siRNA对K562和K562/ADM细胞耐药和凋亡的调节

目的 研究联合转染以MRP和bcl-2基因为靶标的siRNA,对白血病细胞株K562和耐药的K562/ADM细胞药物敏感性和凋亡的影响.方法 体外化学合成以多药耐药相关蛋白(MRP)和bcl-2为靶标的siRNA,分别或联合用脂质体转染人阿霉素处理的K562和K562/ADM以单纯化疗处理组和未处理组为对照.转染后24、48、72 h,MTT法检测各组细胞生长抑制率,计算IC50值.转染24 h后RT-PCR检测各组细胞相应靶基因mRNA表达水平,48 h后流式细胞仪检测细胞MRP和bcl-2蛋白表达率和细胞凋亡率.结果 K562/ADM细胞ADM的IC50为12.81 μg/ml,ADM MRP-siRNA组降为3.74 μg/ml,ADM bcl2-siRNA组降为6.82 μg/ml ADM MRP-siRNA bcl2-siRNA组降至2.51 μg/ml;K562细胞ADM的IC50为6.75 μg/dml,ADM MRP-siRNA组降为3.22 μg/ml,ADM bcl2-siRNA组降为3.56 μg/ml,ADM MRP-siRNA bcl2-siRNA降至1.84 μg/ml,有统计学意义(P<0.01).转染以MRP和bcl-2为靶标的siRNA后,细胞相应靶基因的mRNA及蛋白的表达明显减低,细胞凋亡率显著升高,联合转染两种siRNA,细胞的IC50进一步下降,细胞凋亡率进一步升高,与分别转染组相比有统计学差异(P<0.05);结论联合转染以MRP和bcl-2基因为靶标的siRNA,通过降低靶基因蛋白表达,产生协同作用,明显增加耐药和亲本肿瘤细胞药物敏感性和凋亡率.     

汉防己甲素逆转白血病细胞株K562/A02耐药的机制

目的:研究汉防己甲素（TTD）对白血病细胞株K562/A02多药耐药(MDR)逆转的机理。方法：以白血病细胞系K562及其耐药细胞系K562/A02为TTD作用的靶细胞。细胞水平检测实验分5组（K562组、K562/A02组、K562+ADM组、K562/A02+ADM组和K562/A02+TTD+ADM组）,采用MTT法检测TTD对K562和K562/A02细胞的非细胞毒性剂量,流式细胞术检测细胞内阿霉素(ADM)的浓度,基因、酶学、蛋白水平检测实验分3组（K562组、K562/A02组和K562/A02+TTD组）,采用RT-PCR法检测mdr1 mRNA的表达,免疫细胞化学方法检测谷胱甘肽S转移酶π（GST-π）和拓扑异构酶Ⅱ（Topo Ⅱ）的表达水平,Western-blotting法检测P-糖蛋白（P-gp）和bcl-2表达。结果：1.562 5 mg•L^-1的TTD处理K562/A02细胞后,细胞内ADM的浓度较单用ADM组明显提高（P<0.01）;与空白对照组比较,K562/A02细胞内mdr1 mRNA/P-gp的表达量减少（P<0.01）;GST-π和TopoⅡ表达无明显变化;凋亡抑制基因bcl-2的表达量减少（P<0.01）。结论:TTD主要通过增加细胞内ADM浓度,下调mdr1/P-gp和bcl-2表达逆转耐药。     

雷公藤单体对胶质瘤细胞体外抑制作用的实验研究

目的：研究雷公藤单体对胶质瘤细胞的体外抑制作用。方法：MTT法测定3种雷公藤单体对胶质瘤细胞株SHG44、C6、U251的体外抑制作用；免疫组化法观察雷公藤甲素与雷公藤红素对SHG44胶质瘤细胞bax,bcl-2蛋白表达的变化。结果：雷公藤二萜类单体雷公藤甲素对胶质瘤细胞有极明显的抑制作用；雷公藤三萜类单体雷公藤红素的抑制作用次之。两者均使SHG44细胞bax表达增加，bcl-2表达下降。结论：雷公藤甲素与雷公藤红素对胶质瘤细胞有明显的抗肿瘤作用，其作用与促进bax表达，抑制bcl-2表达，促进细胞凋亡有关。     

夏枯草注射液诱导K562细胞凋亡的实验研究

目的探讨夏枯草注射液体外抗白血病作用,为临床应用夏枯草注射液治疗白血病提供实验依据。方法采用M TT法测定夏枯草注射液对K 562细胞的增殖抑制率,计算出IC50值;绘制夏枯草注射液(50、100 m g/mL)作用于K 562细胞的生长曲线。用倒置显微镜、姬姆萨染色法、M TT染色法光镜下观察细胞形态,台盼蓝拒染法、流式细胞仪P I染色观察夏枯草注射液对K 562细胞的促凋亡活性,用免疫细胞化学法检测夏枯草注射液对凋亡相关基因bcl-2和bax蛋白表达的影响,并用图文分析系统进行定量分析。结果夏枯草注射液对K 562细胞增殖具有明显的抑制作用,且在一定的剂量范围内抑制作用具有明显的剂量依赖性(r=0.985 0),IC50为0.113 m g/mL。夏枯草注射液(50 m g/mL)作用于K 562细胞后,倒置显微镜、姬姆萨染色、M TT染色光镜下观察,均可见典型的凋亡细胞的形态学特征。流式细胞仪检测结果显示,处理组细胞凋亡率[(37.15±1.46)%]明显高于对照组细胞凋亡率[(5.56±0.68)%](P<0.01)。夏枯草注射液(50 m g/mL)作用于K 562细胞48 h,bcl-2蛋白表达增强,而bax表达减弱,与对照组相比差异显著(P<0.01)。结论夏枯草注射液可明显抑制K 562细胞增殖,可望成为新的抗白血病药物,诱导K 562细胞凋亡可能是其发挥抗肿瘤作用的机制之一。     

大黄素对K562/ADM细胞阿霉素耐药的抑制作用

探讨大黄素抑制人慢性粒细胞白血病细胞耐阿霉素变异株K562/ADM的药效学及作用机制。以维拉帕米为阳性药,阿霉素为工具药,采用MTT法测定大黄素与阿霉素合用对细胞增殖的抑制作用;使用流式细胞仪考察了大黄素对于阿霉素诱导K562/ADM细胞周期阻滞和凋亡的促进作用;并采用Western blot法检测了大黄素对P-gp、Bcr-Abl和STAT5蛋白表达的影响;进一步通过P-gp单克隆藻红蛋白键合UIC2抗体结合实验探讨了大黄素是否是P-gp的底物。实验结果显示,大黄素与阿霉素合用可显著抑制K562/ADM的增殖,并呈量效关系;可促进阿霉素诱导的K562/ADM细胞G₂/M期周期阻滞和细胞凋亡;不同剂量的大黄素可有效抑制P-gp、Bcr-Abl、STAT5蛋白表达及磷酸化;UIC2抗体结合实验结果则表明大黄素可能不是P-gp的底物。因此,大黄素能够在体外有效抑制K562/ADM阿霉素耐药,其机制可能不是通过底物竞争性抑制作用,而是与大黄素直接降低P-gp、Bcr-Abl及STAT5蛋白表达和磷酸化有关。     

墓头回提取物诱导K562细胞凋亡的实验研究

目的探讨墓头回提取物体外抗白血病作用,为墓头回提取物抗肿瘤活性单体的筛选提供理论依据。方法采用MTT法测定墓头回对K562细胞的增殖抑制率,计算出IC50值;台盼蓝拒染法、流式细胞仪PI染色观察墓头回对K562细胞的促凋亡活性,用免疫细胞化学法检测墓头回对凋亡相关基因bcl-2和bax蛋白表达的影响。结果墓头回对K562细胞增殖具有明显的抑制作用,且在一定的剂量范围内其抑制作用具有明显的剂量依赖性,IC50为36.03 mg/L。墓头回作用于K562细胞后,倒置显微镜下可见典型的凋亡细胞的形态学特征。流式细胞仪检测结果显示,实验组细胞凋亡率明显高于对照组,与对照组相比差异显著(P<0.05)。结论墓头回作用于K562细胞,可以明显抑制K652细胞增殖。此外,诱导K562细胞凋亡可能是其发挥抗肿瘤作用的机制之一。     

小檗碱对人肝癌SMMC-7721细胞 bcl-2、bax表达的影响

目的:研究小檗碱(Berberine)对体外培养肝癌SMMC-7721细胞bcl-2和bax表达的影响。方法:体外培养人肝癌SMMC-7721细胞,采用CCK8法测定Berberine不同浓度(0mmol/L、0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.5mmol/L)及不同时间点(24h、48h、72h)对细胞增殖的影响,选取最适浓度和最适时间点,采用Western blot检测凋亡相关蛋白bcl-2和bax的表达。结果:CCK8发现Berberine对肝癌SMMC-7721细胞有显著的增殖抑制作用,在48h时间点和0.2mmol/L浓度条件下抑制最明显。Western blot检测结果发现,Berberine可致人肝癌SMMC-7721细胞bcl-2表达下调,bax表达上调,bax/bcl-2比值升高,促进凋亡发生。结论:Berberine抑制肝癌SMMC-7721细胞生长,通过上调bax蛋白、下调bcl-2蛋白,诱导凋亡。     

错配修复基因hMSH2在阿霉素耐药白血病细胞K562中的表达

[目的]探讨错配修复蛋白hMSH2与白血病耐药发生的关系。[方法]MTT检测K562/ADM细胞耐药倍数,PT-PCR检测K562与K562/ADM的hMSH2基因表达,Western-blot检测二者的hMSH2蛋白表达,免疫细胞化学方法检测正常血有核细胞的hMSH2蛋白表达。[结果]K562/ADM耐药倍数为6.7倍,正常血有核细胞未见hM-SH2蛋白表达,Western-blot显示K562/ADM的hMSH2蛋白表达强于K562。[结论]白血病细胞K562存在hM-SH2基因及其产物的表达;耐药细胞的hMSH2蛋白增多可能与持续阿霉素作用有关。     

三氧化二砷及干扰素联用对K562及K562/ADM耐药细胞系的作用

目的 研究三氧化二砷(As2O3)对K562及其耐药细胞K562／ADM细胞株几种耐药机制的作用，以及干扰素(IFNα-2b)与之联用的效应。方法 采用免疫细胞化学染色及TUNEL原位末端标记检测不同浓度As2O3作用不同时间或与IFNα-2b联用，对K562及K562／ADM细胞相关耐药基因蛋白(P-gp、GST-x、Bcl-2)表达的影响及凋亡诱导作用。结果 K562、K562／ADM细胞表面P-gp蛋白表达无明显改变；As2O3(5，10，20μmol／mL)作用72h可降低K562、K562／ADM细胞GST-π的表达，与对照组比较P＜0．05；As2O3抑制K562、K562／ADM细胞Bcl-2蛋白的表达，诱导细胞凋亡，并有计量时间效应；IFNα-2b与As2O3联用可增强对K562细胞的作用，对K562／ADM细胞未见明显增强效应。结论 As2O3具有抑制K562、K562／ADM细胞GST-π、Bcl-2蛋白的表达及诱导细胞凋亡作用；对P-gp蛋白表达无明显影响；IFNα-2b可增强其对K562细胞的这种作用。     

汉防己碱对白血病K562细胞生长的促进耐药作用

目的考察汉防己碱(Tet)对白血病K562细胞生长的影响。方法采用体外细胞培养,即在37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养,培养液为含10%热灭活NBS的完全RPMI1640细胞培养基。待K562细胞与药物作用48 h后,收集并处理细胞,结合MTT和Western blot法研究Tet对K562细胞生长的作用特点。结果 Tet在0.33～1.00μg/ml仅使K562及K562/ADM细胞的存活率降低至75%～80%,低浓度Tet(0.33μg/ml)使阿霉素(ADM)和顺铂(cDDP)对K562细胞生长的IC50增加(P<0.01),1.0μg/ml Tet则降低IC50,使ADM对K562/ADM细胞的IC50增加,cDDP的IC50无明显变化。0.33μg/ml Tet有提升2种细胞的P-gp和MRP1表达的作用(P<0.05)。Tet各浓度对LRP表达无明显影响。结论 Tet对K562及K562/ADM细胞生长抑制作用具浓度依耐性,低浓度具加速耐药的作用,其促进耐药细胞发展的机制至少与提升P-gp和MRP1表达有关。     

ZM-66, a New Podophyllotoxin Derivative Inhibits Proliferation and Induces Apoptosis in K562/ADM Cells

Objective To investigate the anti-tumor effect of ZM-66 on multidrug-resistant leukemic cell line K562/ADM. Methods The K562/ADM cells were treated with varying concentrations （0, 1, 2, 4×10^-3 mmol/L） of ZM-66 or etoposide for 24 hours. The proliferation was detected by Sulforhodamine B Sodium Salt （SRB） assay and apoptosis was detected by flow cytometry analysis and fluorescent staining. In addition, the expression levels of p53 and bax genes in K562/ADM cells were detected by RT-PCR analysis. The level of P-glycoprotein （P-gp）, P53 and Bax protein in K562/ADM cells were detected by Western blot assay. Results SRB assay demonstrated that etoposide had little inhibitory effect on K562/ADM cells, whereas ZM-66 （1, 2, 4×10^-3 mmol/L） had significantly inhibitory effect on K562/ADM cells （all P〈0.01）. The acridine orange/propidium iodide dual staining showed that there were typical condensation of chromatin and nuclear fragmentation nuclei with red color in ZM-66 treated cells. Flow cytometric analysis showed that there was a significantly increase of apoptotic cells i~ K562/KDM cells after treated with ZM-66. RT-PCR showed that the p53 and bax mRNA expression levels in K562/ADM cells treated with ZM-66 at 1, 2, 4×10^-3 mmol/L were higher than those in the cell without treatment. Western blot showed that the P53 and Bax protein expression levels in K562/ADM cells treated with ZM-66 at 2, 4x 10 s mmol/L were higher than those in the cell without treatment. But the P-gp protein expression level in K562/ADM cells treated with ZM-66 at 2, 4×10^-3 mmol/L was gradually lower than those in the cell without treatment. Conclusion ZM-66 is able to induce cell death by apoptosis in vitro, as a result of the reverse of theapoptosis resistance in drug-resistant K562/ADM cells by modulating expression of key factors associated with apoptosis induction.     

川芎嗪对转基因多药耐药细胞K562/MDR耐药性的逆转作用

目的：研究川芎嗪（TMP）与环孢菌素A（CsA）单独及联合逆转人红白血病多药耐药细胞K562/MDR的多药耐药性（MDR）,并进一步探讨其耐药逆转机制。方法：分别以倍比稀释后不同浓度的TMP（50～6　400 mg?L^-1 ）和CsA（0.5～256 mg·L^-1 ）作用于体外培养的K562/MDR细胞72 h,采用MTT法检测细胞生长率,确定TMP和CsA的非细胞毒性剂量;采用非细胞毒性剂量,实验分为5组：G1组（TMP+ADM+K562/MDR）、G2组（CsA+ADM+K562/MDR）、G3组（TMP+CsA+ADM+K562/MDR）、阴性对照组（以K562/S代替K562/MDR）、空白对照组（以1640培养基代替药物）,检测各组细胞生长抑制50%的ADM浓度,即IC₅₀,计算耐药倍数和逆转倍数;利用荧光分光光度法检测各组细胞内ADM浓度;流式细胞术检测跨膜糖蛋白P-gp的表达情况。结果：TMP及CsA的非细胞毒性剂量分别为320和2.0 mg·L^-1,K562/MDR细胞的耐药倍数为19.2倍;TMP及CsA均能降低K562/MDR细胞的耐药性,逆转倍数分别为5.2及9.6倍,并且两者联合应用,逆转倍数为15.6倍;TMP和CsA单独及联合应用均能明显增加K562/MDR细胞内ADM浓度;TMP及CsA单独应用均能降低K562/MDR细胞P-gp的表达,并且两者联合应用使K562/MDR细胞P-gp的表达率明显降低,与阴性对照组比较差异有显著性（P<0.01)。结论：TMP和CsA单独及联合应用可逆转K562/MDR细胞对化疗药物ADM的MDR,且两者具有协同作用。其逆转机制可能为降低P-gp水平,升高细胞内ADM浓度,增强对ADM的敏感性,从而发挥治疗肿瘤的作用。     

硼替佐米对伊马替尼耐药细胞株K562的凋亡作用及机制

目的 探讨硼替佐米对伊马替尼耐药细胞株K562(K562R)的诱导凋亡作用及机制.方法 采用浓度梯增法建立耐伊马替尼K562细胞系.应用CCK-8法检测不同浓度硼替佐米分别作用K562和K562R细胞24 h、48 h后,对细胞的增殖抑制的效果.使用流式细胞术方法分别检测硼替佐米单独或联合伊马替尼作用于K562R细胞48 h后的细胞凋亡.应用Western blotting检测不同浓度硼替佐米作用K562R细胞48 h后,Mcl-1、Bcl-2、Bcr/Abl蛋白表达的异同.结果 成功将对伊马替尼敏感的K562细胞诱导为K562R,耐药倍数为31.8;硼替佐米对K562及K562R细胞的增殖抑制呈浓度、时间依赖(P均<0.05);随着硼替佐米浓度增加,对K562R细胞的诱导凋亡作用增强,且硼替佐米与伊马替尼联合具有协同作用(P<0.05);硼替佐米可抑制K562R细胞Mcl-1,Bcr/Abl蛋白的表达,Bcl-2无变化.结论 硼替佐米具有对K562R细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用,其机制可能与下调K562R细胞Bcr/Abl和MCL-1的表达以及促进MCL-1发生切割有关.     

洛铂对SKOV3细胞凋亡及bax、bcl-2基因表达的影响

目的研究洛泊对体外培养的浆液性卵巢癌细胞SKOV3凋亡作用及探讨其对凋亡基因bcl-2和bax表达的影响。方法体外培养卵巢癌细胞SKOV3,用MTT比色法检测洛铂对SKOV3细胞株的增殖抑制作用以及流式细胞仪检测洛铂对SKOV3细胞株的凋亡率,流式细胞仪检测凋亡相关蛋白bax、bcl-2的表达。结果体外培养卵巢癌SKOV3细胞经不同浓度洛泊处理后细胞生长明显受到抑制,洛泊作用于卵巢癌SKOV3细胞可诱导细胞的凋亡,同时,随着洛铂浓度的增加,bax基因的表达增加,而bcl-2表达减少。结论卵巢癌SKOV3细胞对洛泊具有药物敏感性,洛泊可诱导卵巢癌细胞的凋亡,bax蛋白的表达增加和bcl-2蛋白表达的减少可能是洛泊诱导卵巢癌细胞的凋亡机制之一。     

鸢尾黄素体外对人宫颈癌Caski细胞增殖的影响

目的:探讨鸢尾黄素对人宫颈癌Caski细胞增殖的影响。方法:将人宫颈癌Caski细胞加入不同浓度的鸢尾黄素,用MTT比色法观察鸢尾黄素对人宫颈癌Caski细胞生长的影响,光镜观察细胞形态学变化,ELISA方法检测细胞中环氧合酶-2(COX-2)蛋白含量的变化,Western Blot方法检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的变化。结果:鸢尾黄素体外作用于人宫颈癌Caski细胞后可以抑制其增殖,且呈剂量依赖性,同时COX-2蛋白含量降低,bax蛋白表达增强、Bcl-2蛋白表达降低。结论:鸢尾黄素体外能抑制人宫颈癌Caski细胞的增殖。     

双氢青蒿素对白血病多药耐药K562/ADM细胞的逆转作用

目的:探讨双氢青蒿素(Dihydroartemisinin,DHA)在白血病多药耐药中的应用。方法:采用MTT检测DHA联合阿霉素(adriamycin,ADM)对白血病多药耐药细胞(K562/ADM)生长增殖的影响;应用流式细胞技术分析细胞内罗丹明123(Rhodamine 123)浓度,以检测DHA对白血病细胞膜P糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)泵功能的影响;免疫组化方法检测DHA对白血病细胞P-gp表达水平的影响。结果:10、20、40μmol/L DHA实验组的细胞耐药逆转倍数分别为1.46、2.16和3.52倍。DHA使用前、后K562/ADM细胞膜P-gp表达水平无明显差异;Rh123蓄积试验中DHA应用后使K562/ADM细胞内Rh123浓度由用前的22.16%升至89.18%,Rh123外排试验中DHA应用后使K562/ADM细胞内Rh123浓度由用前的27.15%升至60.51%。结论:DHA:能有效逆转白血病细胞的MDR机制为通过抑制肿瘤细胞膜上P-gp的药泵功能,增加耐药细胞内化疗药物浓度逆转耐药性,而不是抑制和P-gp表达。