人促血小板生成素(TPO)原核表达载体pQE30-TPO的构建

目的：获得人血小板生成素全长cDNA克隆，并构建重组表达载体pQE30-TPO。方法：利用RTPCR技术从人胎肝细胞mRNA中扩增目的基因，将扩增产物克隆至pMD18-T载体，经菌落PCR鉴定后，DNA序列分析重组质粒pMD18－T－TPO。构建并鉴定原核表达载体pQE30-TPO。结果：构建了重组克隆载体pMD18-T-TPO和重组表达载体pQE30-TPO，序列分析表明，获得的TPO cDNA序列与国内外报道的人促血小板生成素核苷酸序列完全一致。结论：成功构建了重组表达载体pQE30-TPO，为TPO的进一步研究奠定了基础。     

人血小板生成素的基因克隆及序列分析

目的：为获得人血小板生成素全长ｃＤＮＡ克隆。方法：用ＲＴ－ＰＣＲ技术,以特异性寡核苷酸为上、下游引物自胎肝总ＲＮＡ中扩增目的基因。结果：ＰＣＲ扩增产物克隆至ｐＵＣ１８－Ｔ载体,儿得重组质较ｐＵＣＴ－ＴＰＯＭ。结论：序列分析显示,获得的血小板生成素ｃＤＮＡ序列与国外文献一致。     

血小板生成素基因功能区段的体外扩增与序列测定

目的：获取具有功能的血小板生成素基因区段．方法：以正常肝组织ｍＲＮＡ为模板，聚合酶链反应扩增所需目的ｃＤＮＡ，克隆入ｐＵＣ１９中，双脱氧末端终止法测定其核苷酸序列．结果：ＰＣＲ扩增得约４８０ｂｐ片段，经测序证实为血小板生成素功能区段基因．结论：已得到所需血小板生成素功能区段基因．     

截短血小板生成素cDNA在中华仓鼠卵巢细胞中的表达

目的：将具有全长血小板生成素（TPO）活性的N端截短血小板生成素cDNA(T184)作为目的基因,在中华仓鼠卵巢细胞（CHO）中成功表达,方法：将N端截短血小板生成素cDNA克隆入以二氢叶酸还原酶（DHFR）为筛选扩增基因的pDC-B真核表达载体,通过不断提高MTX浓度,促进N端截短血小板生成素在CHO细胞中的表达。结果：构建了N端截短血小板生成素cDNA的真核表达质粒,并能在CHO细胞中高效表达,结论：N端截短血小板生成素cDNA在CHO细胞中成功表达,其产物具有全长TPO的活性。     

人AITRL基因克隆和序列分析

目的：克隆人AITRL基因cDNA，同时对其序列进行分析。方法：采用RT-PCR方法，从人脐静脉内皮细胞株中获得AITRL基因的cDNA，克隆至pMD18-T载体，选择阳性克隆进行酶切鉴定和序列测定。结果：扩增得到的AITRL基因cDNA为534bp，编码177个氨基酸残基，与GenBank中公布的序列完全一致。结论：获得人AITRL基因的克隆，为进一步研究其生物学功能奠定了良好基础。     

小鼠GITRL基因的克隆和序列分析

目的：克隆小鼠GITRL基因全长编码区的cDNA，同时对其序列分析。方法：采用RT-PCR方法，从小鼠树突状细胞获得GITRL基因的cDNA，克隆至pMD18-T载体，选择阳性克隆并进行序列测定。结果：扩增得到的GITRL基因编码区cDNA的全长519hp，编码173个氨基酸残基，与GeneBank中发表的序列完全一致。结论：获得小鼠GITRL基因的克隆，为进一步研究其生物学功能提供基础。     

分子克隆人血小板生成素基因

目的：克隆人血小板生成素基因，方法：采用ＲＴ一ＰＣＲ的方法。结果：从人胎肝中克隆出全长的血小板生成素（ＴＰＯ）基因，并亚克隆至ＰＵＣｌｌ８载体中。该ｃＤＮＡ全长１０６２ＢＰ，编码３５３个氨基酸，经序列测定与Ｂａｒｔｌｅｙ等人报道的完全一致［１］。结论：已获得人血小板生成素基因，此项工作为基因工程生产ＴＰＯ奠定了良好基础。     

斯氏狸殖吸虫囊蚴半胱氨酸蛋白酶cDNA片段的克隆和序列分析

目的：克隆斯氏狸殖吸虫囊蚴半胱氨酸蛋白酶cDNA片段，获得其序列，并进行序列分析。方法：利用简并引物，进行RT-PCR，扩增斯氏狸殖吸虫囊蚴半胱氨酸蛋白酶cDNA片段。TA克隆装入pUCm-T载体，进行鉴定、测序；利用DNASIS程序推导其所编码的氨基酸序列，并与相关虫种半胱氨酸蛋白酶进行氨基酸序列的同源性分析。结果：RT-PCR扩增出了-500bp左右的cDNA片段，对阳性克隆测序后获得其核酸序列，长498bp。推导出的氨基酸序列长166；氨基酸序列的同源性分析显示，该序列与相关虫种半胱氨酸蛋白酶存在着很高的同源性，组成半胱氨酸催化三联体的半胱氨酸、组胺酸和天冬酰胺残基高度保守。结论：本实验克隆获得了斯氏狸殖吸虫囊蚴半胱近酸蛋白酶cDNA片段。     

利用RT-PCR从人胎肝获得血小板生成素cDNA

采用反转录-PCR（RT-PCR）技术，成功地从人胎肝细胞mRNA中获得了血小板生成素（TPO）信号肽和成熟肽编码区cDNA。序列分析表明，该cDNA序列与DeSauveg等报道的人TPO相应的核苷酸序列完全一致，为TPO基因工程的进一步研究打下基础。     

登革2型病毒NGC株基因组亚克隆的构建及其鉴定

目的 构建登革2型病毒NGC株基因组全序列的亚cDNA克隆，为进一步构建全长感染性cDNA克隆奠定基础。方法根据登革2型病毒NGC株基因组全序列中的酶切位点设计2对引物，从病毒感染的乳鼠脑中提取RNA，采用长链RT—PCR技术扩增出覆盖病毒基因组全长的2个cDNA片段，并克隆至pCR—XL—TOPO载体后测序。结果经酶切鉴定和序列测定表明，获得的cDNA克隆为登革2型病毒NGC株特异的。结论已成功构建出登革2型病毒NGC株基因组的2个cDNA亚克隆。     

骨骼肌高表达质粒VR/TPO在CHO细胞中瞬时表达及动物实验

构建肌肉高表达质粒VR/TPO ,将其在体外定量表达 ,并初步了解其体内表达活性。方法 :以重组TPOcDNA为目的基因 ,构建人VR/TPO高效表达质粒 ,用脂质体法将其转染CHO细胞 ,RT PCR法检测mRNA表达 ,ELISA法检测TPO的表达量 ,并注入体内了解其对巨核系造血的影响。结果 :VR/TPO可在CHO中高效表达 ,其表达量超过 pcDNA3TPO ,并初步发现有促进血小板增加作用。 结论 :VR/TPO为一高效表达TPO质粒 ,在体内外都有一定表达活性。     

以杆状病毒作为基因治疗载体的一种新方法

目的：报道一种新的基因治疗方法。方法：将人全长血小板生成素（ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ,ＴＰＯ）基因克隆至ｐＢａｃＭａｍ２载体,与ＢａｃＶｅｃｔｏｒ３０００病毒ＤＮＡ共转染昆虫ｓｆ９细胞,经筛选后获得可在哺乳类动物细胞高效表达的昆虫病毒,以此为载体,将人ＴＰＯ基因导入小鼠体内。结果：获得可在哺乳类动物细胞高效表达的昆虫病毒株,动物实验外周血小板计数升高至正常的２～３倍,ＲＴＰＣＲ结果显示ＴＰＯ在小鼠组织中得到表达。结论：重组ｒｈＴＰＯ昆虫病毒是一种有效的基因治疗载体。     

促血小板生成素基因转染小鼠骨髓基质细胞体外表达的实验研究

目的探讨促血小板生成素(thrombopoietin,TPO)基因修饰的小鼠骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)体外表达TPO的变化特点。方法以脂质体介导法将TPO cDNA真核表达质粒转染BMSCs,RT-PCR方法检测TPO mRNA的表达,免疫组化法及Western blot测定TPO蛋白的表达。结果转染TPO基因的BMSCs其TPO mRNA及TPO蛋白表达量明显高于空载体组(P<0.01)及未转染组(P<0.01)。结论阳离子脂质体能有效介导TPO cDNA真核表达质粒转染BMSCs,且转染后BMSCs中TPO mRNA及TPO蛋白的表达显著上调。     

人白细胞介素-10 cDNA的克隆

目的：克隆人白细胞介素10(hIL-10)cDNA的全长序列，为其分子生物学利用奠定基础。方法：无菌条件抽取正常成人外周血15ml，分离单核细胞，用刀豆素A(ConA)刺激培养24h；离心得到一定量细胞，加入变性液，一步法提取细胞总RNA；反转录合成IL-10的第1条链，用自己设计的特异性上下游引物进行PCR扩增，得到期望分子量的PCR产物；酶切后插入PcDNA3载体，转染感受态细胞进行筛选制备，并行酶切鉴定和测序。结果：外周血单核细胞经ConA刺激后IL-10转录水平增加，从提取的RNA反转录产物中容易扩增出期望分子量的PCR产物，酶切鉴定证明得到的IL-10cDNA分子量与基因库报告的相近，测序结果表明得到的IL-10cDNA序列与基因库报告的序列完全一致。结论：人的IL-10cDNA全长序列被成功克隆。     

人角蛋白K6acDNA的克隆及其在E.coli中的表达

目的：克隆并表达人角蛋白K6a cDNA。方法：从人角质形成细胞中提取RNA,以RT－PCR法扩增人角蛋白K6a(1.7kb)cDNA。测序正确,将该片段克隆入表达载体pRSETB中,用IPTG诱导表达。结果：获得了角蛋白K6a（1.7kb)cDNA片段,并在大肠杆菌中获得高效表达。结论：获得了人角质蛋白K6a(1.7kb)cDNA片段及其原核表达产物,对研究人角蛋白K6a功能有重要意义。     

Cloning and identification of a novel variant of human vascular endothelial growth factor

Vascular endothelialgrowth factor ( VEGF) is amultifunctional cytokine thatexerts in vivo a key rolein physiologicalneoangiogenesisduring embryonicde-velopmentor the female cycle and pathologicalneoan-giogenesis of many diseases including hypervascular-ized tumors,rheumatoid arthritis,and retinopathiesdiseases[1— 3] by stimulating endothelial cell prolifera-tion and vessel hyperpermeability.VEGF exists asone of five different isoforms,VEGF1 2 1 ,VEGF1 65 ,VEGF1 83,VEGF1 89and VEGF2 …     

人糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D的基因结构初探

探讨人糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D（GPI-PLD）的cDNA及其基因组基因的结构。从人骨髓基质细胞克隆出的GPI-PLD cDNA中发现,它能编码信号肽,其编码的酶蛋白成熟肽为817个氨基酸残基。该GPI-PLD cDNA与从人肝组织和胰腺组织克隆到的GPI-PLD cDNA的碱基序列的同源性分别为95%和99%。人GPI-PLD基因组基因定位于6p22.2-22.3区域,包含25个外显子,其上游调控区具有启动子（TATA盒与CAAT盒）、增强子核心序列（TGGAAG）及同源转换盒Pit-1/GHF-1结合序列（TATGCATAA）等顺式作用元件。