊胚植入单层容受性子宫内膜上皮细胞的生物学行为进行比较性研究。方法 采用体外小鼠囊胚-恶性肿瘤细胞共培养体系和改进的小鼠囊胚-单层容受性子宫内膜上皮细胞共培养体系,光镜下观察小鼠囊胚在单层恶性肿瘤细胞和容受性子宫内膜上皮细胞贴壁、脱带、粘附及植入过程,HE染色,扫描电镜观察和免疫组织化学对两系统中囊胚植入的生物学行为进行比较性研究。结果 小鼠囊胚在恶性肿瘤细胞Hepal-6、CHO和B16共培养系统中的脱带率、贴附率和扩展率分别是69．74％、81．49％、90．15％;68．63％、79．86％、90．32％和68．94％、80．21％、89．53％。容受性子宫内膜上皮细胞共培养系统中的脱带率、贴附率和扩展率分别是69．52％、81．25％和91．51％,小鼠囊胚在恶性肿瘤细胞与容受性子宫内膜上皮细胞体外植入比较,其脱带率、贴附率和扩展率差异无统计学意义（P〉0．05）,植入的形态学和滋养层细胞表达的MMP-9差异无统计学意义（P〉0．05）。结论 在体外贴壁细胞的共培养系统中,小鼠囊胚在恶性肿瘤细胞和容受性子宫内膜上皮细胞共培养系统中的发育和植入行为差异无统计学意义,可能是早期生命在体外高适应和自我组织能力的一种体现。     

囊胚期小鼠胚胎体外培养条件的研究

目的探讨体外不同培养条件对小鼠囊胚生长发育的影响。方法将妊娠d4小鼠囊胚分别培养在无血清培养液（组Ⅰ）、有血清培养液（组Ⅱ）和与无血清小鼠子宫内膜上皮细胞的共培养体系（组Ⅲ）中，观察囊胚的脱带率和扩展生长情况。结果组Ⅰ中的囊胚几乎不能脱带、生长，组Ⅱ和组Ⅲ的培养体系可以支持胚胎细胞的生长增殖。培养24h后，组Ⅲ囊胚的脱带率和扩展生长率明显高于组Ⅱ（P〈0.01），且组Ⅲ囊胚出现类似于“植入”的侵入行为。结论囊胚的孵出和生长发育有赖于外界培养条件，而囊胚与子宫内膜上皮细胞的共同培养，更接近体内发育环境，有利于囊胚的生长发育。     

立体着床模型--小鼠囊胚与子宫内膜的共培养

目的:建立小鼠囊胚体外着床的三维模型,为着床机制的研究提供重要工具.方法:将小鼠囊胚与其自身子宫内膜分别共培养在空气、含500,750和950 mL/L O2的混合气体与组织培养液的气液界面上,比较不同O2浓度下小鼠囊胚的贴附率,确定体外共培养的最佳O2浓度;同时将确认有囊胚贴附的子宫内膜取出作HE染色.结果:不同O2浓度下,囊胚的贴附率分别为64.75%,47.86%,42.37%和30.97%,x2检验提示其差异有显著性(x2=28.145,P=0.000);且随着混合气体中O2浓度的逐渐升高,囊胚贴附率呈逐渐降低趋势.因此50 mL/L CO2 950 mL/L空气对囊胚与子宫内膜的共培养是最有利的;同时,囊胚贴附子宫内膜后并无扩展行为而是直接侵入子宫内膜.结论:50 mL/L CO2 950 mL/L空气最有利于囊胚与子宫内膜的共培养;且囊胚贴附子宫内膜后不发生外延生长,而是直接侵入子宫内膜.本实验成功地建立了小鼠囊胚体外着床的三维模型.     

芦荟大黄素体外抑制人舌癌及肺癌肿瘤细胞生长的初步研究

目的观察芦荟大黄素在体外对人舌癌细胞株Tca 8113及肺癌细胞株YTMLC肿瘤细胞的生长抑制作用．方法不同浓度的药物作用于培养的肿瘤细胞，应用MTT法和光学显微镜观察药物对细胞的生长抑制作用．结果随着药物作用浓度升高，细胞增殖随之下降，且该抑制作用具有一定的浓度-时间-效应关系，在芦荟大黄素浓度为10mg／L时抑制作用最为显著．结论芦荟大黄素在体外可以对人舌癌细胞株Tca 8113和肺癌细胞株YTMLC肿瘤细胞产生生长抑制作用．     

子宫内膜上皮细胞与小鼠胚胎共培养对小鼠胚胎早期发育的影响

目的:采用子宫内膜上皮细胞与小鼠胚胎共培养,观察其对早期胚胎体外发育的影响。方法:对小鼠子宫内膜上皮细胞进行分离、培养鉴定,然后与体外受精的小鼠胚胎进行共培养,观察共培养对小鼠胚胎卵裂率、孵化率以及囊胚期胚胎总细胞数的影响。结果:与无上皮细胞相比,共培养明显促进了小鼠桑椹胚率(71.3%和61.2%,P<0.05),囊胚率(50.0%和39.7%,P<0.05),囊胚孵化率(34.8%和24.3%,P<0.05)和胚胎总细胞数(44.1和35.6,P<0.05)。结论:子宫内膜上皮细胞能够促进小鼠胚胎的体外发育,对早期胚胎的体外发育环境具有优化作用。     

芦荟大黄素在体外诱导人舌癌及肺癌肿瘤细胞凋亡的初步研究

目的探讨芦荟大黄素在体外对人舌癌细胞株Tea8113及肺癌细胞株YTMLC肿瘤细胞的生长抑制作用及诱导凋亡的作用，并初步探讨其机理，为进一步明确芦荟的药理作用及扩展芦荟的临床应用提供实验依据．方法将不同浓度的芦荟大黄素作用了舌癌和肺癌肿瘤细胞，应用MTT法观察药物对细胞的生长抑制作用；应用免疫荧光、DNALadder、流式细胞仪及透射电镜检测细胞凋亡；     

hESCs与A549细胞共培养后上清液在体外抗肺癌细胞的作用研究

目的：研究人胚胎干细胞H9与肺癌细胞A549共培养上清液对A549细胞增殖、凋亡、侵袭及迁移的影响。方法：建立人胚胎干细胞H9与肺癌A549细胞直接接触式共培养体系,收集共培养上清液,将共培养上清液作用于肺癌A549细胞。以单独培养的A549细胞上清液为空白对照组,单独培养的人胚胎干细胞H9上清为对照组。显微镜下观察共培养上清液对肿瘤细胞生物行为学的影响;用CCK-8检测共培养上清液对肿瘤细胞增殖能力的影响;Hoechst染色法检测共培养上清液对肿瘤细胞的凋亡影响;细胞划痕实验检测共培养上清液对肿瘤细胞迁移及侵袭的影响。结果：显微镜下观察到实验组肿瘤细胞数量逐渐减少甚至凋亡;CCK-8检测到实验组肿瘤细胞的增殖受到显著抑制（P<0.05）;Hoechst染色发现实验组细胞核出现典型凋亡形态;细胞划痕实验结果显示实验组肿瘤细胞的划痕愈合率明显低于空白对照组和对照组（P<0.05）。结论：人胚胎干细胞H9与肺癌A549细胞共培养上清液,在体外可以抑制肺癌A549细胞增殖、迁移,促进肿瘤细胞凋亡,具有一定的抗癌效应。     

GFP小鼠对三维体外着床模型的定位及验证

目的 本研究将基于已经建立的三维小鼠体外胚胎着床模型,运用绿色荧光（GFP）小鼠胚胎替代ICR小鼠胚胎,验证三维着床模型的可行性。方法 将孕第4天GFP小鼠及ICR小鼠囊胚与ICR小鼠的内膜组织进行体外共培养。观察两组胚胎黏着率的差异。对GFP小鼠囊胚组通过荧光显微镜进行观察,共培养后进行组织学研究。结果 GFP小鼠囊胚及ICR小鼠囊胚与ICR小鼠子宫内膜组织共培养28h后的胚胎黏着率分别为46.6%及54.8%;两组黏着率之间差异无统计学意义（P=0.364）。GFP小鼠囊胚与ICR小鼠子宫内膜组织共培养28h及40h后均可在荧光显微镜下见到胚胎,组织学研究证实GFP小鼠囊胚可以黏着于ICR小鼠子宫内膜。结论 三维着床模型确实能够实现不同来源小鼠胚胎的黏附着床。运用GFP小鼠胚胎还发现了胚胎与子宫内膜组织之间存在着信息及分子联系。     

annexin A2体外胚胎着床的功能阻滞研究

目的 将通过已有的小鼠体外胚胎着床模型对annexin A2在胚胎着床中的功能进行相应的研究。方法 将孕第4天ICR小鼠囊胚与ICR小鼠的内膜组织进行体外共培养。比较子宫内膜经annexin A2抗体预处理以及未经处理之间,各组胚胎黏着率的差异,并在共培养后进行组织学研究。结果 小鼠子宫内膜经浓度为1.0μg/ml及0.1μg/ml的annexin A2抗体预处理后小鼠囊胚在其上的黏着率分别为45.6%及53.6%;而抗体浓度为1.0μg/ml的正常IgG对照及未经抗体处理的空白对照组的黏着率分别为55.4%及59.0%。经过1.0μg/ml的annexin A2抗体预处理组与两组对照组之间的黏着率比较,差异无统计学意义。免疫组化实验发现,经过annexin A2抗体预处理后,未见到annexin A2表达明显降低。结论 annexin A2在第4天的子宫内膜组织表达明显高于第1天的子宫内膜组织。运用抗体进行阻滞实验时并不能显著降低体外胚胎在子宫内膜组织的黏着率。     

甘氨酸-钼磷酸盐体内外抗肿瘤作用的研究

目的 :观察甘氨酸 -钼磷酸盐 [( Gly H) 4 PMo12 O40 · 5 H2 O,GP]对肿瘤细胞生长的抑制作用及对荷瘤小鼠的抑瘤效应。方法 :采用 MTT法进行体外抑瘤效应测定 ,建立小鼠荷 S1 80腹水瘤模型 ,测定体重增长率、抑瘤率以及延命率。结果 :体外实验表明 ,实验浓度的 GP对正常组织细胞均无细胞毒性作用 ( P<0 .0 5 )。对宫颈癌 Hela细胞株、前列腺癌 PC- 3m细胞株、小鼠腹水瘤 S1 80细胞株、原代肺癌细胞等肿瘤细胞生长有明显抑制作用 ( P<0 .0 5 ) ,并呈一定的量效关系。其中对人前列腺癌 PC- 3m细胞株尤为明显。体内实验表明 ,给药组能够抑制 S1 80腹水瘤生长 ,明显延长小鼠生命期 ,延命率高于 CYT阳性对照组。急性毒性实验 LD50 为 2 735 .2 7mg·kg-1,LD50 95 %可信限为 :1 931 .97～ 3872 .5 8mg· kg-1。结论 :本研究表明 ,GP能抑制多种人癌细胞生长 ,延长荷瘤小鼠生存期 ;GP属低毒、高效抗癌药物     

Fibroblasts weaken the anti-tumor effect of gefitinib on co-cultured non-small cell lung cancer cells

Background Non-small cell lung cancer （NSCLC） is the most common lung malignancy worldwide.The metastatic potential of NSCLC cells has been shown to be associated with the tumor microenvironment,which consists of tumor cells,stroma,blood vessels,immune infiltrates and the extracellular matrix.Fibroblasts can produce numerous extraceilular matrix molecules and growth factors.Gefitinib has been evaluated as a first-line treatment in selected patients,and it has shown favorable efficacy especially in NSCLC,but it is not effective for everyone.Methods In this study,we examined the antitumor activity of gefitinib on lung fibroblasts co-cultured of lung cancer cells.A series of co-culture experiments that employed cell counting kit-8 （CCK8）,transwells,real-time polymerase chain reaction （RT-PCR） and Western blotting with HFL-1 fibroblasts and A549 human lung carcinoma cells were performed to learn more about tumor cell proliferation,migration and invasion; and to determine any change of epithelial mesenchymal transition （EMT）-associated tumor markers vimentin,matrix metallopro-teinase 2 （MMP2） and chemotaxis cytokines receptor 4 （CXCR4） mRNA levels.Results A549 cell proliferation in the presence of HFL-1 cells was not significantly increased compared with A549 cells alone,but A549 cell spheroid body formation was increased after co-culture,and treatment with gefitinib increased further.Our study also revealed that fibroblasts attenuated the lung cancer cell inhibition ratio of migration and invasion after gefitinib treatment in vitro.To further study this mechanism,RT-PCR analysis showed that vimentin,MMP2 and CXCR4 mRNA levels were more highly expressed in the lung cancer cells after co-culture,but did not obviously decrease compared with the control cells following gefitinib treatment.This suggests the mechanism by which fibroblasts attenuate gefitinib-induced expression of EMT-associated tumor markers.Finally,our results demonstrated that co-culture with A549 lung cancer cells does not alter the cell cycle distribution of HFL-1 fibroblasts.Furthermore,HFL-1 fibroblasts had no effect on the cell cycle distribution of HFL-1 cells treated with gefitinib.Conclusion Gefitinib has lower anti-tumor activity on A549 lung cancer cells when co-cultured with HFL-1 fibroblasts.     

三氧化二砷对人肺腺癌A-549细胞株增殖及c-Myc基因表达的影响

目的观察三氧化二砷(As2O3)对人肺腺癌A549细胞株的生长增殖、细胞周期、凋亡等方面的影响,并初步探讨其机制。方法选用不同浓度As2O3处理人肺腺癌A549细胞株,以MTT比色法检测细胞生长增殖的抑制情况;用流式细胞术测定细胞周期、凋亡率;以免疫组织化学法分析不同浓度As2O3对c-Myc基因表达的影响。结果 As2O3以时间和浓度依赖的方式抑制人肺腺癌A-549细胞的增殖,并能诱导细胞凋亡。不同浓度As2O3处理组可调控细胞周期分别发生G2/M期阻滞和S期阻滞,并下调c-Myc基因表达。结论三氧化二砷对人肺腺癌细胞株A-549的生长、增殖有明显抑制作用,其机制可能与细胞周期阻滞和抑制c-Myc基因的表达和诱导细胞凋亡有关。     

蛞蝓提取物抑制A549细胞及其小鼠移植瘤的生长

目的观察蛞蝓提取物（LE）对体外培养人肺癌（A549）细胞及其小鼠移植瘤生长的影响。方法运用平皿集落形成法,检测LE对A549细胞锚定依赖性生长的影响;通过光镜观察LE对小鼠移植瘤的组织形态改变;小鼠移植瘤模型治疗实验评估LE在体治疗肺癌的有效性。结果LE可抑制体外培养A549细胞锚定依赖性生长,呈剂量依赖性。LE腹腔注射给药能导致小鼠移植瘤组织的局灶性坏死;50mg／kg,100mg／kgLE腹腔注射给药具有抑制小鼠移植瘤生长作用。结论蛞蝓提取物对人肺癌A549细胞有生长抑制作用。     

Effects of Exogenous p16^ink4a Gene on Biological Behaviors of Human Lung Cancer Cells

The effects of exogenous p16ink4a gene on biological behaviors of human lung cancer cell line with homozygous deletion of p16ink4a gene were investigated. Exogenous p16ink4a gene was transfected by lipofectin into human lung cell line A549, in which p16ink4a gene was homozygously deleted. The expression of p16ink4a mRNA and protein was detected by RT-PCR and immunocyto-chemistry, respectively. The changes in the behaviors of the transfected cell lines in vitro and in vivo were observed. In the transfected cell line A549, the exogenous p16ink4a gene could be stably ex-pressed. The growth of A549 cells transfected with p16ink4a gene was obviously slowed down. Flow cytometry revealed that transfection of the exogenous p16ink4a gene resulted in A549 cell lines arrest in G1 phase of cell cycle. The tumorigenicity of these transfected cells in nude mice could be inhib-ited, and the tumor growth of nude mice was significantly suppressed. It was concluded that exoge-nous p16ink4a gene may be stably expressed in human lung cancer cell line A549. The expression of the introduced p16ink4a could block lung cancer cells to entry into S phase of cell cycle and inhibit tumor malignant growth both in vitro and in vivo.     

具有肿瘤杀伤活性粒细胞的筛选及其体外抑瘤效应观察

目的探索具有肿瘤杀伤活性(CKA)粒细胞的筛选方法,并对其体外抑瘤效应进行初步研究。方法(1)收集健康志愿者外周抗凝全血21份,分离粒细胞,与人肺癌A549细胞共培养,通过检测肿瘤细胞增殖活性筛选出CKA粒细胞。(2)将筛选得到的CKA粒细胞作用于不同种类的肿瘤细胞,采用CCK8法检测肿瘤细胞活性,双染法检测肿瘤细胞凋亡发生情况。(3)分别采用直接接触、Transwell共培养、条件培养液等共培养细胞方式,观察不同处理方式对CKA粒细胞抑制肿瘤细胞活性的影响。结果(1)有6株粒细胞克隆对A549细胞活性具有明显的抑制作用,将其中作用最显著的克隆3标记为CKA粒细胞。(2)CKA粒细胞不仅对人肺腺癌细胞A549、人肝癌细胞HepG2和人宫颈癌细胞HeLa生长活性有明显抑制作用,且能促进这3种细胞的凋亡。(3)3种处理方式的抑制效率比较:直接接触＞Transwell＞条件培养。结论CKA粒细胞对某些类型的肿瘤细胞活性具有明显的抑制作用;CKA粒细胞对肿瘤的杀伤作用可能与其与肿瘤的接触方式有关。     

肿瘤坏死因子抑制人肺癌细胞增生能力的体外研究

利用多细胞球体 ,探讨体外培养条件下肿瘤坏死因子 (TNFα)对肺癌细胞增生能力的影响。发现TNF( 1 0 4U/mL)与人肺癌细胞系A5 4 9球体共同培养后对A5 4 9细胞球体生长有一定的抑制作用 (P <0 .0 5 )。TNF与A5 4 9单层细胞作用后 ,观察细胞生长曲线的变化 ,计算细胞倍增时间 ,测定细胞集落形成率。发现TNF可改变A5 4 9细胞的生长曲线 ,使细胞倍增时间由 37h延长至 4 3h ,集落形成率由 5 2 %降低为 1 5 %。结果表明TNF对增生性肺癌干细胞有一定的抑制作用。     

血管基膜衍生多功能肽选择性抑制人肺癌细胞增殖

目的:观察重组血管基膜衍生多功能肽(Vascular basement membrane derived multifunctional peptide,VBM-DMP)对人肺癌细胞增殖的选择性抑制作用。方法:体外培养人肺癌(A549)细胞、人胚肺二倍体成纤维细胞(KMB-17),采用MTT比色法测定重组VBMDMP对A549细胞增殖的选择性抑制作用;台盼蓝染色细胞计数法观察重组VBMDMP对A549细胞和KMB-17细胞生长曲线的影响;采用人肺癌(A549)细胞裸鼠异种移植瘤模型治疗实验,评价重组VBMDMP治疗人肺癌的有效性。结果:体外实验结果表明重组VBMDMP能选择性抑制人肺癌(A549)细胞的增殖和生长,呈剂量依赖性,而对KMB-17细胞的增殖活性影响小;重组VBMDMP显著抑制人肺癌(A549)细胞裸鼠异种移植瘤的生长,呈剂量依赖性趋势。1 mg/kg和5 mg/kg重组VBMDMP的肿瘤生长抑制率分别是42%和74%,瘤重抑制率分别42%和77%,其中5mg/kg重组VBMDMP的肿瘤生长抑制率和瘤重抑制率均高于环磷酰胺(CTX100 mg/kg)、血管生成抑制剂烟曲霉素衍生物TNP-470(20 mg/kg)。结论:重组VBMDMP对人肺癌细胞(A549)的增殖和生长具有显著抑制作用,是一种选择性高,抗肿瘤作用强的新型抗肿瘤基因工程候选药物。     

肺癌细胞裂解物刺激树突状细胞诱导产生免疫应答的实验研究

目的采用肺癌细胞裂解物致敏树突状细胞（DCs）的方法制备肺癌疫苗并进一步通过实验验证其疗效。方法利用外周血的单个核细胞经粒细胞-巨嗜细胞集落刺激因子（GM-CSF）和人白细胞介素4（IL-4）体外诱导产生树突状细胞,用A549（人肺腺癌细胞系）细胞冻融抗原对其进行冲击诱导自体细胞毒T淋巴细胞（CTLs）产生。通过细胞毒试验及ELISA测定细胞因子的分泌和CTLs杀伤活性。制备荷瘤裸鼠模型,不同分组裸鼠经过一次或多次皮下注射CTLs。结果 A549冻融抗原致敏的DCs增加CTLs增殖,诱导的CTLs对A549细胞产生特异性杀伤,经过一次及多次接种后荷瘤裸鼠肿瘤生长减缓,并且肿瘤变小及生存时间较对照组明显延长,起到抑制肿瘤生长和延长生存时间的作用。结论通过实验证实了肺癌细胞裂解物抗原来刺激树突状细胞治疗肺癌A549荷瘤裸鼠模型是安全有效、可行的。为临床应用以树突状细胞为基础的肺癌疫苗免疫治疗提供了实验依据。     

紫苏醇对肺癌细胞的体外药效作用及毒理学评价

目的研究紫苏醇对肺癌细胞的体外药效作用,及其对小鼠的毒理学评价。方法以质量浓度为0.637-6.829 mg.L-1的紫苏醇对肺鳞癌细胞NCI-H1299和肺腺癌细胞A549作用24 h后,用噻唑蓝（MTT）比色法、Hoechst 33258荧光染色法检测凋亡率和细胞毒性。取随机分组的小鼠,将紫苏醇以灌胃方式给药,剂量范围为5.736-1.912 g.kg-1,观察小鼠中毒症状,按照改良寇氏法计算紫苏醇的半数致死量（LD50）以及95%平均可信限。结果紫苏醇呈浓度依赖性抑制NCI-H1299和A549细胞生长,质量浓度为1.707 mg.L-1时,对NCI-H1299和A549细胞的抑制率分别为93.97%和95.45%,Hoechst33258荧光染色观察到两株细胞均出现细胞核浓缩变亮,呈分叶状、数量显著减少等凋亡特征变化。小鼠给药后出现中毒症状,其程度与紫苏醇呈剂量依赖性,测得紫苏醇LD50和95%可信限为（3.696±0.504）g.kg-1.结论紫苏醇体外对NCI-H1299和A549细胞的生长有显著抑制作用,口服紫苏醇有相对高的LD50和治疗指数。     

HSV-tk基因表达载体的构建及其对A549细胞的杀伤作用

目的构建自杀基因HSV-tk表达质粒,研究自杀基因疗法对人肺癌细胞的杀伤作用,探讨其治疗肺癌的可行性。方法PCR扩增tk基因带EcoRⅠ、XhoⅠ酶切位点,然后构成建到pcDNA3.0载体中成pcDNA3.0-tk;将pcDNA3.0-tk转染A549肺癌细胞,应用细胞生长曲线和MTT法测定前药GCV对A549细胞的杀伤作用。结果成功获得pcDNA3.0-tk克隆,RT-PCR、Western印迹法证明A549细胞转染pcDNA3.0-tk后可表达自杀基因,GCV能特异性地杀伤A549/tk细胞。结论HSV-tk基因表达质粒构建成功;HSV-tK/GCV系统对肺癌A549细胞有一定的杀伤作用。