稳定表达人水通道蛋白4的胚肾细胞系HEK293/AQP4的建立及应用

 【目的】 建立一种可临床应用的并能稳定表达水通道蛋白4的胚肾细胞系HEK293/AQP4,用于检测视神经脊髓炎患者血清中的AQP4抗体｡ 【方法】 构建有AQP4基因的表达载体,利用脂质体将载体转入HEK293细胞,G418筛选,RT-PCR､间接免疫荧光检测稳定细胞系中水通道蛋白4的表达及分布｡细胞间接免疫荧光检测20例NMO患者､20例MS患者､30例健康对照血清中的AQP4抗体,并同鼠脑间接免疫荧光检测法比较｡ 【结果】 限制性酶切消化､PCR､测序结果证明载体构建成功｡间接免疫荧光证实稳定细胞系中有AQP4表达,且主要分布在细胞膜上｡20 例NMO患者血清中11例NMO-IgG阳性,18例AQP4抗体阳性,滴度在1 ∶ 60 - 1 ∶ 15 360之间,而MS患者仅检测到1例阳性,健康对照未检测到阳性｡ 【结论】 成功构建稳定表达水通道蛋白4的胚肾细胞系HEK293/AQP4 ,并检测出国人NMO患者血清中存在AQP4抗体,且敏感性高于鼠脑法,可以有效的鉴别视神经脊髓炎和多发性硬化｡ 关键词: 视神经脊髓炎; NMO-IgG; 水通道蛋白4( AQP4); HEK293     

稳定表达人水通道蛋白4的胚肾细胞系HEK293/AQP4的建立及应用

[目的]建立一种可临床应用的并能稳定表达水通道蛋白4的胚肾细胞系HEK293/AQP4,用于检测视神经脊髓炎患者血清中的AQP4抗体.[方法]构建有AQP4基因的表达载体,利用脂质体将载体转入HEK293细胞,G418筛选,RT-PCR、间接免疫荧光检测稳定细胞系中水通道蛋白4的表达及分布.细胞间接免疫荧光检测20例NMO患者、20例MS患者、30例健康对照血清中的AQP4抗体,并同鼠脑间接免疫荧光检测法比较.[结果]限制性酶切消化、PCR、测序结果证明载体构建成功.间接免疫荧光证实稳定细胞系中有AQP4表达.且主要分布在细胞膜上.20例NMO患者血清中11例NMO-IgG阳性,18例AQP4抗体阳性,滴度在1:60-1:15 360之间,而MS患者仅检测到1例阳性,健康对照未检测到阳性.[结论]成功构建稳定表达水通道蛋白4的胚肾细胞系HEK293/AQP4,并检测出国人NMO患者血清中存在AQP4抗体,且敏感性高于鼠脑法,可以有效的鉴别视神经脊髓炎和多发性硬化.     

AQP4真核表达载体的构建和AQP4-M23蛋白在中国仓鼠肺细胞系V79中的表达

目的：构建水通道蛋白4（AQP4）真核表达载体pmCherry-N1-hAQP4-M23,检测AQP4-M23蛋白在中国仓鼠肺细胞系V79中的表达。方法：采用PCR方法扩增hAQP4-M23基因,经双酶切后与真核表达载体pmCherry-N1连接,构建pmCherry-N1-hAQP4-M23重组表达质粒。采用脂质体将其转染至V79细胞中,将细胞随机分为对照组（未转染重组质粒的V79细胞）和转染组（转染重组质粒的V79细胞）。利用RT-PCR法和荧光显微镜检测2组细胞中hAQP4-M23基因的表达;取视神经脊髓炎（NMO）患者血清中抗AQP4抗体,与2组细胞结合,采用免疫荧光和水通透性法检测2组细胞中hAQP4-M23的活性。结果：成功构建AQP4真核表达载体;荧光显微镜观察,转染组细胞膜清晰表达红色荧光;免疫荧光检测,转染组细胞膜呈现绿色荧光,表明转染组细胞膜AQP4-M23蛋白可与NMO患者血清成分结合;与对照组比较,转染组细胞中hAQP4-M23活性升高（P<0.05）。结论：成功构建表达AQP4基因的真核表达载体,并在V79细胞系中成功表达hAQP4-M23蛋白。     

水通道蛋白－9表达载体的构建及视神经脊髓炎患者血清中抗体的检测

目的：构建一种能稳定表达人水通道蛋白－9（ AQP9）的真核细胞载体,并检测视神经脊髓炎（NMO）患者血清中的AQP9抗体。方法将人AQP9基因克隆入pcDNA3．1＋质粒中构建AQP9－pcDNA3．1＋载体,并转染HEK－293T细胞中。 AQP9蛋白的表达通过RT－PCR和Western blot法验证。通过间接免疫荧光法检测NMO患者血清中的AQP9抗体。结果 AQP9的mRNA相对表达量明显高于空载体,且蛋白表达量在32 kD条带附近明显高于空载和293T细胞。在4例NMO患者血清中均检测到AQP9抗体,1例脑梗死和1例健康人中抗体均为阴性。结论这种转染表达AQP9的细胞模式相对简捷,可用来检测NMO患者中的AQP9抗体,对NMO研究有一定意义。     

人AQP5真核表达质粒的构建及其在胃癌细胞中的表达

目的构建人pcDNA3.1-AQP5/myc-His真核表达质粒,观察水通道蛋白5(AQP5)基因在胃癌AGS细胞中的稳定表达。方法采用基因重组技术将人AQP5cDNA插入真核表达载体pcDNA3.1/myc-His,构建人pcDNA3.1-AQP5/myc-His真核表达质粒。脂质体介导空载体pcDNA3.1/myc-His和表达质粒pcDNA3.1-AQP5/myc-His分别转染人胃癌AGS细胞株,G418筛选,挑取阳性克隆,扩大培养,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹法(Western Blot)分别检测AQP5mRNA和蛋白表达。结果双酶切和基因测序结果均证实人pcDNA3.1-AQP5/myc-His真核表达质粒构建成功。AQP5转染组与空白对照组、空载体组比较,AQP5mRNA表达显著增加(P<0.05),AQP5蛋白表达显著上调(P<0.05)。结论成功构建人AQP5真核表达质粒并获得稳定表达AQP5基因的胃癌AGS细胞系,为进一步研究AQP5蛋白对胃癌恶性表型的影响奠定实验基础。     

不同方法检测NMO-IgG/抗AQP4抗体滴度的比较

【目的】旨在比较鼠脑法和细胞法检测中国人视神经脊髓炎(NMO)疾病谱(NMOSD)的滴度是否具有一致性。【方法】每个样本分别采用鼠脑法和细胞法检测,阳性血清采取倍比稀释以确定最终稀释倍数。应用盲法检测血清NMO-IgG/抗水通道蛋白4(AQP4)110例,其中视神经脊髓炎19例,复发性视神经炎(RON)17例,纵形扩展性脊髓炎(LETM)13例,多发性硬化(MS)31例,健康对照(HC)30例;对其检测的阳性率和滴度进行分析,并比较滴度与脊髓病变长度的相关性。【结果】大部分样本用两种方法检测的滴度之间都缺乏一致性。NMO组患者NMO-IgG/抗AQP4抗体鼠脑法(63.2%,12/19),细胞法(89.5%,17/19),RON组鼠脑法(47.1%,8/17),细胞法(70.6%,12/17),LETM组鼠脑法(46.2%,6/13),细胞法(69.2%,9/13),MS组鼠脑法(6.5%,2/31),细胞法(9.7%,3/31)。鼠脑法和细胞法检测所得到的NMOSD患者NMO-IgG/AQP4抗体滴度均和脊髓病变的长度无线性相关性,两种检测方法之间也缺乏滴度线性相关性。【结论】鼠脑法和细胞法检测抗体滴度的不一致性提示有必要进行多因素相关性研究以探讨影响两种检测方法抗体滴度的因素。     

小鼠侧脑室注射卡介苗诱导NMO-IgG/AQP4抗体的表达

【目的】 通过小鼠侧脑室注射卡介苗(BCG)致中枢神经系统结核分枝杆菌(MTB)感染,检测小鼠血清中是否有视神经脊髓炎(NMO)-IgG/水通道蛋白4(AQP4)-Ab的表达? 【方法】 雌性C57BL/6J小鼠40只,6 ~ 8周,随机分为4组:5 × 106 CFU BCG组?1 × 106 CFU BCG组?0.01 mol/L PBS组?正常组?右侧侧脑室注射,注射后1周脑室注射追加1次?小鼠BCG注射后第7?14?21?28天,分别取血并检测血清中NMO-IgG/AQP4-Ab?注射后第28天处死小鼠行抗酸杆菌培养,并对脑和脊髓进行HE?抗酸?LFB髓鞘染色,免疫组化检测病灶处AQP4?GFAP的表达及C5b9沉积情况?【结果】 脑室注射后,BCG组小鼠行为活动降低,出现肢体瘫痪,甚至死亡,其中5 × 106 CFU BCG组表现严重,死亡率高?注射卡介苗21 d时小鼠血清检测发现5 × 106 CFU BCG组中2 只小鼠血清NMO-IgG/AQP4-Ab阳性,1 × 106 CFU BCG组中4只小鼠血清中抗体阳性?第28天时5 × 106 CFU BCG组的两只血清阳性的小鼠死亡,1 × 106 CFU BCG组中原抗体阳性的小鼠血清中抗体仍为阳性?病理检测显示脑和脊髓出现炎性细胞浸润,病灶处抗酸染色阳性,出现脱髓鞘改变?组织培养3周后可见MTB生长,免疫组化显示病灶区域AQP4?GFAP表达降低,部分炎性细胞及血管周围出现补体C5b9沉积?【结论】 中枢神经系统MTB直接感染可诱导产生NMO-IgG/AQP4-Ab?     

水通道蛋白4慢病毒表达载体的构建与临床应用

目的 构建水通道蛋白4(AQP4)慢病毒表达载体,并检测视神经脊髓炎(NMO)患者血清中的抗AQP4抗体.方法 从人胶质母细胞瘤中提取RNA,通过RT-PCR获得人AQP4目的片段,将目的片段克隆到慢病毒表达载体中,转染HEK-293T细胞,通过RT-PCR、Western印迹及细胞免疫荧光检测鉴定AQP4表达,并对人血清中抗AQP4抗体初步检测.结果 质粒测序结果与Genbank中人AQP4编码片段完全相符,转染人AQP4的HEK-293T细胞能稳定表达AQP4.细胞免疫荧光法检测12例NMO患者血清,11例阳性(91.7%);34例多发性硬化阳性4例(11.8%);50名健康人群血清均为阴性.结论 HEK-293T细胞经水通道蛋白4慢病毒表达载体转染后能够稳定表达AQP4,可用于临床NMO患者抗AQP4-抗体的检测.     

视神经脊髓炎谱系病病人血清AQP4-IgG水平及其临床意义

目的:探讨视神经脊髓炎谱系病(NMOSD)病人血清水通道蛋白4-抗体(AQP4-IgG)水平与临床特征的相关性.方法:选取确诊的NMOSD病人38例,记录扩展残疾状态量表(EDSS)评分,采用间接免疫荧光法检测血清AQP4-IgG水平,分析其水平与临床症状、影像学表现的相关性.结果:AQP4-IgG抗体阳性组23例(60.5%),阴性组15例(39.5%),阳性组EDSS评分显著高于阴性组(P<0.05);Spearman相关性分析发现,血清AQP-4 IgG与EDSS评分、脊髓受累节段数均呈正相关关系(P<0.01).抗体阳性组3例复发,阴性组无复发病例.结论:NMOSD AQP4-IgG抗体阳性病人神经功能缺损症状重,且抗体水平越高,脊髓受累节段多,预后较差,较AQP4-IgG抗体阴性病人易复发.     

rAQP4-M1真核表达载体的构建及在CHO细胞中的表达

目的 构建rAQP4-M1基因真核表达载体,建立稳定转染AQP4-M1的CHO细胞系.方法 应用RT-PCR从大鼠脑组织中扩增rAQP4-M1,并将PCR产物双酶切后插入到pcDNA3.1(+)真核表达载体中,经过菌落PCR、双酶切及测序验证的pcDNA3.1(+)/rAQP4-M1质粒通过脂质体转染CHO细胞.G418筛选建立稳定转染rAQP4-M1的CHO细胞系.采用细胞免疫荧光和免疫印迹技术检测rAQP4-M1在该细胞系中的表达.结果 成功构建了pcDNA3.1(+)/rAQP4-M1表达质粒,建立了稳定转染的CHO细胞系.免疫荧光检测结果显示,rAQP4-M1在CHO细胞膜上稳定表达;免疫印迹检测可见34×103处的阳性条带,表明rAQP4-M1在该细胞系中成功表达.蓝绿温和胶电泳技术证实了rAQP4-M23而不是rAQP4-M1参与了正交排列颗粒(orthogonal arrays of particles,OAPs)的形成.结论 rAQP4-M1在CHO细胞系中稳定表达成功,rAQP4-M1未参与OAPs的形成.     

质粒构象对转染后蛋白表达时间曲线的影响

目的探讨质粒的不同构象下磷酸钙转染后对蛋白表达量时间曲线的影响。方法经过处理的pcDNA3-MADCAM-1-Fc,pcDNA3.1/Hygro（＋）-Alpha4,pcDNA3.1/Hygro（＋）-Beta7三种质粒磷酸钙转染293T细胞,第一种表达分泌到胞外的蛋白通过收集上清,ProteinA纯化,另外两种表达于细胞外膜,通过流式细胞仪检测荧光强度。结果 pcDNA3-MADCAM-1-Fc磷酸钙转染后处理组（缺口开环）比对照组表达蛋白量多（t=5.009,p=0.0376）。pcDNA3.1/Hygro（＋）-Alpha4,pcDNA3.1/Hygro（＋）-Beta7两种质粒共转后处理组荧光强度36h后略高于对照组,48h后对照组明显升高。结论质粒的不同构象下磷酸钙转染后蛋白表达量有时间依赖性。     

甲型流感病毒M2基因真核表达载体的构建及初步表达

目的:构建含有甲型流感病毒M2基因的真核表达载体。体外转染真核细胞株HEK293细胞并检测目的蛋白的表达。方法:从接种人流感病毒株A/PR/8/34(H1N1)的鸡胚尿囊液中提取病毒RNA,用特异引物进行RT-PCR,扩增M2基因。通过分子克隆技术将所扩增片段插入真核表达质粒载体pcDNA3.1(+)。经酶切及PCR鉴定后用PolyFect脂质体将其转染到HEK293细胞中,通过免疫荧光技术鉴定其表达。结果:经双酶切、PCR及测序鉴定证实M2基因的真核表达载体构建成功。免疫荧光技术证实流感病毒M2基因的表达。结论:甲型流感病毒M2蛋白是一种具有高保守性,可形成离子通道并影响流感病毒表面蛋白血凝素(HA)天然构象的形成,被认为是具有交叉免疫保护性的结构蛋白。甲型流感病毒M2基因真核表达质粒的构建及成功表达将为甲型流感病毒基因工程疫苗,通用疫苗和核酸疫苗的研究打下基础。     

重组GSTP1真核表达质粒的构建及稳定转染NCI-H520细胞系的建立

目的构建pcD N A3.1(+)/G STP1真核表达载体并将其稳定转染到肺鳞癌细胞N C I-H 520中,建立稳定转染的N C I-H 520细胞系,为后续研究奠定基础。方法以pD N R-LIB-G STP1为模板,用PC R扩增G STP1 cD N A的编码区,并将扩增的cD N A片段与载体连接后亚克隆到真核表达载体pcD N A3.1(+)中。重组子经酶切分析及测序鉴定后,用脂质体转染技术将其导入到人肺鳞癌细胞系N C I-H 520,经G 418筛选并建立稳定的转染细胞株,应用W estern blotting检测转染前后该细胞株G STP1基因在蛋白水平的表达。结果 pcD N A3.1(+)/G STP1经酶切鉴定及D N A测序证实序列完全正确,真核表达载体构建成功;经W estern blotting检测,重组质粒转染株中G STP1基因的蛋白表达水平明显高于对照组,证实G STP1基因已稳定转染到N C I-H 520细胞中并得到表达。结论成功构建了pcD N A3.1(+)/G STP1真核表达质粒,建立了稳定表达G STP1的N C I-H 520细胞系,为进一步研究G STP1的生物学功能奠定了基础。     

甲状旁腺素受体真核表达载体的构建及稳定转染HEK293细胞系的建立

目的构建小鼠甲状旁腺素受体（PTHR）及其突变受体（DSEL）全长结构基因真核表达载体,建立稳定高表达PTHR及
DSEL的HEK293细胞系,以应用于甲状旁腺素（PTH）模拟肽活性药物筛选及其信号通路的研究。方法通过双酶切、胶回收方
法分别纯化目的片段(PTHR、DSEL基因)和质粒pcDNA3.1（+）,二者分别由DNA限制性内切酶EcoRⅠ与Not Ⅰ双酶切,经T4
DNA Ligase连接的方法将PTHR、DSEL基因克隆到质粒表达载体pcDNA3.1（+）中,采用测序方法及DNA限制性内切酶EcoR
Ⅰ与Not Ⅰ双酶切方法鉴定重组质粒,脂质体转染法将重组体pcDNA3.1（+）-PTHR、pcDNA3.1（+）-DSEL及空质粒pcDNA3.1
（+）分别转染至HEK293细胞,经G418筛选抗性细胞克隆,、RT-PCR及ELISA检测转染细胞PTHR、DSEL的表达情况。结果重
组质粒经基因测序及DNA限制性内切酶EcoRⅠ与Not Ⅰ双酶切证实质粒表达载体pcDNA3.1（+）-PTHR、pcDNA3.1（+）- DSEL
构建正确。重组体经脂质体法转染HEK293 48 h后,经G418筛选3周得到细胞抗性克隆,ELISA检测到PTHR、DSEL基因在
重组质粒表达载体pcDNA3.1（+）-PTHR、pcDNA3.1（+）-DSEL转染的HEK293中成功表达。RT-PCR方法检测到PTHR、DSEL
基因在转录水平的表达。ELISA方法检测到重组质粒转染的HEK293中,加入甲状旁腺激素刺激后,PLC、cAMP蛋白表达量远高
于空质粒pcDNA3.1（+）转染的HEK293中PLC、cAMP的表达。结论成功构建了稳定高表达PTHR、DSEL的HEK293细胞,该
稳定转染细胞系的建立为进一步研究甲状旁腺素受体下游信号通道的分子机制以及筛选其模拟肽作用的活性奠定了实验基础。
     

人pcDNA3.1(+)-Cav-1真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建pcDNA3.1 (+)-Cav-1真核表达载体,建立稳定转染pcCav-1的6-10B细胞系(6-10B-Cav-1).方法 提取5-8F细胞总RNA,利用RT-PCR获取caveolin-1(Cav-1)开放读码框(Open reading frame,ORF)序列构建Cav- 1/TA亚克隆载体,再将双酶切后的目的片段连入pcDNA3.1(+)真核表达载体并转染6-10B细胞.结果 RT-PCR扩增Cav-1基因ORF序列在783 bp附近见目的条带;质粒酶切鉴定及菌落PCR鉴定分别在783 bp及346 bp附近见目的条带;转染6-10B细胞后,转染组与对照组相比,Cav-1在mRNA水平表达差异具有统计学意义(P =0.027),在蛋白质水平前者比后者高出2倍以上.结论 人Cav-1重组真核表达载体pcDNA3.1( +)-Cav-1构建成功并获得稳定表达Cav -1的6-10B细胞,为进一步检测C av -1在鼻咽癌转移过程的作用奠定基础.     

汉坦病毒包膜糖蛋白基因核酸免疫的初步研究

目的将克隆有汉坦病毒包膜糖蛋白基因M片段及G1、G2基因的重组质粒免疫动物，了解上述目的基因在核酸疫苗中的应用价值。方法大量制备已构建好的pcDNA3．1-M、pcDNA3．1-G1、pcDNA3．1-G2重组质粒DNA及对照空质粒pcDNA3．1。然后用这四组质粒DNA通过肌肉注射的方法免疫6～8周龄的BALB／c小鼠（每组5只），每4周免疫一次，共免疫3次，每次免疫前及最后一次免疫后2周断尾取血，用免疫荧光的方法检测基因免疫的体液免疫应答效果。结果重组质粒pcDNA3．1-G1免疫小鼠有4只血清抗汉坦病毒抗体为阳性，重组质粒pcDNA3．1-G2以及重组质粒pcDNA3．1-M免疫小鼠各有1只血清抗汉坦病毒抗体为阳性。结论汉坦病毒糖蛋白基因核酸免疫动物后可刺激机体产生特异性的体液免疫应答。     

大鼠CB1基因真核表达载体的构建及其对CaSki细胞凋亡的影响

目的 构建大鼠CB1(rCB1)基因真核表达载体 ，检测rCB1基因在细胞中的表达，研究rCB1对Caski细胞凋亡的影响。方法 从大鼠脑组织中提取总RNA，RT-PCR扩增rCB1基因, 通过酶切、纯化、连接PCR纯化产物与pCDNA3.1( )质粒，构建pcDNA3.1( )-rCB1。脂质体法将其转染到HEK293和Caski细胞，Western blot及细胞免疫荧光联合激光扫描共聚焦方法检测CB1的表达及定位，流式细胞仪检测细胞凋亡率，Western blot与实时荧光定量PCR检测rCB1、Bcl-2、Bax、Bad的表达。结果 酶切重组质粒获得5300bp的载体片段和1500bp的目的片段，测序结果和rCB1基因序列（NM_012784.4）一致。转染HEK293细胞后， rCB1在HEK293细胞细胞膜和细胞质表达。转染Caski细胞后， rCB1使细胞凋亡率增加（P<0.05）； rCB1基因上调Bax、Bad的表达，同时抑制Bcl-2的表达，与空白组比较，其差异具有统计学意义（P<0.05）。结论 成功构建了pcDNA3.1( )/rCB1真核表达载体, rCB表达于细胞膜和细胞质， rCB1可以明显促进宫颈癌Caski细胞的凋亡，其机制是上调Bax、Bad和抑制Bcl-2的表达。     

Construction of eukaryotic expressing plasmids encodingHA andHA 1 of influenza A virus and their transient expression in HEK293 cells

Summary In order to explore the feasibility and protective efficiency of influenza DNA vaccine, we constructed eukaryotic expressing plasmids encodingHA andHA ₁ of influenza A virus (A/PR/8/34) and studied their expression in HEK293 cells.HA andHA ₁ genes were amplified by RT-PCR and cloned into pcDNA3. 1(+) to generate pcDNA3. 1(+)/HA and pcDNA3.1(+)/HA₁, respectively. After verification of the cloning fidelity by restriction endonuclease digestion, PCR, and sequencing, pcDNA3. 1(+)/HA and pcDNA3.1(+)/HA₁ were transfected into HEK293 cells using PolyFect Transfection Reagent. Immunofluorescence assay was used to detect the transient expressing cells. Fluorescence microscopy revealed strong expression of target gene in HEK293 cells transiently transfected with either pcDNA3.1(+)/HA or pcDNA3.1(+)/HA₁. Therefore, the results confirm the successful construction of eukaryotic expressing plasmids capable of driving the eukaryotic expression of influenza virus antigen HA and HA₁, which is likely to provide a basis for both further investigation of the mechanism of influenza viral infection and the development of influenza DNA vaccine. Zhang Weidong, female, born in 1970, M. D., Ph. D. This project was supported by a grant from the National Natural Sciences Foundation of China (No. 39970830).