eNOS与蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛的关系

目的 探讨内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)在蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)后不同时间点基底动脉表达情况及其与脑血管痉挛的关系.方法 新西兰大白兔72只,随机分成两组:(1)对照组(12只);(2)SAH组(60只).SAH组进一步按时间随机分为术后1d、3d、5d、7d、10d5个亚组,每组12只.采用枕大池二次注血法建立兔SAH模型.二次注血后在各个时间点采用灌流固定法处死动物,测定基底动脉横截面积判断有无脑血管痉挛.应用Western blotting分别观察eNOS在基底动脉中的表达情况.结果 枕大池二次注血法成功制作SAH模型,基底动脉发生了不同程度的血管痉挛.Western blotting观察到eNOS在对照组大量表达,实验组第1天表达开始减少,第5天表达水平最低,之后表达逐渐增加.结论 SAH后eNOS表达水平的变化与脑血管痉挛发展的时相性具有一定的一致性,eNOS蛋白减少可能参与蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛的发展.     

盐酸法舒地尔对蛛网膜下腔出血后血管痉挛的实验研究

目的通过建立大鼠蛛网膜下腔出血（SAH）模型,探讨盐酸法舒地尔对蛛网膜下腔出血后血管痉挛的缓解作用和神经保护作用,并与尼莫地平对比,观察疗效。方法通过枕大池二次注血法建立大鼠SAH模型,观察基底动脉和海马神经元形态变化,测量基底动脉管径和管壁厚度,计算海马CA1区神经元密度,检测基底动脉内皮型一氧化氮合成酶（eNOS）的表达。结果各组模型大鼠的基底动脉均出现血管痉挛,海马CA1区正常神经元数目明显减少,多数神经元发生变性,基底动脉的eNOS表达明显减弱。但注射法舒地尔组与其他模型组相比能较大程度的缓解以上变化,具有统计学差异（P〈0.05）,且优于尼莫地平。结论法舒地尔可以有效缓解SAH后的迟发性脑血管痉挛,具有神经保护作用,其缓解迟发性脑血管痉挛作用和神经保护作用与动脉壁产生的一氧化氮（NO）有关。     

一氧化氮合酶在脑缺血再灌注中的双重作用

目的 探讨短暂脑缺血再灌注后大鼠脑内3型一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)的表达及作用，为脑缺血治疗提供理论依据。方法 采用免疫组织化学方法，用3型NOS的多克隆抗体检测大鼠局灶性脑缺血2h再灌注15min及22h NOS在脑内的表达情况。结果 大鼠脑缺血2h再灌注15min，在脑缺血边缘区的血管壁及神经细胞出现内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)上调表达；脑缺血2h再灌注22h，在脑梗死区内表达神经元型一氧化氮合酶(neuronal mitric oxide synthase，nNOS)的神经细胞减少，并出现表达诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)的胶质细胞，同时梗死边缘区血管及神经细胞出现eNOS及iNOS的上调表达。结论 在短暂脑缺血再灌注早期，缺血区周围可能有eNOS相关的保护机制；亚急性期eNOS及iNOS的保护及损伤机制并存；因此，在短暂脑缺血早期恢复灌注后予选择性iNOS抑制剂及促进eNOS活性有可能减少迟发性神经损伤。     

17β-雌二醇对大鼠蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛的影响及其机制

目的探讨17β-雌二醇（E₂）对蛛网膜下腔出血（SAH）引发的脑血管痉挛（CVS）的影响及其机制。方法雄性Wistar大鼠70只按随机数字表分为SAH组、SAH+E₂组、SAH+安慰剂组、空白组。采用枕大池二次注血法制作SAH模型。CVS的程度以第一次注血后7d的基底动脉平均横截面积评估。酶联免疫吸附法检测血清内皮型一氧化氮合酶（eNOS）及诱导型一氧化氮合酶（iNOS）水平。原位细胞凋亡检测法检测颞叶神经元凋亡情况。结果与SAH组及SAH+安慰剂组相比,SAH+E₂组大鼠基底动脉横截面积明显增加,血清iNOS浓度明显降低,eNOS浓度明显升高,皮质神经元凋亡指数显著降低（P<0.01）。结论 E₂可有效缓解大鼠SAH后的CVS,并具有脑保护作用,其机制可能与E₂维持SAH后血管内皮功能的稳定有关。     

自由基清除剂对减少大鼠SAH后CVS的研究

目的 通过建立大鼠蛛网膜下腔出血模型并应用自由基清除剂对其进行治疗,观察大鼠脑基底动脉的病理变化及其管壁上细胞间粘附因子1（ICAM-1）、白介素6（IL-6）在治疗前、后的动态变化,为进一步明确脑血管痉挛（cerebral vasospasm,CVS）的发病机制及治疗脑血管痉挛提供理论依据.方法 取Sprague Dawley （SD）大鼠98只,观察正常大鼠及治疗大鼠SAH前后基底动脉管径的变化;行免疫组化染色对大鼠脑基底动脉进行免疫学检测,观察ICAM-1、IL-6在血管壁上表达的动态变化;行原位杂交检测观察大鼠脑基底动脉管壁上ICAM-1、IL-6在分子水平表达的动态变化.结论 ①自由基清除剂能够抑制SAH后CVS的免疫炎症反应;②应用自由基清除剂对防治CVS有一定效果,能够有效缓解CVS.     

血管内一氧化氮合酶基因转染预防脑血管痉挛的实验研究

目的采用血管内基因转染的方法,将重组内皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因转染入蛛网膜下腔出血(SAH)后迟发性脑血管痉挛大鼠脑动脉,探讨防治SAH后迟发性脑血管痉挛的新方法。方法首先构建携带eNOS基因的重组腺病毒。采用小脑延髓池二次注血法建立大鼠SAH后迟发性脑血管痉挛模型。通过颈动脉微泵持续滴注方法进行基因转染,并设置对照组。结果第7天采用免疫组化证实重组eNOS基因表达,重组eNOS主要表达于内皮层。第7天显微镜下测定血管内eNOS转染组脑动脉环平均直径较单纯SAH组增大,电镜观察血管痉挛较单纯SAH组减轻。结论通过本研究证实采用颈动脉微泵持续滴注方法可在大鼠脑动脉表达重组eNOS,重组基因主要表达于动脉内皮细胞,可达到缓解SAH后迟发性脑血管痉挛的目的。     

美满霉素改善血管性痴呆大鼠认知功能损伤并抑制氧化应激

目的 观察美满霉素(minocycline)对血管性痴呆大鼠学习记忆功能和脑组织内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)表达的影响,探讨美满霉素对血管性痴呆的脑保护作用的机制.方法 Wistar大鼠随机分为假手术组(S组)、痴呆模型组(M组)、美满霉素治疗组(MT组).RT-PCR和免疫组织化学法检测大鼠脑组织eNOS、iNOS的表达,行为学检测大鼠学习记忆功能的改变.结果 M组与S组行为学检查显示,M组大鼠有显著学习记忆障碍(P＜0.01),MT组与M组比较行为学检测结果显示,MT组大鼠学习记忆障碍有显著改善(P＜0.01).MT组iNOS表达较M组降低(P＜0.01),MT组eNOS表达较M组增高(P＜0.05);MT组eNOS、iNOS表达较S组增高(P＜0.01);M组eNOS、iNOS表达较S组显著增高(P＜0.01).结论 美满霉素能降低血管性痴呆大鼠脑组织iNOS表达,增强eNOS表达,抑制氧化应激反应,发挥脑保护作用.     

COX-2和NF-κB在兔蛛网膜下腔出血脑血管痉挛模型中的表达

目的 研究COX-2和NF-κB在蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛时表达情况及作用.方法 将16只同龄新西兰兔随机分成对照组、血管痉挛两组.血管痉挛组通过枕大池注自身动脉血方法制成蛛网膜下腔出血模型,对照组动物仅在枕大池注入1.5ml生理盐水.3d后处死动物,断头取脑;每个动物基底动脉及其附近结构标本的组织切片至少分成3份,分别检测蛛网膜下腔出血后,脑血管痉挛模型血管内皮细胞和周围组织COX-2和NFKB表达情况,及HE染色,并用计算机图像分析系统分别对两组脑标本基底动脉血管内径进行测定.对血管内径与血管内皮细胞COX-2和NF-KB表达情况进行多元相关分析.结果 在蛛网膜下腔出血后,脑血管痉挛组动物可以观察到COX-2和NF-KB在基底动脉内皮细胞过度表达,两者之间存在着正相关关系,并且两者表达强度与血管痉挛程度呈正相关关系.结论 COX-2和NF-KB在蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛形成过程中发挥重要作用,并且两者相互间作用是其发挥作用的基础.     

Rho激酶、氧合血红蛋白与蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛的关系

目的探讨Rho激酶、氧合血红蛋白在蛛网膜下腔出血后患者脑脊液中的表达与浓度及其在脑血管痉挛的调控作用。方法采集62例蛛网膜下腔出血患者入院后第1、3、7、10、14 d脑脊液标本,RT-PCR方法检测Rho激酶mRNA的表达,采用比色法测定脑脊液中氧合血红蛋白的浓度,采用TCD检测颅内主要动脉血流速度。结果出血后第3 d脑脊液中Rho激酶表达及氧合血红蛋白浓度增高,在出血后第7 d达到高峰,而后逐渐下降。结论蛛网膜下腔出血患者脑脊液中Rho激酶的表达与氧合血红蛋白浓度有关,参与蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛的发生,其含量与脑血管痉挛程度相关。     

大鼠蛛网膜下腔出血后MMP-9在基底动脉壁中的表达变化

目的探讨大鼠蛛网膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage,SAH）后基质金属蛋白酶-9（MMP-9）在基底动脉壁中的表达变化及其与脑血管痉挛（Cerebral Vasospasm,CVS）的关系。方法健康成年雄性SD大鼠51只,并随机分为正常组、对照组和SAH组,应用枕大池一次注血法制成SAH动物模型,对照组和SAH组大鼠在SAH后1 d,3 d,5 d,7 d,14 d时间点通过HE染色光镜下观察基底动脉的病理学变化,测定血管壁厚度及血管腔内径,以此评价脑血管痉挛;应用免疫组化法评估大鼠基底动脉管壁中MMP-9在不同时间点的表达水平。结果 HE染色显示SAH组基底动脉管腔狭窄,管壁增厚,3 d时最明显,之后狭窄程度渐减轻,14 d时基本正常;SAH后基底动脉壁MMP-9表达增加,表达高峰为注血后3～5 d,随后开始下降,14 d恢复正常。结论大鼠SAH存在明确的CVS,SAH后MMP-9在基底动脉壁中的表达上调,并与CVS的时相一致,提示MMP-9可能参与了CVS的病理过程。     

高压氧对蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛的影响

目的探讨高压氧（hyperbaric oxygen,HBO）对蛛网膜下腔出血（SAH）后迟发性脑血管痉挛的影响及机制。方法采用枕大池2次注血法建立迟发性脑血管痉挛模型,将60只模型动物随机等分为SAH组和SAH＋HBO组,用显微测量法测量基底动脉管径,比色法测定血清中一氧化氮（NO）及一氧化氮合酶（NOS）含量,原子吸收分光光度计测定脑组织中的Ca^2＋含量。结果模型制作成功后96h测量基底动脉直径,结果显示：经HBO治疗后,脑血管痉挛的程度明显缓解。SAH组NO、NOS含量在术后24h及96h均降低,而经HBO治疗后则增高。SAH组Ca^2＋含量在术后24h及96h增高,经HBO治疗后则降低。结论高压氧能够缓解SAH后脑血管痉挛程度,改善受损的脑功能。     

17β-雌二醇对大鼠蛛网膜下腔出血后迟发型脑血管痉挛的作用

目的研究17β-雌二醇(E2)对蛛网膜下腔出血(SAH)后迟发型脑血管痉挛(DCV)的抑制作用。方法雄性Wistar大鼠50只随机分为5组:①空白组,②假穿刺组,③SAH组,④SAH+E2组,⑤SAH+安慰剂组。采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血浆中内皮素-1(ET-1)含量,末端脱氧核苷酸转移酶介导的生物素脱氧尿嘧啶核苷酸缺口末端标记法(TUNEL)检测颞叶神经元凋亡情况,通过测定基底动脉血管横截面积判断脑血管痉挛情况。结果实验结果显示SAH后7 d SAH+E2组基底动脉横截面积与SAH组和SAH+安慰剂组相比明显变大(P<0.01);与SAH组和SAH+安慰剂组相比,SAH+E2组血浆ET-1浓度明显减少(P<0.01);TUNEL染色显示SAH+E2组颞叶皮质神经元凋亡程度较SAH组和SAH+安慰剂组显著性减轻。结论持续给予E2维持其生理浓度可以有效预防SAH后迟发型脑血管痉挛,部分可能与E2可以抑制ET-1的产生有关。     

蛛网膜下腔出血后大鼠基底动脉肿瘤坏死因子-α的表达变化

目的探讨蛛网膜下腔出血（SAH）后基底动脉肿瘤坏死因子α（TNF-α）的表达变化以及与脑血管痉挛（CVS）的关系。方法通过枕大池二次注血方法制作大鼠SAH模型,HE染色观察基底动脉的血管形态学变化,免疫组化方法观察基底动脉TNF-α的表达情况,酶联免疫吸附试验和逆转录酶-多聚酶链反应,分别从蛋白、基因水平分析TNF-α在SAH后基底动脉中的表达变化情况。结果SAH后大鼠基底动脉逐渐出现痉挛,从1 d开始,5~7 d时最明显,炎性细胞浸润也最明显,以后逐渐减轻,14 d基本恢复正常。TNF-α阳性的内皮细胞数及TNF-α蛋白水平逐渐增高,术后7 d达高峰,之后逐渐降低,14 d时仍维持较高水平。TNF-αmRNA表达在注血后1 d明显增加,7 d时达高峰,持续到14 d,仍维持较高水平。结论①大鼠枕大池二次注血后基底动脉呈现痉挛状态;②基底动脉TNF-α表达变化与动脉痉挛程度呈正相关,表明TNF-α可能导致SAH后基底动脉痉挛。     

Genetic elimination of eNOS reduces secondary complications of experimental subarachnoid hemorrhage

Delayed complications of subarachnoid hemorrhage (SAH) such as angiographic vasospasm, cortical spreading ischemia, microcirculatory dysfunction, and microthrombosis are reported in both patients and animal models of SAH. We demonstrated previously that SAH is associated with increased oxidative stress in the brain parenchyma, and that this correlates with dysfunction of endothelial nitric oxide synthase (eNOS) (homodimeric uncoupling). Uncoupling of eNOS exacerbated oxidative stress and enhanced nitric oxide (NO) depletion, and was associated with multiple secondary complications such as microthrombosis, neuronal apoptosis, and release of reactive oxygen species. Thus, we hypothesized that genetic abbrogation of eNOS would confer a beneficial effect on the brain after SAH. Using a prechiasmatic injection model of SAH, we show here that eNOS knockout (KO) significantly alleviates vasospasm of the middle cerebral artery and reduces superoxide production. Endothelial nitric oxide synthase KO also affected other nitric oxide synthase isoforms. It significantly increases neuron nitric oxide synthase expression but has no effect on inducible nitric oxide synthase. Endothelial nitric oxide synthase KO decreases Zn²⁺ release after SAH, reduces microthrombi formation, and prevent neuronal degeneration. This work is consistent with our findings where, after SAH, increased oxidative stress can uncouple eNOS via Zn²⁺ thiolate oxidation, or theoretically by depletion or oxidation of tetrahydrobiopterin, resulting in a paradoxical release of superoxide anion radical, further exacerbating oxidative stress and microvascular damage.     

基底动脉中Caspase3、8的表达与蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛的关系

目的探讨天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3、8(Caspase3、8)在蛛网膜下腔出血(SAH)后在基底动脉中的表达及其与脑血管痉挛的关系。方法新西兰大白兔36只,随机分成对照组(n=6)和实验组(n=30),后者再随机分为SAH后1、3、5、7、10d等5个亚组,每亚组各6只。采用枕大池二次注血法建立SAH模型,应用免疫组化和末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP原位切口末端标记法分别检测基底动脉内皮细胞Caspase3、8表达和凋亡。结果凋亡细胞在实验组SAH后第1天出现,第7天凋亡水平达到最高。实验组Caspase3、8表达水平明显高于与对照组(P<0.05)。Caspase3、8的表达在SAH后第1天就可观察致到,第5天和第7天出现强烈表达,第l0天表达明显减弱。结论本结果提示在兔脑血管痉挛的基底动脉中存在细胞凋亡;Caspase3、8可能参与了SAH后脑血管痉挛的发生和发展。     

Uncoupling of endothelial nitric oxide synthase after experimental subarachnoid hemorrhage

We studied whether endothelial nitric oxide synthase (eNOS) is upregulated and uncoupled in large cerebral arteries after subarachnoid hemorrhage (SAH) and also whether this causes cerebral vasospasm in a mouse model of anterior circulation SAH. Control animals underwent injection of saline instead of blood (n=16 SAH and n=16 controls). There was significant vasospasm of the middle cerebral artery 2 days after SAH (lumen radius/wall thickness ratio 4.3±1.3 for SAH, 23.2±2.1 for saline, P<0.001). Subarachnoid hemorrhage was associated with terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick-end labeling, cleaved caspase-3, and Fluoro-Jade-positive neurons in the cortex and with CA1 and dentate regions in the hippocampus. There were multiple fibrinogen-positive microthromboemboli in the cortex and hippocampus after SAH. Transgenic mice expressing lacZ under control of the eNOS promoter had increased X-gal staining in large arteries after SAH, and this was confirmed by the increased eNOS protein on western blotting. Evidence that eNOS was uncoupled was found in that nitric oxide availability was decreased, and superoxide and peroxynitrite concentrations were increased in the brains of mice with SAH. This study suggests that artery constriction by SAH upregulates eNOS but that it is uncoupled and produces peroxynitrite that may generate microemboli that travel distally and contribute to brain injury.