单纯Ⅱ型胶原酶消化法分离、培养人退变椎间盘髓核细胞的形态学观察

目的:探讨单纯Ⅱ型胶原酶消化法体外培养扩增人退变椎间盘髓核细胞的可行性。方法:收集20例人退变椎间盘髓核,单纯Ⅱ型胶原酶消化分离出髓核细胞并连续培养传代,倒置相差显微镜和HE染色观察细胞形态学变化,甲苯胺蓝染色检测髓核细胞内聚集蛋白聚糖的表达,免疫细胞化学法行Ⅱ型胶原染色,观察髓核细胞的类软骨表型表达情况。结果:单纯Ⅱ型胶原酶消化法可较好的分离培养人退变椎间盘髓核细胞,20例人退变椎间盘髓核,培养成功16例;原代髓核细胞平均7d贴壁,呈类圆形或多角形,P1代髓核细胞平均12h贴壁,呈大梭形或多角形,两代细胞融合95%所需时间分别为30d和7d,差异有统计学意义(P0.01);聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原主要表达于原代和P1代髓核细胞浆内,被甲苯胺蓝染成天蓝色,免疫细胞化学染色主要表现为黄褐色沉淀,两代间聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的表达无统计学差异(P0.05)。结论:单纯Ⅱ型胶原酶消化法可简化髓核细胞分离步骤,提高培养效率;传一代后髓核细胞增殖速率提高,但仍维持类软骨表型,表达聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原。     

非接触共培养条件下山羊BMSCs向纤维环样细胞诱导分化的研究

[目的]建立山羊骨髓源性间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)和纤维环细胞(annulus fibrosus cells,AFCs)非接触共培养体系,探讨BMSCs向纤维环样细胞诱导分化潜能,为组织工程修复纤维环缺损研究提供种子细胞。[方法]复苏第3代AFCs和BMSCs,观察细胞形态并绘制生长曲线。采用Transwell系统共培养AFCs和BMSCs,7 d后,检测BMSCs向纤维环样细胞分化情况。通过甲苯胺蓝染色检测聚集蛋白聚糖的表达,通过免疫细胞化学法检测Ⅰ型胶原蛋白的表达,realtime PCR检测Ⅰ型胶原、聚集蛋白聚糖和Sox-9 mRNA表达。[结果]非接触共培养7 d后,BMSCs形态转变为纤维环细胞样。非接触共培养组中BMSCs的聚集蛋白聚糖与Ⅰ型胶原染色呈阳性,与AFCs对照组结果一致,BMSCs对照组结果呈阴性。与AFCs对照组相比,共培养组中Ⅰ型胶原、聚集蛋白聚糖及Sox-9的mRNA表达量分别为0.86、1.13和0.91(P>0.05),而BMSCs对照组中未检测到其表达。[结论]建立稳定的山羊AFCs和BMSCs非接触共培养体系,共培养7 d后,BMSCs具有AFCs特性,表明共培养条件促进BMSCs诱导分化为纤维环样细胞。     

大鼠髓核细胞来源外泌体对骨髓间充质干细胞向髓核样细胞分化的作用研究

目的:探讨大鼠髓核细胞来源外泌体对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)向髓核样细胞分化的作用。方法:采用贴壁法体外分离培养SD大鼠尾椎椎间盘髓核细胞和BMSCs,流式细胞术和三系分化实验鉴定BM-SCs。差速离心法分离髓核细胞外泌体,透射电镜观察其形态并使用蛋白免疫印迹(Western blot)检测其蛋白标志物CD81、Tsg101。分别使用荧光探针CM-DIO和CM-DIL标记BMSCs和髓核细胞外泌体,将两者共培养24h后在荧光显微镜下观察BMSCs对髓核细胞外泌体摄取情况。将第三代BMSCs分为三组:外泌体组,加入髓核细胞外泌体(50μg/ml);共培养组,与髓核细胞非接触式共培养;对照组,未做任何处理。分别于7、14、21d时应用荧光定量PCR(qRT-PCR)检测外泌体组和对照组Ⅱ型胶原(COL2A1)、蛋白多糖(ACAN)、SOX9的m RNA表达量。14d时应用qRT-PCR检测3组的COL2A1、ACAN、SOX9的m RNA表达量。结果:提取的第三代大鼠髓核细胞呈多角形或不规则形状,第三代BMSCs呈形态均一的长梭形。BMSCs高表达CD29(99.77%)、CD44(93.97%)、CD90(99.67%),低表达CD34(0.82%)、CD45(0.68%)。BMSCs成骨、成脂、成软骨诱导后染色均为阳性。透射电镜观察外泌体为30～100nm类圆形双层膜结构,其表达CD81、Tsg101蛋白,不表达Calnexin蛋白。荧光显微镜下CM-DIL标记的外泌体可被CM-DIO标记的BMSCs摄取。诱导7、14、21d后,外泌体组的COL2A1、ACAN、SOX9 mRNA表达量均显著高于对照组(P0.05)。14d时共培养组COL2A1、ACAN、SOX9的m RNA表达量均显著高于对照组,低于外泌体组(P0.05)。结论:大鼠髓核细胞外泌体可在体外诱导BMSCs向髓核样细胞分化,且诱导效果优于与髓核细胞的非接触式共培养,可为椎间盘组织工程提供一种有效的髓核细胞来源。     

兔骨髓间充质干细胞与髓核细胞共培养后的营养效应和类髓核分化效应

目的:探讨兔骨髓间充质于细胞(BMMSCs)与髓核细胞(NPCs)共培养时BMMSCs的营养效应和类髓核分化效应及其动态变化规律.方法:应用1月龄新西兰大白兔的骨髓和髓核进行BMMSCs及NPCs的分离培养与鉴定,建立3个细胞培养组,BMMSCs与NPCs共培养组(实验组),BMMSCs单独培养组和NPCs单独培养组作为对照组.在培养的不同时间点(3、6、9、12、15、18、21d)分别检测细胞培养上清液中转化生长因子β1(TGFβ1)、血小板衍化生长因子(PDGF)的含量变化及BMMSCs与NPCs的增殖能力,采用RT-PCR法检测培养不同时间点BMMSCs与NPCs的蛋白聚糖Aggrecan及Ⅱ型胶原蛋白mRNA的表达变化.结果:分离培养的两种细胞经鉴定分别为BMMSCs及NPCs.从第3天开始的各个时间点,实验组上清液中TGFβ1、PDGF的含量较两对照组明显增高(P<0.05),且随时间的延长而逐渐增高,第15天达最高,TGFβ1、PDGF分别达815.81±25.69pg/ml和494.28±20.01pg/ml,此后第18d、21d逐渐下降.实验组细胞DNA含量在各个时间点上均较两对照组明显升高(P<0.05).从第3天开始的各个时间点,实验组NPCs的蛋白聚糖Aggrecan及Ⅱ型胶原mRNA的表达较对照组高(P<0.05);同时从第15天开始至第21天,实验组BMMSCs的蛋白聚糖Aggrecan及Ⅱ型胶原mRNA的表达较对照组高(P<0.05).结论:BMMSCs与NPCs共培养时BMMSCs可通过表达TGFβ1、PDGF等细胞因子发挥其营养效应,激活NPCs.促进其增殖及细胞外基质的合成;在共培养后期,BMMSCs在髓核局部微环境下,可发挥其类髓核分化效应,开始合成蛋白聚糖Aggrecan及Ⅱ型胶原蛋白.     

CDMP-1诱导骨髓间充质干细胞分化成髓核细胞的实验研究

目的探讨软骨衍生形态发生蛋白-1(CDMP-1)能否诱导骨髓间充质干细胞(BMSCs)向髓核细胞分化,并检测其诱导的细胞是否具有髓核细胞分泌细胞外基质的功能。方法 BMSCs采用0 ng/ml(对照组)以及10 ng/ml(观察组)的CDMP-1处理,将正常椎间盘髓核细胞作为阳性对照组。BMSCs诱导后采用PCR检测Ⅰ型、Ⅱ型胶原基因水平表达,用Western Blot法检测Ⅱ型胶原蛋白水平的表达。采用阿尔辛蓝染色及定量比较蛋白多糖含量的变化。结果 PCR检测结果发现,观察组和对照组中Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原均有增加,而阳性对照组中Ⅱ型胶原明显比观察组更少。基因水平检测结果发现,CDMP-1诱导BMSCs分化后Ⅱ型胶原基因表达比正常髓核细胞还高。观察组中Ⅱ型胶原的蛋白水平表达明显比阳性对照组和对照组细胞更高,对照组中Ⅱ型胶原蛋白水平表达几乎很少。阿尔辛蓝染色结果发现,观察组蛋白多糖含量稍高于阳性对照组,但差异无统计学意义(P0.05);阳性对照组与观察组蛋白多糖含量均高于对照组,差异有统计学意义(P 0.05)。结论 CDMP-1能够诱导BMSCs向髓核细胞分化,具有髓核细胞分泌细胞外基质的功能。     

非接触式共培养下两种同源间充质干细胞对退变髓核细胞生物学影响的比较研究

【摘要】 目的：比较非接触式共培养条件下两种同源间充质干细胞对退变髓核细胞生物学功能的影响。方法：取同一腰椎间盘突出症患者骨髓间充质干细胞（BMSCs）、脂肪间充质干细胞（ADSCs）和退变髓核细胞（NPCs）,两种间充质干细胞分别与髓核细胞在Tanswell 6孔板中进行非接触式共培养,与ADSCs共培养的NPCs为A组,与BMSCs共培养的NPCs为B组,以单独培养的NPCs为对照组。共培养7d后,提取3组髓核细胞总RNA,进行反转录后,利用Real-Time PCR检测其Ⅱ型胶原、蛋白多糖和SOX-9基因的相对表达量。结果：非接触式共培养7d后,Ⅱ型胶原、蛋白多糖和SOX-9基因相对表达量对照组分别是1.03±0.28、1.21±0.40和0.94±0.34,A组分别是3.49±0.55、3.88±2.11和2.41±0.91,B组分别是7.60±1.89、6.26±2.96和4.55±1.88。与对照组相比,A、B组髓核细胞Ⅱ型胶原、蛋白多糖和SOX-9基因相对表达显著增加（P<0.05）;A、B两组间相比也有显著性差异（P<0.05）。结论：非接触式共培养条件下骨髓间充质干细胞和脂肪间充质干细胞对退变髓核细胞均有一定的激活效应;骨髓间充质干细胞对退变髓核细胞的激活效应更强,可能更加适合于椎间盘退行性疾病的生物学治疗。     

人软骨终板干细胞与退变髓核细胞体外非接触共培养的实验研究

目的:探究人软骨终板干细胞(cartilage endplate stem cells,CESCs)与退变髓核细胞(nucleus pulposus cells,NPCs)在Transwell非接触共培养条件下的相互作用。方法:对取自因腰椎退行性疾病行腰椎间盘切除椎弓根螺钉内固定患者的软骨终板、退变髓核进行CESCs及NPCs的分离培养及鉴定。通过琼脂糖悬浮培养法获得CESCs的克隆,扩增后行流式技术及免疫荧光对CESCs进行干细胞表面标记的检测,取第三代CESCs与第一代NPCs进行实验,建立三个细胞培养组:CESCs单独培养组、NPCs单独培养组、CESCs与NPCs共培养组(分别接种于Transwell底部和上层插槽中进行非接触共培养)。在培养之后的不同时间点(3、5、7d),采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR,RT-PCR)检测各组细胞中蛋白聚糖(Agg)、SOX-9及Ⅱ型胶原蛋白(CollⅡ)m RNA的表达变化情况,共培养7d后,采用Western-blot检测各组细胞中蛋白聚糖、Ⅱ型胶原蛋白、Sox-9蛋白的表达变化。结果:经过分离培养及鉴定,筛选出的细胞为CESCs(流式细胞计数分析,CESCs细胞表面的CD73、CD90、CD105阳性率分别为97.5%、98.7%、98.7%);共培养后,RT-PCR显示单独培养的CESCs在各检测时间点几乎无Agg、CollⅡ、SOX-9基因表达;而共培养组的CESCs在第5天开始出现Agg、CollⅡ、SOX-9基因表达(其表达量分别为0.10、0.11、0.15),与单独培养CESCs相比有统计学意义(P0.05);共培养组NPCs的Agg、CollⅡ及SOX-9基因表达量(其表达量分别为1.32、1.25、0.92)高于单独培养NPCs的表达量(P0.05),且随着时间延长逐渐升高,共培养与单独培养相比,差异有统计学意义(P0.05)。共培养7d后,Westernblot结果与RT-PCR结果一致,共培养组CESCs的Agg、CollⅡ、SOX-9蛋白表达量高于单独培养组(P0.05)。结论:CESCs与NPCs共培养时的相互作用能促使CESCs表达髓核细胞特异性标记物Agg、CollⅡ和SOX-9;通过相互作用,CESCs可增强NPCs表达自身特异性相关分子。     

CDMP-1促进成人骨髓间充质干细胞成软骨分化的研究

目的 探讨软骨源性形态发生蛋白1(CDMP-1)诱导成人骨髓间充质干细胞(BMSCs)向软骨细胞分化的可行性及最佳诱导浓度.方法 分离培养BMSCs,免疫荧光法检测BMSCs表面CD34,CD45,CD105表达.采用含0、10、50、100ng/ml CDMP-1的软骨诱导液诱导培养BMSCs 21 d,倒置显微镜观察细胞形态变化;RT-PCR检测不同浓度CDMP-1组细胞Ⅱ型胶原和Aggrccan表达:免疫组化检测Ⅱ型胶原表达;番红O和阿利新蓝染色检测蛋白多糖表达.结果 成人BMSCs呈梭形漩涡状生长,CD44、CD105表达阳性,CD34呈阴性表达.CDMP-1诱导7 d后细胞形态逐渐由长梭形向多边形、多角形转化.不同浓度CDMP-1诱导21 d,Ⅱ型胶原表达量各组间差异均具有统计学意义(P<0.05);Aggrecan的表达CM组和10 ng组之间差异无统计学意义(P>0.05),其他各组间差异均具有统计学意义(P<0.05).免疫组化检测Ⅱ型胶原表达阳性,阿利新蓝和番红O染色均为阳性.结论 含100 ng/mJ CDMP-1软骨诱导液能有效促进成人BMSCs向软骨表型分化.     

接触式细胞共培养诱导人脐带华通胶间充质干细胞向类髓核细胞分化

目的:观察接触式细胞共培养条件下,人髓核细胞对脐带华通胶间充质干细胞(Wharton′s jelly-derived mesenchymal stem cells,WJMSCs)的诱导分化效应,为椎间盘退变性疾病的治疗寻找种子细胞来源。方法:取足月产健康新生儿脐带约30cm,分离、纯化、培养WJMSCs;取人椎间盘髓核组织,酶消化法分离培养髓核细胞。取第三代稳定增殖的WJMSCs,利用流式细胞方法检测细胞免疫表型CD73/CD90/CD105/CD34/CD45/HLA-ABC/HLA-DR。用羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记WJMSCs,与髓核细胞以1∶1比例进行混合,在6孔板中进行接触式细胞共培养;以单独培养的WJMSCs为对照组。培养7d后利用高速流式细胞仪分选荧光标记阳性的WJMSCs,提取细胞总RNA,进行反转录获得cDNA,利用Real-Time PCR方法检测其Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原、Ⅵ型胶原、蛋白多糖、SOX-9和多能聚糖基因的相对表达,管家基因GAPDH作为内参,单独培养的WJMSCs作为对照,利用2-ΔΔCt方法计算基因相对表达变化。结果:WJMSCs原代细胞接种24h可见部分细胞贴壁生长,形态为梭形和多角形,1周后形成集落,2周时细胞融合达到90%。流式细胞检测结果显示CD73/CD90/CD105/和HLA-ABC(+),CD34/CD45和HLA-DR(-)。与髓核细胞共培养7d后WJMSCs的Ⅱ型胶原、蛋白多糖和SOX-9基因相对表达较对照组显著性增加(P<0.01),Ⅰ型胶原、Ⅵ型胶原和多能聚糖基因相对表达未见显著性变化(P>0.05)。结论:通过接触式细胞共培养人脐带WJMSCs能够被髓核细胞诱导分化为类髓核细胞,可为组织工程技术和细胞治疗修复退变椎间盘提供种子细胞来源。     

重组2型腺相关病毒-人骨形成蛋白7转染犬髓核细胞及其对髓核细胞表型的影响

目的:观察重组2型腺相关病毒-人骨形成蛋白7(recombinant adeno-associated virus-2expressinghuman bone morphogenetic protein-7,rAAV2-hBMP7)转染犬髓核细胞情况及其对细胞表型的影响。方法:用1岁龄Beagle犬L4/5椎间盘髓核进行髓核细胞体外培养,取第2代髓核细胞进行实验,实验组以rAAV2-hBMP7(1×105v.g/细胞)转染髓核细胞,对照组以重组2型腺相关病毒-增强型绿色荧光蛋白(recombinantadeno-associated virus-2expressing enhanced green fluorescent protein,rAAV2-EGFP)转染髓核细胞。在转染后4d、7d和14d以PCR检测髓核细胞中hBMP7的mRNA表达,在转染后7d和14d以Western blot法检测髓核细胞中hBMP7蛋白表达。在转染后4d、7d和14d采用RT-PCR法检测蛋白多糖、Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原的mRNA含量,采用二甲基蓝及ELISA法分别检测蛋白多糖、Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原的蛋白含量。结果:实验组髓核细胞表达hBMP7 mRNA及蛋白,并于转染后7d时表达量最高,而对照组无表达。实验组髓核细胞蛋白多糖mRNA及蛋白含量在转染后7d和14d时较4d时明显增高,14d时较7d时亦明显升高(P0.05),对照组各时间点无统计学差异(P0.05);4d时实验组与对照组比较无明显差异,7d和14d时较对照组明显增加(P0.05)。同组各时间点Ⅰ型胶原mRNA及蛋白含量均无统计学差异,两组各时间点间比较无统计学差异(P0.05)。实验组髓核细胞Ⅱ型胶原mRNA及蛋白含量在转染后7d和14d时较4d时明显增高,14d时较7d亦明显升高(P0.05),对照组各时间点无统计学差异(P0.05);实验组4d时与对照组比较无明显差异,7d和14d时较对照组明显增加(P0.05)。结论:rAAV2-hBMP7转染犬髓核细胞后能表达hBMP7蛋白,并能提高其蛋白多糖及Ⅱ型胶原含量。     

脊索细胞促进髓核软骨样细胞增殖及表型维持

目的分离纯化兔髓核中的细胞成分，观察脊索细胞形态及对软骨样细胞增殖及细胞表型的影响。方法6只4周龄新西兰兔胸腰段脊柱，获取髓核，0．2％Ⅱ型胶原酶消化法及不连续密度梯度法分离纯化脊索细胞及软骨样细胞。实验分为单纯软骨样细胞培养组（A组）及脊索细胞、软骨样细胞（1：1）共培养组（B组）。倒置相差显微镜观察两组细胞生长情况，测定两组原代及传代细胞成活率，MTT法测定两组第2代细胞增殖曲线，并以甲苯胺蓝染色和免疫细胞化学染色鉴定两组原代及传代细胞蛋白多糖及Ⅱ型胶原的表达。结果成功分离、纯化脊索细胞和软骨样细胞。细胞培养观察，原代脊索细胞直径10～15gm，胞浆内富含大小不等的囊泡；原代软骨样细胞直径4～6gm，胞浆内无囊泡。各代细胞成活率A组为89．0％～95．3％，B组为91_3％～96．3％，各代细胞成活率两组间比较差异无统计学意义（P〉0．05）。A组细胞培养3～4d进入对数生长期，B组细胞培养2d后进入对数生长期；培养4d后，B组细胞增殖能力高于A组，差异有统计学意义（P〈0．05）。A组3代以内细胞表达蛋白多糖及Ⅱ型胶原，B组细胞表型维持至5代。结论脊索细胞能促进髓核软骨样细胞的增殖及表型维持；脊索细胞可能在防止椎间盘退变中具有重要意义。     

骨髓基质干细胞作软骨组织工程种子细胞研究

目的　综述近年来骨髓基质干细胞体外培养、定向分化为软骨细胞的条件及相关研究进展。方法　广泛查阅相关文献 ,对上述研究进展进行整理、综合和分析。结果　骨髓基质干细胞易于分离培养 ,体外增殖能力强 ,传代多次后仍保持有多分化潜能 ;体内成软骨能力明确 ;但骨髓基质干细胞定向分化的软骨细胞 ,不是终末分化阶段 ,而只是一个中间阶段。结论　骨髓基质干细胞以其自身多方面的特点已成为软骨组织工程的另一种可选择的种子细胞 ,但其进一步分化为成熟软骨细胞的条件尚需进一步研究。     

小鼠骨髓干细胞体外定向诱导为肝细胞样细胞的实验研究

目的来源于骨髓干细胞的有功能的干细胞,可能成为生物人工肝和肝细胞移植的细胞来源。我们建立恰当的体外诱导培养体系,促使骨髓干细胞转化为肝细胞。方法获取骨髓干细胞,建立以FGF、HGF、OSM、EGF为主的细胞诱导培养体系。在细胞分化过程中,观察细胞形态和数量的变化,RT-PCR检测基因表达的变化,免疫荧光染色技术在蛋白水平检测ALB和CK18表达情况。PAS染色检测其糖代谢功能。结果在诱导过程中,多极性的肝细胞样细胞在12 d内可以观察到,且其随着细胞分化过程逐渐增多、集落增大。诱导细胞在7 d内表达AFPmRNA并维持到第21天,但后期表达减弱;在7天内表达ALBmRNA和CK18mRNA,随着分化时间的延长,其表达不断增强;在14 d内表达TTRmRNA,随着分化时间的延长,其表达不断增强。免疫荧光染色进行定位:在诱导组,诱导21 d的细胞表达ALB和CK18,其中ALB表达于胞浆和胞膜,而CK18表达于胞浆。糖原染色发现诱导组中,细胞胞浆内出现大小不等的红染的糖原颗粒。结论我们建立的以细胞因子FGF、HGF、OSM、EGF为主的细胞诱导培养体系是有效的,通过诱导骨髓干细胞,我们获得了有部分肝细胞形态结构和功能的肝细胞样细胞。     

脂肪干细胞向血管平滑肌细胞诱导的实验研究

目的 研究人脂肪干细胞(adipose derived stem cells,ADSCs)在体外单层培养条件下诱导为血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)的可行性.方法 应用酶消化法消化人脂肪组织获得ADSCs,基础培养液培养传代,取第1代细胞用于诱导分化实验.实验分两组,ADSCs以含5 ng/mL TGF-a1及50 ng/mL PDGF-BB的M-199诱导液联合诱导,作为诱导组;以含10?S的M-199培养液培养ADSCs作为未诱导组.镜下观察细胞生长情况免疫荧光和RT-PCR方法 检测平滑肌细胞特异标记的表达情况;流式细胞仪检测诱导阳性率.结果 诱导组细胞形态形成平滑肌细胞特有的"峰-谷"生长模式,未诱导组细胞形态未发生改变,与原代ADSCs相似呈成纤维细胞样生长.诱导培养14 d,诱导组细胞体外扩增能力较未诱导组显著降低(P＜0.01).免疫荧光检测诱导组表达平滑肌特异标记a平滑肌肌动蛋白(a-smooth muscle actin,a-SMA)、平滑肌肌球蛋白重链(smooth muscle-myosin heavy chain,SMMHC)和Calponin,未诱导组无表达.细胞诱导前a-SMA、SM-MHC及Calponin阳性表达率分别为3.26%±1.31%、3.55%±1.60%、4.02%±1.81%;诱导组阳性表达率分别为48.13%±8.31%、45.33%±10.68%、39.13%±9.42%;诱导前、后差异有统计学意义(P＜0.01).RT-PCR检测诱导组表达平滑肌特异标记a-SMA、SM-MHC、Calponin和SM-22a,未诱导组无表达.结论 脂肪干细胞经体外培养及诱导后,呈明显的VSMCs特性,有可能成为血管组织工程新的种子细胞来源.     

间充质干细胞诱导分化椎间盘细胞的研究进展

目的综述关于间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)诱导分化椎间盘细胞的实验研究进展。方法广泛查阅国内外近期相关文献,对基础理论及实验研究进行总结及分析。结果国内外相关实验研究表明,MSCs具有诱导分化为椎间盘细胞表型的潜能。结论MSCs诱导分化椎间盘细胞有美好前景。     

干细胞:组织器官重建的理想种子细胞

目的阐述干细胞在组织器官重建中的重要性.方法根据研究成果,结合国内外文献,综述干细胞作为细胞治疗及组织工程的种子细胞应用的最新进展.结果干细胞是人体及其各种组织细胞的最初来源,具有高度自我更新能力、高度增殖和多向分化潜能、可植入性和重建能力等特征.无论胚胎干细胞还是成体干细胞均可作为良好的种子细胞,用来进行修复重建外科领域损伤的组织器官的修复和重建治疗,具有广阔的临床应用前景.结论干细胞在组织、器官的修复与功能重建中发挥重要作用,具有广泛的应用前景.深入研究及推广应用,将会大幅度提高临床治疗效果.     

胰岛素干预后脂肪来源干细胞分泌功能对HaCaT细胞生物学影响

目的 分离培养脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs),探讨胰岛素刺激前后其分泌因子的变化及对人角质形成细胞株HaCaT细胞生物学影响.方法 从腹部外科手术患者自愿捐献皮下脂肪组织中分离、培养ADSCs,取第3代ADSCs调整密度为5×104个/mL,采用1×10-7mol/L胰岛素刺激作为A组,以未加胰岛素刺激作为B组,培养3 d后收集两组ADSCs培养上清液(conditioned medium of ADSCs,ADSC-CM),ELISA法测定其VEGF、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)含量.取人角质形成细胞株HaCaT细胞培养,将第4代细胞根据培养液不同分为4组.A1组:含A组ADSC-CM和2%FBS各0.5 mL:B1组:含B组ADSC-CM和2%FBS各0.5 mL;C1组:1 mL含终浓度为1×10-7mol/L胰岛素的2%FBS;D1组:仅含2%FBS 1 mL.培养3 d采用MTT法测定HaCaT细胞增殖情况:培养12 h Annexin V-FITC双染测定细胞凋亡情况;培养0、12、24、36、48 h采用体外细胞划痕法测定其迁移能力.结果 A组VEGF、HGF含量分别为(643.28±63.57)、(929.95±67.52)pg/mL,B组分别为(286.52±46.68)、(576.61±84.29)pg/mL,组间比较差异有统计学意义(P＜0.05).细胞增殖测定A1、B1组吸光度值分别为0.881±0.039、0.804±0.041,与C1组(0.663±0.027)及D1组(0.652±0.042)比较,差异有统计学意义(P＜0.01);A1组高于B1组(P＜0.05).A1、B1组凋亡率分别为5.23%±1.98%、8.82%±2.59%,均低于C1组(31.70%±8.85%)和D1组(29.60%±8.41%),差异有统计学意义(P＜0.05),但B1组凋亡率高于A1组(P＜0.05).A1、B1、C1和D1组36 h迁移距离分别为(0.184 6±0.019 2)、(0.159 8±0.029 4)、(0.059 2±0.017 6)及(0.058 2±0.012 3)mm,48 h分别为(0.231 8±0.174 0)、(0.205 1±0.012 1)、(0.079 2±0.008 1)及(0.078 4±0.0117)mm,两时间点A1组和B1组距离明显大于C1组和D1组(P＜0.01),A1组大于B1组(P＜0.05);其他时间点迁移距离差异无统计学意义(P＞0.05).结论 胰岛素干预后ADSCs能更有效促进HaCaT细胞增殖、迁移和抑制凋亡.     

骨髓间充质干细胞向神经细胞定向分化的体外研究

目的　探讨骨髓间充质干细胞( marrow stromal stem cells,MSCs)向神经细胞定向分化中神经蛋白分子的表达情况。　方法　取第5～7代体外培养Wistar大鼠MSCs,以0 .5μmol/ L全反式视黄酸( all- trans retinoidacid,ATRA)预诱导2 4 h后,换用改良神经细胞培养基( modified neuronal medium,MNM)继续培养。在ATRA作用2 4 h及MNM作用2、6、9、18及36 h,免疫组织化学检测巢蛋白( Nestin)、神经元特异性核心抗原( neuron- specificnuclear protein,Neu N)、微管相关蛋白2 ( microtubule- associated protein 2 ,MAP- 2 )和胶质纤维酸性蛋白的表达情况。　结果　ATRA和MNM作用后,MSCs呈典型神经元样,伸出较多的突起和分支,形成网络。Nestin最先表达,ATRA作用2 4 h出现,Neu N其次,MNM作用2 h检测到,MAP- 2最晚,MNM作用9h检测到。Nestin在MNM作用18h后表达最强,其阳性率为92 .3%±3.4 % ;36 h后表达明显减弱,阳性率仅为12 .3%±3.4 % ,而其它标志蛋白则持续表达。　结论　ATRA和MNM能促进MSCs向神经前体细胞和神经元转化,神经蛋白分子的表达顺序与神经细胞发育过程一致,为研究神经细胞发育提供了一个较好的体外模型     

神经干细胞与血管内皮祖细胞共移植治疗缺血性脑卒中的研究进展

目的探讨神经干细胞（neural stem cells，NSCs）与血管内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）共移植治疗缺血性脑卒中应用的可能。方法检索并分析医学和生物医学数据库中与脑卒中干细胞治疗相关的NSCs与EPCs基础研究文献，并进行综述。结果NSCs与EPCs能向脑卒中损害区域趋化，局部微环境诱导两者启动神经新生与血管新生修复损伤，并且血管新生与神经新生能相互促进。结论NSCs和EPCs共移植为有效的解决缺血性卒中后神经元缺失与血管闭塞这两个病理损害提供了一种新的途径。     

雪旺细胞对不同年龄大鼠BMSCs分化的影响

目的 BMSCs具有多向分化潜能,在不同培养条件下能够向多种细胞分化,但年龄对BMSCs分化的影响尚不明确。探讨雪旺细胞(Schwann cells,SCs)形成的体外微环境对不同年龄大鼠BMSCs向神经元和少突胶质细胞分化的影响。方法从幼年(1月龄)Wistar大鼠预变性坐骨神经中分离纯化SCs,从幼年(1月龄)、成年(6月龄)、老年(12月龄)Wistar大鼠骨髓中提取BMSCs,均行免疫荧光鉴定。将第3代SCs与PKH26标记的第2代BMSCs在双层培养皿内等体积、等密度共培养,根据BMSCs来源不同将实验分为3组:A、B、C组SCs分别与幼年(1月龄)、成年(6月龄)、老年(12月龄)大鼠BMSCs共培养。倒置相差显微镜下观察分化过程中BMSCs形态变化,免疫荧光染色检测共培养后第7天BMSCs分化表达神经特异性烯醇化酶(neuron-specifi c enolase,NSE)和磷脂碱性蛋白(myelin basicprotein,MBP)的情况,ELISA法检测各组细胞共培养0、3、6、9、12 d培养液上清神经调节蛋白1(neuregulin 1,NRG1)的表达。结果实验成功分离并培养SCs和BMSCs,免疫荧光鉴定SCs呈S-100阳性表达,BMSCs呈CD29阳性表达、CD44阳性表达、CD90阳性表达。细胞共培养第7天倒置相差显微镜观察示,A组BMSCs胞体回缩,呈圆形或锥形,并带有突起,形态类似神经组织细胞;B、C组大部分BMSCs形态无明显改变。细胞共培养第7天免疫荧光染色示,A、B、C组BMSCs的NSE阳性表达率分别为22.39%±2.86%、12.89%±1.78%和2.69%±0.80%,MBP阳性表达率分别为16.13%±2.39%、6.33%±1.40%和0.92%±0.17%,各组间NSE阳性表达率和MBP阳性表达率比较差异均有统计学意义(P<0.05)。ELISA法检测示,A组细胞培养液上清中NRG1含量于细胞共培养后逐渐增多,且呈时间依赖性增加;细胞共培养6、9、12 d,A组NRG1含量高于B、C组,B组高于C组,比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论不同年龄大鼠BMSCs与SCs共培养均可向神经元和少突胶质细胞分化,但分化能力随年龄增加而降低,SCs分泌的多种生长因子可能是诱导BMSCs分化的重要因素。