抗胃癌单链抗体的构建,表达及活性测定

对能与肿瘤细胞特异结合，并已成功用于临床肿瘤显像的单克隆抗体３Ｈ１１（ＭｃＡｂ３Ｈ１１）构建为小分子的单链抗体（Ｓ３Ｈ１１），并证明其生物学活性，为扩大ＭｃＡｂ３Ｈ１１在临床的应用奠定基础。方法通过逆转录及多聚酶链式反应，扩增并克隆３Ｈ１１的可变区基因（ＶＨ，ＶＬ）片段，经测序后通过（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３的接头将两者连接，并与谷胱苷肽转移酶（ＧＳＴ）基因重组，在大肠杆菌表达ＧＳＴ与３Ｈ１１单链抗体的融合蛋白（ＧＳ３Ｈ１１）。ＧＳ３Ｈ１１经变性及复性处理后用竞争抑制实验检测其抗体活性。结果ＧＳ３Ｈ１１能特异抑制ＭｃＡｂ３Ｈ１１同胃癌细胞ＭＧＣ８０３的结合，当ＧＳ３Ｈ１１与ＭｃＡｂ３Ｈ１１的结合价位比为１５：１时，ＭｃＡｂ３Ｈ１１的活性受到完全抑制；ＧＳ３Ｈ１１对亦能同ＭＧＣ８０３特异结合的不同单抗３Ｇ９及ＰＤ４无任何抑制作用。结论ＧＳ３Ｈ１１具有特异结合抗原的活性，具有潜在的应用前景，同时亦为构建免疫毒素分子奠定了基础。     

利用PCR技术构建GM—CSF／Fcγ2融合蛋白载体

目的：构建 Ｇ Ｍ Ｃ Ｓ Ｆ／ Ｆｃγ２ 融合蛋白载体。方法：利用 Ｐ Ｃ Ｒ技术,将人 Ｇ Ｍ Ｃ Ｓ Ｆ基因与人免疫球蛋白 Ｉｇ Ｇ２ 的 Ｆｃ 段基因联接,构建融合基因ｈ Ｇ Ｍ Ｃ Ｓ Ｆ Ｈ Ｖ２;并将此片段定向克隆到真核表达质粒ｐ Ｒｃ／ Ｃ Ｍ Ｖ２ 载体。结果：琼脂糖凝胶电泳结果显示 Ｐ Ｃ Ｒ扩增出了 １．３ ｋｂ 的融合基因片段;限制性内切酶图谱分析,成功地完成了 Ｇ Ｍ  Ｃ Ｓ Ｆ／ Ｆｃγ２ 融合蛋白载体的构建。结论：（１）经 Ｐ Ｃ Ｒ 扩增技术由质粒 Ｐ Ｃ Ｄｈ Ｇ Ｍ Ｃ Ｓ Ｆ和 Ｐ Ｓ Ｖ Ｖ Ｎ Ｐ Ｈ Ｖ２ 分别扩增到了所需的ｈ Ｇ Ｍ Ｃ Ｓ Ｆ ｃ Ｄ Ｎ Ａ 片段和 Ｉｇ Ｇ２ 从绞链区到 Ｃ Ｈ３ 的基因组 Ｄ Ｎ Ａ 片段。（２）利用 Ｐ Ｃ Ｒ介导,扩增出了融合基因片段ｈ Ｇ Ｍ Ｃ Ｓ Ｆ Ｈ Ｖ２。（３）构建了真核细胞表达载体ｐ Ｒｃ／ Ｃ Ｍ Ｖ２／ｈ Ｇ Ｍ Ｃ Ｓ Ｆ Ｈ Ｖ２ 。     

汉滩病毒核蛋白在大肠杆菌中高效表达

提高汉滩病毒核蛋白的表达量，进一步研究核蛋白的功能，并利用其建立ＨＦＲＳ的血清学诊断方法。利用已有的含ＰＲＰＬ启动子的汉滩病毒核蛋白编码区的表达载体－Ｓ２２，通过酶切和连接的方法，将汉滩病毒Ｓ片段核蛋白的编码区基因插入融合蛋白表达载体ｐＧＥＸ－４Ｔ－１和ＧＳＴ基因的３’末端，构建了一种表达核蛋白的融合质粒－ｐＴＨａｎＳ。结果；经薄层扫描仪扫描，ｐＴＨａｎＳ核蛋白的表达量占细胞总蛋白量的３２％。并对     

Ⅲ型中国株丙型肝炎病毒E2／N21基因的克隆与序列分析

目的 构建插入Ⅲ型中国株丙型肝炎病毒Ｅ２／ＮＳ１基因片段的真核表达载体,分析该基因片段的核苷酸一级结构。方法 利用逆转 录套式ＰＣＲ扩增Ⅲ型中国株丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）Ｅ２／ＮＳ１基因片段,通过定向克隆将其克隆到真核表达载体ｐｃＤＮＡ３上,采用双脱氧链终止法测定其核苷酸序列。结果 构建出含有Ⅲ型中国株丙型肝炎病毒Ｅ２／ＮＳ１基因片段的克隆,该区基因片段的核苷酸一级结构和Ⅲ型日本株ＨＣＶ（ＨＣ－Ｊ６     

血红素加氧酶—1 cDNA在COS—1细胞内的表达

通过构建表达质粒ｐｃＤＮＡ３ＨＯ１，并在ＣＯＳ－１细胞中的瞬时表达，证实分离的ｃＤＮＡ编码血红素加氧酶－１，以探讨ＨＯ－１在新生期黄疸中的作用机制。实验中构建含编码ＨＯ－１ ｃＤＮＡ的表达型质粒ｐｃＤＮＡ３ＨＯ１，培养ＣＯＳ－１细胞，表达型质粒ｐｃＤＮＡ３ＨＯ１转染ＣＯＳ－１，收集细胞，超声破膜，超速离心得到微粒体颗粒，ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）鉴定和酶活性检测，结果显示：ＨＯ     

利用PCR—SSCP及克隆分析对HERG基因突变的新发现

为研究ＱＴ延长综合征（ＬＱＴＳ）致病的分子遗传学基础。我们在ＰＣＲ基础上建立ＳＳＣＰ方法对ＬＱＴ患者和正常对照者ＨＥＲＧ基因的突变进行研究。并且利用克隆技术对突变进行确证。通过ＳＳＣＰ分析,在１例正常对照者中发现异常条带,该突变无法用直接测序确证,因此我们将其转入质粒,克隆后再进行测序。结果提示在ＨＥＲＧ基因７５２位点（５′→３′）异常插入９个碱基。突变型为杂合子。突变导致蛋白通道氨基酸序列中插入ＧｌｙＡｌａＧｌｙ。与其他已报道的突变不同,本文所发现的３个氨基酸的插入突变不是ＬＱＴＳ发生的遗传基础。     

HBV中片段表面抗原及E抗原真核表达质粒的构建与体外表达

目的 构建乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）中片段表面抗原真核表达质粒和Ｅ抗原真核表达闰。方法 将编码ＨＢＶ中片段表面抗原（ｐｒｅＳ２＋Ｓ）的基因片段和Ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ＿的基因片段分别插入真核细胞表达载体（ｐＪＷ４３０３）中,构建成的重组体经筛选鉴定后,再转染哺乳动物细胞,检测表达产物。结果 电泳鉴定显示目的基因片段正确插入了表达载体。经筛选、纯化的阳性克隆转染哺乳动物细胞后可表达ｐｒｅＳ２＋Ｓ和ＨＢｅＡｇ     

人抗惭肝表面抗原抗体Fab片段／αA—干扰素融合蛋白原核表达 …

目的：为深入开展乙型肝炎的生物导向治疗。我们构建了人抗乙肝表面抗原（ＨＢｓＡｇ）抗体Ｆａｂ片段／αＡ－干扰素（ＩＦＮ－αＡ）融合蛋白核表达载体ｐＨＳ／ＩＦＮ－α，方法：采用ＰＣＲ方法，将ＩＦＮ－αＡＤＮＡ两端引入酶切位点及５；引入－Ｌｉｎｋｅｒ，重组入抗ＨＢｓＡＧ抗体Ｆａｂ表达载体ＰＨＳ相应酶切位点，酶切鉴定并筛选出阳性克隆ＰＨＳ／ＩＦＮ－α，并对插入基因片段测序。结果：重组阳性克隆经酶切鉴定证实     

抗HSV—1杂交瘤细胞系的建立及单抗特性研究

以ＨＳＶ－１为抗原，免疫ＢＡＬＢ／Ｃ鼠，取其脾细胞在ＰＧＥ介导下与ＳＰ２／０细胞常规融合，ＩＦＡ法筛选鉴定，反复克隆，共获得７株能稳定、持续分泌抗ＨＳＶ的ＭｃＡｂ的杂交瘤细胞系。核型分析染色体数为８７￣１０３条之间，Ｉｇ类型分别为ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３，腹水抗体效价在１０＾－５￣１０＾－７之间免疫沉淀。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，２株与１３２Ｋ多肽发生特异性反应，只具有ＨＳＶ－１型特异性，其余３     

Ⅲ型中国株丙型肝炎病毒E2/NS1基因的克隆与序列分析

目的构建插入Ⅲ型中国株丙型肝炎病毒Ｅ２／ＮＳ１基因片段的真核表达载体，分析该基因片段的核苷酸一级结构。方法利用逆转录套式ＰＣＲ扩增Ⅲ型中国株丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）Ｅ２／ＮＳ１基因片段，通过定向克隆将其克隆到真核表达载体ｐｃＤＮＡ３上，采用双脱氧链终止法测定其核苷酸序列。结果构建出含有Ⅲ型中国株丙型肝炎病毒Ｅ２／ＮＳ１基因片段的克隆，该区基因片段的核苷酸一级结构和Ⅲ型日本株ＨＣＶ（ＨＣ－Ｊ６）的同源性为８８．３７％，Ⅱ型中国株ＨＣＶ（ＨＣ－Ｃ２）的同源性为７０．６９％，其推定的氨基酸同源性分别为８９．２９％和７５．５５％。结论基因的核苷酸一级结构在同一基因型中有较高的同源性，而不同基因型之间的同源性则相对较低。对不同基因型之间Ｅ２／ＮＳ１基因一级结构的研究将有助于ＨＣＶ疫苗的研制。     

重组丙型肝炎病毒基因载体的构建与表达

应用基因重组技术。从载体ＣＤＺ２酶切获得１．７３ｋｂＤＮＡ片段（含１６ｄ９３ｂｐ的ＨＣＶ结构区ｃＤＮＡ，其特异性已为ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ证实）。将ＨＣＶｃＵＮＡ片段插入载体ｐｃＤＮＡ３，构建ＨＣＶ重组体。经在大肠杆菌中表达，筛选、酶切分析，获得重组ＨＣＶ（ＰｃＤＮＡ３－ＨＣＶ）。以重组质粒转染Ｈ９细胞（ＣＤ淋巴细胞系），用Ｇ４１８筛选出抗性细胞。经ＲＴ－ＰＣＲ、ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ验证表明，ｐｃＤＮＡ３－ＨＣＶ能在Ｈ９细胞中进行复制、转录和表达。这为丙型肝炎发病机理的研究提供了一个有用模型。     

百日咳杆菌毒素S_1亚单位与谷胱甘肽S-转移酶融合基因在大肠杆菌中表达及其一步纯化

研究了百日咳杆菌毒素Ｓ１亚单位与谷胱甘肽Ｓ－转移酶融合蛋白（ＧＳＴ－Ｓ１）在大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中的表达,并一步纯化了重组ＧＳＴ－Ｓ１。首先用聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增出长度为５６０ｂｐ的编码百日咳毒素Ｓ１亚单位的ＤＮＡ片段。该片段比原编码Ｓ１蛋白的ＤＮＡ片段在其３′端缺失了１３８个碱基,将其按正确的阅读框克隆入质粒ｐＧＥＸ中ＧＳＴ基因的３′端,构成ＧＳＴ－Ｓ１融合基因表达载体ｐＧＥＸ－Ｓ１。经异丙基硫代－β－Ｄ－半乳糖苷（ＩＰＴＧ）诱导表达和十二烷基磺酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）,可见所表达的ＧＳＴ－Ｓ１融合蛋白存在于细菌上清,为可溶性蛋白。分子量为４９ｋｕ处有明显的蛋白表达带。用谷胱甘肽（ＧＳＨ）亲和层析系统,一步纯化出ＧＳＴ－Ｓ１融合蛋白。最后经凝血酶的消化,得到２３ｋｕ的重组百日咳杆菌毒素Ｓ１亚单位蛋白。为百日咳疫苗的发展提供了依据     

丙肝病毒非结构蛋白基因3的克隆及其体外诱导表达

目的：研究丙型病毒非结构蛋白基因３（ｎｓ３基因）在体外真核细胞中的诱导表达。方法：以ＰＣＲ方法从含ＨＣＶｎｓ３基因的重组载体ｐＢｎｓ３中扩增出ｎｓ３基因，并将其插入到克隆载体ｐＧＥＭ－Ｔ中，再与表达载体ｐＭＳＧ重组，以利到重组表达载体ｐＭＳＧ－ｎｓ３。然后采用磷酸钙沉淀法将其转染哺乳动物ＣＨＯ细胞，经地塞米松（ＤＭ）诱导，采用ＥＬＩＳＡ及Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ技术检测ＮＳ３蛋白的表达水平。结果：     

隔核内注射吗啡对海马痛单位的影响

目的：探讨隔核内阿片主相应的受体在隔核影响海马单位中的作用。方法：参照Ｓａｗｙｅｒ兔脑图谱,用ＳＮ－２型推进器以２μｍ／ｓ速度将玻璃微电极插入海马Ｐ２．５,Ｌ３－６,Ｈ６－９处引导神经元自发放电;在Ａ３Ｒ１Ｈ２（外侧隔核）处插入钨比有,人和刺激隔核用;在Ａ２Ｒ１Ｈ２及中脑导水管周围灰质（ＰＡＧ）Ｐ９．５Ｒ１Ｈ１．５）处分别埋不锈钢微量注射套管,用牙托水配牙托粉固定,作脑室注射用。结果：共引导８５个     

人抗乙肝表面抗原抗体Fab片段/αA-干扰素融合蛋白原核表达载体的构建

目的：为深入开展乙型肝炎的生物导向治疗，我们构建了人抗乙肝表面抗原（ＨＢｓＡｇ）抗体Ｆａｂ片段／αＡ－干扰素（ＩＦＮ－αＡ）融合蛋白原核表达载体ｐＨＳ／ＩＦＮ－α。方法：采用ＰＣＲ方法，将ＩＦＮ－αＡＤＮＡ两端引入酶切位点及５端引入－Ｌｉｎｋｅｒ，重组入抗ＨＢｓＡｇ抗体Ｆａｂ表达载体ｐＨＳ相应酶切位点，酶切鉴定并筛选出阳性克隆ｐＨＳ／ＩＦＮ－αＡ，并对插入基因片段测序。结果：重组阳性克隆经酶切鉴定证实重组片段已正确插入载体相应酶位点，片段与ＰＣＲ扩增片段大小相同，硷基序列正确。结论：ｐＨＳ／ＩＦＮ－αＡ的成功构建，为人抗ＨＢｓＡｇ抗体Ｆａｂ片段／αＡ－干扰素融合蛋白在大肠杆菌的表达打下基础     

颅内肿瘤患者全血GSH—Px活性检测及意义

目的 探讨颅内肿瘤患者全血ＧＳＨ－Ｐｘ活性变化及其意义。方法 应用ＤＴＮＢ直接法检测３４例颅内肿瘤患者术前１日及术后３周全血ＧＳＨ－Ｐｘ活性。结果 颅内肿瘤患者术前全血ＧＳＨ－Ｐｘ活性较对照组明显降低，且恶性肿瘤患者全血ＧＳＨ－Ｐｘ活性下降更为明显。术后３周良性颅内肿瘤患者全血ＧＳＨ－Ｐｘ活性已恢复正常，而恶性颅内肿瘤患者仍未恢复至正常水平。结论 ＧＳＨ－Ｐｘ活性变化与颅内肿瘤的发生及预后有一定的     

抗HSV－1杂交瘤细胞系的建立及单抗特性研究

以ＨＳＶ－１为抗原，免疫ＢＡＬＢ／Ｃ鼠，取其脾细胞在ＰＧＥ介导下与ＳＰ２／０细胞常规融合，ＩＦＡ法筛选鉴定，反复克隆，共获得７株能稳定、持续分泌抗ＨＳＶ的ＭｃＡｂ的杂交瘤细胞系。核型分析染色体数为８７～１０３条之间，Ｉｇ类型分别为ＬｇＧ＿１、ＩｇＧ＿（２ｇ）、ＩｇＧ＿３，腹水抗体效价在１０￣（－５）～１０￣（－７）之间免疫沉淀。ＳＤＳ—ＰＡＧＥ分析，２株与１３２Ｋ多肽发生特异性反应，只具有ＨＳＶ－１型特异性，其余３株与１２０～１２８Ｋ多肽，２株与６０Ｋ多肽发生特异性反应，具有ＨＳＶ型共同抗原特异性。７株ＭｃＡｂ与ＣＭＶ均不发生特异反应。这些杂交瘤细胞系的建立对于ＨＳＶ的临床早期、快速诊断有重要的应用价值。     

谷胱甘肽及其构成氨基酸在犬经口、静注给药的药代动力学

目的　主要研究谷胱甘肽（ＧＳＨ）口服后的吸收情况。方法　Ｂｅａｇｌｅ犬５只，先后分别经口、静注给予ＧＳＨ及其构成氨基酸后，用ＨＰＬＣ法测定血中浓度。结果　在清醒犬，单剂量（３．８９、１．６２ｍｍｏｌ／ｋｇ）一次或单剂量（０．４９ｍｍｏｌ／ｋｇ）连续５、１０ｄ经口给ＧＳＨ后，犬前肢静脉血浆中ＧＳＨ、甘氨酸明显升高（Ｐ＜０．０５～０．０１）；如上单次给予１．６２ｍｍｏｌ／ｋｇ（等于ＧＳＨ分子中含有的摩尔数）构成氨基酸后，血浆中的ＧＳＨ水平未见变化，但构成氨基酸均显著增加（Ｐ＜０．０１）；在麻醉犬，经口给ＧＳＨ１．６２ｍｍｏｌ／ｋｇ后，１～６ｈ内肠系膜静脉血浆ＧＳＨ水平高于前肢静脉（Ｐ＜０．０５～０．０１）；清醒犬ｉｖＧＳＨ０．０６５ｍｍｏｌ／ｋｇ后静脉血浆中ＧＳＨ的Ｋｅｌ１和Ｔ１／２α分别为８．０４ｈ－１和０．０９ｈ，且在降至基值后又出现一个再分布的小峰。结论　ＧＳＨ经口给药后部分可以整分子吸收，经肝脏后血浆中ＧＳＨ浓度明显下降，可能是由于肝脏的摄取所致。     

单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶基因的扩增、克隆和测序

目的：对单纯疱疹Ⅰ型胸苷激酶基因扩增、克隆和测序．方法：从单纯疱疹病毒Ⅰ型（ＨＳＶ－１）１７ｓｙｎ＋株感染的ＢＨＫ２１细胞上清液中提取ＨＳＶ－１基因组ＤＮＡ，以此为模板，用ＰＣＲ方法扩增胸苷激酶（ＴＫ）．将扩增的片段克隆入载体ｐＵＣ１８中，并进行测序．结果：除终止码外，ＨＳＶ－１ＴＫ基因全部编码区为１１２８ｂｐ，编码３７６个氨基酸，其中含１２个蛋氨酸，４个半胱氨酸．ＴＫ的第２４９和２５０位氨基酸残基分别为Ｌｅｕ和Ｇｌｎ，其相应密码子为ＣＴＧ，ＧＡＧ，构成１个ＰｓｔＩ位点，第３１３和３１４氨基酸残基分别为Ａｓｐ和Ｖａｌ，其相应密码子为ＧＡＣ和ＧＴＣ，构成另一个ＰｓｔＩ位点．结论：本研究扩增出了ＨＳＶ－１ＴＫ基因的全部编码区序列     

正常人天然IgG抗体噬菌体呈现库的构建

目的 建立一个正常人天然ＩｇＧ抗体委员长 菌体呈现库。方法：从一献血员取５０ｍＬ新鲜血液,分离淋巴细胞。提取ＲＮＡ,逆转录合成ｃＤＮＡＰＣＲ扩增重链Ｆｄ和轻链ｃＤＮＡ,依次将ＰＣＲ产物插入载体ｐＣｏｍｂ３Ｈ相应位点。以点印迹检测噬菌体表面Ｆａｂ的表达,结果 所有４个ＩｇＧ亚类的重链Ｆｄ片段、部分κ轻链和λ轻链ｃＤＮＡ得到扩增。先期插入的重链Ｆｄ的实际库容达１．１×１０＾６,插入率２０％。后期插入的