人羊膜组织细胞的神经干细胞特性形态学研究

目的:利用形态学研究方法,探讨神经干细胞特异性标志蛋白的表达和增殖分化特性,鉴定人类羊膜组织中神经干/前体细胞的存在。方法:利用免疫组织化学法,检测人类羊膜组织和培养人类羊膜细胞中nestin、musashi-1、vimentin和PSA-NCAM等神经干细胞特异性标志蛋白的表达,利用BrdU掺入实验鉴定羊膜组织来源神经干/前体细胞的增殖分化能力。结果:免疫组织化学检测证实人羊膜组织表达nestin、musashi-1、CD133和vimentin等神经干细胞特异性标志蛋白,主要分布于羊膜组织的间质层。培养羊膜细胞的免疫荧光化学染色显示nestin、musashi-1、vimentin和PSA-NCAM阳性细胞的存在。BrdU掺入的组织形态学实验显示培养羊膜细胞中存在BrdU标记阳性细胞,其中具有BrdU与nestin、musashi-1、vimentin双标阳性细胞,显示羊膜细胞中存在具有增殖活性神经干细胞标记蛋白表达阳性细胞;而BrdU与β-tubullinIII、TH和GFAP双标阳性细胞的存在,表明神经元和胶质细胞是由培养羊膜细胞增殖分化的。结论:羊膜组织中存在神经干细胞特异性标记蛋白Nestin、Musashi-1、CD133、PSA-NCAM和Vimentin表达阳性细胞,BrdU掺入的组织形态学结果不仅证实羊膜细胞中Nestin、Musashi-1、Vimentin阳性细胞具有增殖活性,而且其中存在已分化的神经元和胶质细胞,提示羊膜组织细胞内存在神经干/前体细胞。     

体外培养人羊膜间充质细胞的神经生物学特点

目的：探讨体外培养人羊膜间充质细胞（hAMCs）的神经生物学特征。方法：应用MTS分析法、BrdU掺入法和增殖细胞核抗原（PCNA）的免疫荧光染色,探讨体外培养hAMCs的增殖活性。利用免疫细胞化学法检测hAMCs 中间充质细胞标记（STRO-1、Vimentin）、神经干细胞标记蛋白（Nestin、PSA-NCAM）、神经细胞标记蛋白（β-tubulin-Ⅲ、TH）和神经分化相关蛋白（math-1、mash-1）的表达。结果： MTS分析法显示hAMCs在接种后第6—8天增殖速度最快,第8—24天活细胞数基本保持稳定;BrdU和PCNA的免疫荧光染色结果显示体外培养hAMCs中具有大量BrdU和PCNA阳性细胞存在;体外培养的hAMCs表达间充质干细胞特异性标记物STRO-1和Vimentin,也表达神经干细胞标记物Nestin和PSA-NCAM,同时还可见神经元特异性标记物β-tubulin-Ⅲ和TH,以及神经元分化相关蛋白math-1和mash-1的表达;体外培养hAMCs中存在有TH/BrdU和β-tubulin-Ⅲ/BrdU双阳性细胞。结论：体外培养的hAMCs表达间充质干细胞、神经干细胞、神经元的特异性标记蛋白,同时具有增殖活性;hAMCs表达神经元分化相关蛋白,提示hAMCs具有向神经元分化的潜能。     

人羊膜组织细胞神经生物学特性形态学研究

目的：利用神经于细胞特坪性标志蛋白，鉴定人羊膜组织中神经细胞的存在，从组织和细胞形态学角度探讨羊膜组织细胞的伸经生物学特性方法：利用TH、AchT、NeuN、MAP2、CNPase、MBP和GFAP单克隆抗体．通过免疫组织化学、免疫细胞化学和免疫荧光细胞化学技术方法，检测羊膜组织细胞中的多巴胺能神经元、胆碱能神经元、神经元、少突胶质细胞和胶质细胞结果：羊膜组织细胞中存在TH、AehT、NeuN、MAP2、CNPase、MBP和GFAP等神经细胞特异性标记蛋白表达阳性细胞结论：实验结果提示羊膜组织细胞内可能存在多巴胺能神经元、胆碱能神经元少突胶质细胞和星形胶质细胞等这对细胞移植治疗帕金森氏病、老年痴呆和多发性硬化等神经系统疑难疾病将具有一定的临床意义。     

胚胎大鼠神经干细胞的分离培养及自然分化的初步观察

目的神经干细胞体外培养的成功是进一步研究其分化机制的基础,从胚胎大鼠脑室下区分离、培养、鉴定神经干细胞(neuralstemcells,NSCs),并观察其向神经元的分化情况。方法分离胚胎SD大鼠脑室下区的组织,采用无血清原代及传代培养方法,获得具有克隆能力的细胞群;应用免疫细胞化学方法鉴定神经干细胞并检测分化后特异性成熟神经细胞抗原的表达;应用流式细胞检测技术观测神经干细胞随时间向神经元的分化情况。结果从胚胎大鼠脑室下区分离培养的细胞群具有克隆增殖能力,表达神经上皮干细胞蛋白(nestin),分化后的细胞表达神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的特异性抗原;随着贴壁后分化时间的延长,表达nestin的细胞数量从80.5%下降到10.9%,而神经元特异性烯醇化酶(neuronspecificenolase,NSE)阳性细胞数量则从1.1%上升到31.6%。结论用本方法分离的细胞具有自我更新和增殖能力,并具有多分化潜能,是中枢神经系统的干细胞;随着分化时间的延长,神经干细胞数量下降,而神经元比例有明显上升。     

神经组织细胞特异性蛋白在大鼠羊膜上皮细胞中的表达

目的检测神经组织细胞特异性抗原及神经营养因子 3 (NT 3 )、乙酰胆碱转移酶 (ChAT)在大鼠羊膜上皮细胞中的表达。方法从孕 12— 14d的Wistar大鼠羊膜中分离羊膜上皮细胞 ,通过免疫细胞化学检测神经组织细胞特异性抗原 (MAP 2、NSE、GFAP、Nestin、Musashi)及ChAT、NT 3在羊膜上皮细胞中的表达。结果羊膜上皮细胞表达神经干细胞、神经细胞、神经胶质细胞特异性抗原 ,并且在羊膜上皮细胞中有ChAT与NT 3的表达。结论羊膜上皮细胞与神经组织细胞具有一定的同源性 ;羊膜可望作为治疗神经系统疾病新的细胞来源。     

神经干细胞及衍生支持因子在大鼠脊髓损伤后的变化

目的:神经干细胞及其支持因子均与中枢神经损伤后的神经再生有关.但目前有关神经干细胞及其衍生支持因子在体内和脊髓损伤后是否有变化的证据较少。观察神经干细胞及其衍生的神经干细胞支持因子在大鼠脊髓损伤后的变化规律.探讨它们之间的相互关系。方法:实验于2005-09/2006-03在南通大学神经科学研究所实验室完成,①实验材料:清洁级SD大鼠27只由南通大学实验动物中心提供,将12只大鼠分为假手术组和脊髓损伤组用于免疫组织化学.另15只用于RT-PCR检测.分为假手术组和脊髓损伤组.实验过程中对动物处置符台动物伦理学标准。②实验方法:按Allen重物打击法制备大鼠脊髓损伤模型,假手术组仪切除椎板,未行脊髓打击。用免疫组织化学方法鉴定脊髓组织中神经干细胞标志物nestin、胶质细胞标志物GFAP和神经干细胞衍生的神经干细胞支持因子阳性细胞在脊髓损伤后8.16 d的数量和形态变化;采用半定量RT-PCR检测神经干细胞衍生的神经干细胞支持因子mRNA在脊髓中的表达及损伤后4、8、12、16 d的变化。结果:①假手术组脊髓中央管附近出现巢蛋白阳性细胞脊髓损伤后8 d.巢蛋白阳性细胞增多,细胞变大.向外周迁移,并发出突起,以着力侧为著,胶质纤维酸性蛋白阳性细胞出现增多,并出现表达神经干细胞衍生的神经干细胞支持因子阳性类似神经元形态的细胞。脊髓损伤后16 d,nestin阳性细胞数量明显减少,以GFAP阳性细胞增生为主.神经干细胞衍生的神经干细胞支持因子阳性细胞少见。②RT-PCR检测神经干细胞支持因子mRNA在正常大鼠脊髓中有表达,脊髓损伤后4 d神经干细胞支持因子的mRNA表达上升.损伤8 d为高峰,16 d恢复到近正常水平。结论:①在正常大鼠脊髓中央管附近存在神经干细胞.在脊髓损伤后出现增殖,随后可能分化为神经胶质细胞。②在正常脊髓有神经干细胞支持因子表达.脊髓损伤后神经干细胞支持因子的mRNA表达随神经干细胞增殖和分化而增高和下降.两者在脊髓损伤修复中关系密切。     

活化小胶质细胞对骨髓间充质细胞分化方向影响的研究

[目的]为探讨小胶质细胞激活后对骨髓间充质细胞(MSC)转化方向的影响.[方法]采用原代培养法分别培养小胶质细胞及骨髓基质干细胞,不同浓度脂多糖(LPS)激活小胶质细胞,免疫荧光法检测神经胶原纤维酸性蛋白(GFAP)阳性细胞及神经元特异性烯醇化酶(NSE)阳性细胞.[结果]高浓度LPS组激活的小胶质细胞显著提高了MSC的GFAP阳性细胞数,同对照组相比差异有显著性(P＜0.05),而NSE阳性细胞在各组之间均差异无显著性.[结论]激活小胶质细胞能够促进干细胞向胶质细胞的转化.     

应用胎鼠脑源性神经干细胞条件培养液诱导胚胎干细胞的分化

目的:为克服类胚体和视黄酸诱导体系的不足,实验使用胎鼠脑源性神经干细胞条件培养液定向诱导分化胚胎干细胞,观察是否可以获得大量具有高度增殖和进一步分化能力的神经干/祖细胞。方法:实验于2005-06/2006-09在中山大学干细胞与组织工程中心实验室完成。①取孕12.5d的C57BL/6J小鼠胚胎脑组织,放入含有神经干细胞培养液(含B27、肝素5mg/L、碱性成纤维细胞生长因子20μg/L、表皮生长因子20μg/L、100U/mL青霉素、0.1g/L链霉素的DMEM/F12)的离心管内,接种后37℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中饱和湿度培养。3～5d后可见团状细胞球出现,即为原代的神经干细胞。取P5～10代神经干细胞消化成单细胞悬液,以5×104/cm2密度接种于神经干细胞培养液中,4～5d离心后收集上清液,即为胎鼠脑源性神经干细胞条件培养液。②P30代SC1002鼠胚胎干细胞消化成单个细胞后,移入上述制备的条件培养液中,5d后消化细胞,再重新接种于条件培养液中培养5d。常规消化后接种于神经干细胞培养液中,培养4～5d,即得到胚胎干细胞来源的神经干/祖细胞。对照组用神经干细胞培养液代替条件培养液。③所得细胞进行特异性抗原免疫细胞化学染色,并计数免疫染色阳性细胞率。RT-PCR检测标志性基因的表达。结果:①胚胎干细胞分化为神经干/祖细胞的比例:当消化成单个细胞的胚胎干细胞接种到神经干细胞条件培养液后,24h内聚集成细胞球并悬浮生长。免疫细胞化学检测少部分细胞表达nestin,在随后的培养过程中nestin阳性细胞逐渐增多。第4天细胞球周围的细胞几乎全部呈nestin阳性。当消化后重新接种于神经干细胞条件培养液中,可见部分细胞贴壁生长,10d后再常规消化接种于神经干细胞培养液中,呈典型的双极外形,nestin及RC2检测均呈阳性。RT-PCR检测显示Oct-4不再表达,而sox2,sox3,nestin,fabp7及bHLH转录因子均有显著表达。另一方面,当单个胚胎干细胞直接培养在神经干细胞培养液中,大量细胞死亡,仅10%存活,存活细胞表达Oct-4和nestin。②胚胎干细胞来源的神经干/祖细胞向神经元和胶质细胞的分化:经过10～12d的诱导分化,微管相关蛋白2和胶质纤维酸性蛋白细胞阳性率分别为(27.6±9.2)%和(29.7±11.6)%。结论:不需要共培养或添加诱导因子,应用胎鼠脑源性神经干细胞条件培养液成功地将胚胎干细胞定向诱导分化为大量高纯度的神经前体细胞,并进一步得到神经元和神经胶质细胞。     

大鼠脑损伤对移植人胚神经干细胞存活和分化的影响

目的 探讨大鼠脑液压冲击伤(FPI)后对植入的人胚神经干细胞(HNSCs)存活和分化的影响。方法 取8周龄人胎儿大脑皮层细胞，体外培养获得神经干细胞(NSCs)，巢蛋白免疫荧光染色；SD大鼠制作FPI模型．于伤后24h在损伤区移植标有5-溴脱氧脲嘧啶(BrdU)的HNSCs，1周和4周后处死大鼠，邻片行BrdU／微管相关蛋白-2(MAP-2)和BrdU胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫组织化学双染。结果 HNSCs移植后1周可见BrdU阳性细胞向周围迁移，且BrdU／MAP-2双阳性细胞多于BrdU GFAP双阳性细胞；移植后4周BrdU阳性细胞迁移的范围更广，但细胞数量明显减少，脉络丛和微血管中可见BrdU阳性细胞．BrdU／GFAP双阳性细胞多于BrdU／MAP-2双阳性细胞。结论 HNSCs能存活于损伤区域，移植后逐渐分化为星形胶质细胞．且易被内皮吞噬细胞吞噬。     

胚胎大鼠神经干细胞的分离培养及自然分化的初步观察

目的 神经干细胞体外培养的成功是进一步研究其分化机制的基础，从胚胎大鼠脑室下区分离、培养、鉴定神经干细胞(neural stem cells,NSCs)，并观察其向神经元的分化情况。方法 分离胚胎SD大鼠脑室下区的组织，采用无血清原代及传代培养方法，获得具有克隆能力的细胞群；应用免疫细胞化学方法鉴定神经干细胞并检测分化后特异性成熟神经细胞抗原的表达；应用流式细胞检测技术观测神经干细胞随时间向神经元的分化情况。结果 从胚胎大鼠脑室下区分离培养的细胞群具有克隆增殖能力，表达神经上皮干细胞蛋白(nea6n)，分化后的细胞表达神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的特异性抗原；随着贴壁后分化时间的延长，表达nestin的细胞数量从80．5％下降到10．9％，向神经力特异性烯醇化酶(newonspecific enolase，NSE)阳性细胞数量则从1．1％上升到31．6％。结论 用本方法分离的细胞具有自我更新和增殖能力，并具有多分化潜能，是中枢神经系统的干细胞；随着分化时间的延长，神经干细胞数量下降，而神经元比例有明显上升。     

羊膜上皮细胞的体外培养及干细胞特性研究

目的:体外分离培养人羊膜上皮细胞(hAECS)并探讨其生物学特性。方法:取足月产胎儿胎盘,无菌条件下将胎盘的羊膜层与绒毛膜层分离。将洗净的羊膜组织用眼科剪剪成约1mm×1mm大小,加入0.05%的含有0.53mMEDTA4Na的胰酶制备羊膜上皮细胞并进行培养。用免疫荧光、Westernblot等方法检测干细胞相关表面标记物(0CT-4、Nanog、SSEA-4)等的表达情况。结果:根据免疫荧光组织化学,Westernblot的结果显示,羊膜上皮细胞0CT-4、Nanog、ssea-4、Nestin表达阳性。结论:羊膜上皮细胞表达类似胚胎干细胞的表面标志物,可以作为干细胞的新来源。     

羊膜上皮细胞和羊膜间充质干细胞构建组织工程皮肤

背景：由于人胎盘来源的间充质干细胞具有多方面的优点,近年来已成为干细胞研究的热点。目的：分析鉴定羊膜间充质干细胞和羊膜上皮细胞的生物学特性,探讨其作为皮肤种子细胞在三维气液培养构建组织工程皮肤中的应用情况。方法：用胰酶胶原酶多步消化法获取羊膜间充质干细胞和羊膜上皮细胞,通过流式细胞术、反转录-聚合酶链反应和免疫荧光染色技术,鉴定两种细胞的表面分子标记、干细胞特性、与皮肤角质形成细胞的相似性,并利用两种细胞为种子细胞以鼠Ⅰ型胶原为基质进行三维气液培养。结果与结论：①流式细胞术检测体外培养羊膜间充质干细胞和羊膜上皮细胞均高表达CD90、CD73、CDl05,不表达造血干细胞标志CD34以及MHC-Ⅱ类分子HLA-DR。②反转录聚合酶链反应检测到羊膜间充质干细胞表达干细胞特性基因CMCY和NANOG,羊膜上皮细胞表达干细胞特性基因CMCY和KLF4,两种细胞均有干细胞特性。③反转录-聚合酶链反应检测羊膜间充质干细胞表达皮肤角质形成细胞特性基因K19、β1-integrin、K8,羊膜上皮细胞表达K19、β1-integrin、K5、K8,免疫荧光染色见羊膜上皮细胞表达与角质形成细胞增殖相关的的特性蛋白K14,说明羊膜上皮细胞与皮肤角质形成细胞更具相似性,在特定条件下更易于分化为皮肤角质形成细胞。④利用两种细胞成功构建组织工程皮肤,苏木精-伊红染色切片显示其具有一定的皮肤结构,且羊膜上皮细胞发生了初步分化。以上结果说明羊膜间充质干细胞与羊膜上皮细胞通过三维培养构建人皮肤组织是可行的。     

神经组织细胞特异性蛋白在大鼠羊膜上皮细胞中的表达

背景:有证据表明羊膜上皮细胞能够表达神经系统细胞的几乎全部特异性抗原,且可以分泌多种神经营养因子及递质。若羊膜上皮细胞能够代替神经细胞,其神经营养作用必将为治疗神经推行性病变带来广阔前景。目的:检测神经组织细胞特异性抗原在大鼠羊膜上皮细胞中是否表达?设计:重复测量设计。单位:吉林大学第二临床医学院,吉林大学基础医学院组织与胚胎学教研室。材料:实验于2004-10/2005-10在吉林大学基础医学院组织与胚胎学教研室完成。选取清洁级孕12～14d的Wistar大鼠1只,将分离出的羊膜上皮细胞用于实验。小鼠抗大鼠神经元特异性抗原微管相关蛋白、星形胶质细胞特异性抗原胶质原纤维酸性蛋白、乙酰胆碱转移酶单克隆抗体、兔抗大鼠神经元特异性烯醇化酶和NT-3多克隆抗体(武汉博士德公司);大鼠抗大鼠Musashi抗体(日本庆应义塾大学岗野荣之教授惠赠)。方法:取孕12～14d的Wistar大鼠胎盘,剥离羊膜获得上皮细胞,在37℃、体积分数为0.05的CO2环境下,胰蛋白酶消化5min,加入DMEM/F12培养液,以5×109L-1的浓度接种于培养瓶中。培养3d后,细胞以1×108L-1的浓度接种于预先涂有多聚赖氨酸的直径35mm平皿中,用质量浓度为40g/L的多聚甲醛固定20min。采用免疫细胞化学染色方法对神经元特异性抗原微管相关蛋白、神经元特异性烯醇化酶、星形胶质细胞特异性抗原胶质原纤维酸性蛋白、乙酰胆碱转移酶在羊膜上皮细胞中的表达情况进行检测。主要观察指标:①大鼠羊膜上皮细胞不同培养时间的形态观察。②神经组织细胞特异性抗原在大鼠羊膜上皮细胞中的表达情况。结果:①大鼠羊膜上皮细胞不同培养时间的形态观察:羊膜上皮细胞培养24h后,细胞扁平呈成纤维细胞样。3～5d后,胞体饱满,核大而圆,核仁清晰,突起发达,并互相连成网状。②神经组织细胞特异性抗原在大鼠羊膜上皮细胞中的表达情况:培养4d后免疫细胞化学染色结果可见,羊膜上皮细胞表达Nestin、神经元特异性烯醇化酶、乙酰胆碱转移酶以及Musashi、神经元特异性抗原微管相关蛋白、星形胶质细胞特异性抗原胶质原纤维酸性蛋白。结论:羊膜上皮细胞与神经组织细胞具有一定的同源性,可望作为治疗神经系统疾病新的细胞来源。     

兔角膜缘上皮干细胞体外扩增及生物学鉴定

背景:角膜缘干细胞体外培养的关键在于建立稳定的体外培养体系,包括角膜缘干细胞的定位、培养条件、载体选择和鉴别方法等.目的:探索兔角膜缘上皮干细胞体外扩增方法,并对其生物学特性进行鉴定.方法:采用兔角膜缘组织块培养法,以人羊膜为载体,在体外进行兔角膜缘上皮干细胞原代和传代培养.倒置显微镜观察其体外生长特征;苏木精-伊红染色以及扫描电镜观察其形态;AE5和P63单克隆抗体免疫组织化学染色鉴定其蛋白表达.结果与结论:采用组织块培养法可在体外获得角膜缘上皮干细胞,能成功传代培养且保持较高增殖潜能.培养于去上皮羊膜上的干细胞可融合成片,呈"拉网"现象.原代角膜缘上皮干细胞AE5单克隆抗体染色阳性率低于5%,P63染色阳性达90%;随传代次数增加AE5染色阳性率增高,P63染色阳性率降低.结果显示兔角膜缘组织块培养法可以在体外成功获得角膜缘上皮干细胞,原代和传代细胞均具有干细胞特性,以羊膜为载体培养可形成角膜移植片.

Abstract：

BACKGROUND: How to establish a stable in vitro culture system, including location of corneal limbal epithelial stem cells, in vitro sample harvest, in vitro culture, vector selection, as well as identification methods, play a key role in corneal limbal epithelial stem cells culture. OBJECTIVE: To culture the isolated rabbit corneal limbal epithelial stem cells and to identify the biological properties of cultured cells. METHODS: The primary rabbit cornel limbal epithelial stem cells were isolated and cultured with tissue inoculation using human amniotic membrane as vector. The growth features of cells were observed under an inverted microscope. The morphology of cells was observed by hematoxylin-eosin staining and a scanning electron microscope. Furthermore, the monoclonal antibody AE5 and P63 two-step immunohistochemical staining were used to identify limbal epithelial stem cell protein expression. RESULTS AND CONCLUSION: The rabbit corneal limbal epithelial stem cells could be successfully cultured and maintained a relatively high value-added potential in vitro. Rabbit corneal limbal epithelial stem cells cultured on the amniotic membrane pull netted cellular layer. The AE5 monoclonal antibody positive rate of primary cultured cells was about 5% and P63 monoclonal antibody positive up to 90%. AE5-positive rate increased and P63-positive rate decreased with the increase in the number of subculture. The rabbit limbal epithelial stem cells can be successful culture and amplified on human amniotic membrane in vitro by limbal tissue culture method. The cultured cells maintain the characteristics of corneal epithelial cells. The rabbit corneal limbal epithelial stem cells can form grafts on the amniotic membrane.     

兔角膜缘上皮干细胞体外扩增及生物学鉴定

背景：角膜缘干细胞体外培养的关键在于建立稳定的体外培养体系,包括角膜缘干细胞的定位、培养条件、载体选择和鉴别方法等。目的：探索兔角膜缘上皮干细胞体外扩增方法,并对其生物学特性进行鉴定。方法：采用兔角膜缘组织块培养法,以人羊膜为载体,在体外进行兔角膜缘上皮干细胞原代和传代培养。倒置显微镜观察其体外生长特征;苏木精-伊红染色以及扫描电镜观察其形态;AE5和P63单克隆抗体免疫组织化学染色鉴定其蛋白表达。结果与结论：采用组织块培养法可在体外获得角膜缘上皮干细胞,能成功传代培养且保持较高增殖潜能。培养于去上皮羊膜上的干细胞可融合成片,呈＂拉网＂现象。原代角膜缘上皮干细胞AE5单克隆抗体染色阳性率低于5%,P63染色阳性达90%;随传代次数增加AE5染色阳性率增高,P63染色阳性率降低。结果显示兔角膜缘组织块培养法可以在体外成功获得角膜缘上皮干细胞,原代和传代细胞均具有干细胞特性,以羊膜为载体培养可形成角膜移植片。     

豚鼠脂肪间充质干细胞向类神经元样细胞的分化

背景：目前关于耳科干细胞研究的动物实验大多是将其他动物种属的干细胞用于豚鼠模型,而对于豚鼠本身来源的干细胞研究报道极少。目的：探寻豚鼠脂肪间充质干细胞向神经细胞元样分化的潜能。方法：取豚鼠脂肪,分离脂肪间充质干细胞培养至第3代,cck-8试剂盒检测第1~10天细胞增殖A值,流式细胞仪检测细胞的免疫表型;成神经诱导并行巢蛋白、胶质纤维酸性蛋白、神经丝蛋白200免疫荧光染色。结果与结论：豚鼠脂肪间充质干细胞增殖的生长曲线近似＂S＂形,传代后经过3d的潜伏期,3d后进入对数生长期,8d后进入平台期,其细胞的免疫表型CD29表达率86.3%,CD44表达率55.5%,CD45表达率为0.4%,成神经细胞诱导后细胞形态与神经细胞类似,巢蛋白、胶质纤维酸性蛋白、神经丝蛋白200染色均呈阳性。说明豚鼠脂肪间充质干细胞在体外易于分离、培养及扩增,具有向神经细胞元样分化的潜能。     

豚鼠脂肪间充质干细胞向类神经元样细胞的分化

背景:目前关于耳科干细胞研究的动物实验大多是将其他动物种属的干细胞用于豚鼠模型,而对于豚鼠本身来源的干细胞研究报道极少.目的:探寻豚鼠脂肪间充质干细胞向神经细胞元样分化的潜能.方法:取豚鼠脂肪,分离脂肪间充质干细胞培养至第3代,cck-8试剂盒检测第1~10天细胞增殖A值,流式细胞仪检测细胞的免疫表型;成神经诱导并行巢蛋白、胶质纤维酸性蛋白、神经丝蛋白200免疫荧光染色.结果与结论:豚鼠脂肪间充质干细胞增殖的生长曲线近似"S"形,传代后经过3 d的潜伏期,3 d后进入对数生长期,8 d后进入平台期,其细胞的免疫表型CD29表达率86.3%,CD44表达率55.5%,CD45表达率为0.4%,成神经细胞诱导后细胞形态与神经细胞类似,巢蛋白、胶质纤维酸性蛋白、神经丝蛋白200染色均呈阳性.说明豚鼠脂肪间充质干细胞在体外易于分离、培养及扩增,具有向神经细胞元样分化的潜能.     

Cultured human amniotic fluid cells characterized with antibodies against intermediate filaments in indirect immunofluorescence microscopy.

Cells cultured from second trimester human amniotic fluid were characterized in indirect immunofluorescence (IIF) microscopy using specific antibodies against the subunit proteins of different types of cytoskeletal intermediate filaments. Most of the amniotic fluid cell cultures contained only epithelial cells as indicated by the positive keratin-fluorescence in IIF. Five distinct types of keratin-positive cells could be characterized. A dominating cell type (E-1) in most cultures were rapidly proliferating epithelial cells, previously called amniotic fluid cells (AF-cells). These cells showed a fibrillar cytoplasmic fluorescence both with keratin antibodies and with antibodies against vimentin, the fibroblast type of intermediate filament protein. E-1 cells did not show the typical cell-to-cell arrangement of keratin fibrils between the adjacent cells, a characteristic previously found in most cultured epithelial cells. Most of the cultures also contained large epitheloid cells (E-2), showing a fine fibrillar cytoplasmic organization of both keratin- and vimentin filaments, clearly different from that seen in E-1 cells. Several cultures contained two additional epithelial cells both showing the typical cell-to-cell arrangement of keratin fibrils (E-3 and E-4). These two cell types could be distinguished because of their distinct difference in size. E-4 cells typically grew as small cell islands among other epitheloid cells. Amniotic fluid cell cultures occasionally contained also large multinucleated cells (E-5), which appeared to contain large amount of fibrillar keratin. Fibroblastic cells, identified by their decoration only with antibodies against vimentin, were rarely found in amniotic fluid cell cultures. Interestingly, in such cultures some cells with a fibroblastoid appearance were identified as epithelial cells on the basis of the positive keratin-fluorescence. The results show the suitability of IIF with cytoskeletal antibodies in characterization of heterogenous cell populations and indicate that normal amniotic fluid cell cultures mostly contain epithelial cells.     

人羊膜上皮细胞移植修复免臂丛神经损伤

背景：目前人们把目光多集中在干细胞修复脊髓损伤方面,而对于干细胞移植治疗周围神经损伤的研究却不多,尤其人羊膜上皮细胞修复治疗周围神经损伤的研究和报道更少。目的：探讨人羊膜上皮细胞对臂丛神经的修复作用。方法：应用测力神经根拉钩水平牵拉臂丛神经根的方法制备大白兔臂丛损伤模型,提取人羊膜上皮细胞并扩增培养,扫描电子显微镜下观察人羊膜组织及羊膜上皮细胞的超微结构,人羊膜上皮细胞转染绿色荧光蛋白标记并注射入臂丛神经损伤区,苏木精-伊红染色及荧光显微镜观察羊膜上皮细胞对兔臂丛神经损伤的修复作用。 结果与结论：①分离得到的人羊膜上皮细胞表达上皮细胞标志物角蛋白CK19,不表达间充质细胞标志物波形蛋白,不同程度表达CD29,CD73。扫描电子显微镜观察到人羊膜上皮细胞胞体饱满,连接紧密,细胞状态良好。②人羊膜上皮细胞移植到新西兰大白兔臂丛神经损伤模型后18周,免疫荧光检测到神经损伤区可见有表达绿色荧光蛋白的羊膜上皮细胞。③术后6周实验组大白兔前爪功能开始恢复,术后12,18周实验组大白兔前爪功能得到明显改善,功能评分明显提高,对照组几乎没有恢复。以上结果可见人羊膜上皮细胞参与了臂丛神经损伤的修复。