人DR5胞外区域克隆及在大肠埃希菌中表达

目的 克隆人死亡受体5(DR5)cDNA的胞外区域(eDR5),构建原核重组表达载体pGEX-eDR5,使eDR5在大肠埃希菌中表达.方法 采用RT-PCR(反转录PCR)方法从人肝癌细胞HepG2中获得eDR5,然后克隆到pMD19.T载体上进行测序,得到正确的基因片段.经双酶切将目的 基因片段插入到原核表达载体pGEX-4T-1上,测序正确后,转入大肠埃希菌BL21(DE3)中用IPTG诱导表达GST-eDR5融合蛋白,最后用十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测目的 蛋白的表达量.结果 重组克隆载体pMD-eDR5经测序鉴定序列正确.构建的融合表达载体pGEX-eDR5在大肠埃希菌中表达,可溶性目的 蛋白占细菌总蛋白约19%.结论 成功克隆了人DR5 cDNA的胞外区域,并在大肠埃希菌中表达.为下一步分离纯化人DR5重组蛋白,制作多克隆抗体提供基础依据.     

人源性基质金属蛋白酶-1原核表达载体的构建与鉴定

目的构建人源性基质金属蛋白酶-1(MMP-1)原核表达载体. 方法从人肝组织提取总RNA,以此为模板,逆转录巢式 PCR扩增MMP-1全编码区基因片段,构建含目的片段的T载体克隆及原核表达载体pMAL-C2x重组质粒亚克隆,经双酶切及核苷酸测序进行分析鉴定. 结果成功地构建了人MMP-1原核表达载体. 结论构建的人MMP-1原核表达载体,为以后MMP-1融合蛋白的表达并获得具有抗原性的MMP-1融合蛋白奠定了基础.     

胸腺素α1重组原核表达质粒的克隆及诱导表达

目的：构建胸腺素α1（Tα1）基因的原核表达质粒，并诱导表达。方法：根据Tα1的DNA序列设计引物，采用PCR法扩增Tα1的cDNA，将其克隆入T-vector，形成中介重组体pT—Tα1，再将其亚克隆至原核表达载体pGEX-3X，构建重组质粒pGEX-3X-Tα1，用内切酶酶切鉴定及DNA测序分析；将pGEX-3X-Tα1转入大肠杆菌，用RT-PCR方法检测宿主菌中Tα1mRNA，经IPTG诱导，用SDS—PAGE检测有无相应大小的Tα1融合蛋白表达。结果：经DNA测序和SDS—PAGE法鉴定，成功构建了Tα1重组质粒基因工程菌，表达和纯化了具有Tα1融合蛋白。结论：构建的Tα1重组质粒基因工程菌，表达和纯化了具有Tα1融合蛋白，为今后的研究打下了基础。     

铜绿假单胞菌外膜蛋白OprF基因的克隆与原核表达

[目的]克隆铜绿假单胞菌OprF基因,并进行原核表达,以期进一步开展铜绿假单胞菌基因工程疫苗的研究. [方法]利用PCR技术从铜绿假单胞菌基因组中扩增出OprF基因.采用T-A克隆构建pMD18-T-OprF重组质粒,测序正确后经BamH Ⅰ、Hind Ⅲ双酶切获得OprF片段,插入到表达载体pET32a,获得pET32a-OprF重组表达质粒并在表达宿主菌E.Coli BL21中诱导表达,利用Ni-NTA柱对目的蛋白进行纯化,通过SDS-PAGE电泳和蛋白质印迹进行鉴定. [结果]克隆OprF基因(459 bp)并经DNA测序证实,表达重组蛋白OprF并获得纯化蛋白,经SDS-PAGE电泳和蛋白质印迹鉴定正确.[结论]成功克隆了OprF基因并获得原核表达物,为铜绿假单胞菌的致病性研究和开展基因工程疫苗的研制奠定了基础.     

亚洲牛带绦虫NOMO1基因在原核细胞中表达

目的 构建亚洲牛带绦虫NOMO1基因原核重组质粒,进行原核表达、纯化及免疫学研究.方法 以亚洲牛带绦虫成虫cDNA文库中含NOMO1基因的质粒作为模板,扩增该基因,将其克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,测序鉴定重组质粒后再行诱导表达,表达产物通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定,并用蛋白免疫印迹(Western-blotting)分析其免疫反应性.结果 成功建构了原核重组质粒pET28a(+)-NO-MI1.该基因在大肠埃希菌中以包涵体形式存在,破包涵体后纯化蛋白通过SDS-PAGE鉴定结果表明该基因在大肠埃希菌BL-21/DE3得到高效表达.Western blotting结果显示,该重组蛋白可被亚洲牛带绦虫、牛带绦虫病人血清识别,具有免疫反应性.结论 成功克隆亚洲牛带绦虫NOMO1基因、表达和纯化得到了该基因的重组蛋白并且证明该基因具有免疫反应性,为进一步研究该基因的功能提供条件.     

结核分枝杆菌早期分泌蛋白CFP-10的原核表达

目的 构建结核分枝杆菌(MTB)早期分泌蛋白CFP-10原核表达载体并进行诱导表达.方法 通过PCR技术从结核分枝杆菌H37 Rv基因组中扩增出lhp基因片段,目的基因片段克隆至表达载体pET-32a(+),构建pET-32a-CFP-10重组表达质粒,将其转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达.结果 成功地构建原核表达载体pET-32a-CFP-10,以重组体转化E.coli BL21(DE3),成功进行诱导表达.结论 成功构建CFP10的原核表达质粒,高效表达目的蛋白CFP-10,为进一步研究其免疫学功能奠定了基础.     

大鼠生精相关基因TSARG1原核表达载体的构建和表达

目的构建大鼠生精相关基因pGEX-KG/TSARG1重组载体并进行原核表达。方法应用RT-PCR技术从大鼠睾丸组织mRNA中扩增TSARG1的开放阅读框（ORF）,T-A克隆后将TSARG1插入到原核表达载体pGEX-KG中,经测序鉴定后将重组质粒转入宿主菌E.coliBL21,IPTG诱导表达GST/TSARG1融合蛋白。结果成功构建pGEX-KG/TSARG1重组质粒;转化重组质粒的E.coli BL21经IPTG 37℃诱导高效表达GST/TSARG1融合蛋白。结论 pGEX-KG/TSARG1原核表达载体的成功构建为进一步研究TSARG1的生物学功能奠定了基础。     

甲型副伤寒沙门菌鞭毛蛋白fliC-a基因的克隆、原核表达及鉴定

目的:克隆甲型副伤寒沙门菌1相鞭毛蛋白抗原(H1抗原)fliC-a基因,构建原核表达系统并鉴定重组蛋白的抗原性。方法:PCR方法扩增fliC-a基因,克隆到质粒pET-42a构建原核表达载体pET-fliC-a,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导目的重组蛋白rfliC-a表达,用SDS-PAGE鉴定rfliC-a,Western blot和双向免疫扩散法鉴定rfliC-a的抗原性和免疫原性。结果:成功表达并纯化获得相对分子量为14.4 kDa的重组蛋白rfliC-a,rfliC-a能与兔抗甲型副伤寒沙门菌全菌血清发生特异性结合,免疫家兔获得高效价抗体。结论:成功构建了fliC-a基因原核表达系统,所表达的rfliC-a具有良好的抗原性。     

刚地弓形虫活化蛋白激酶C受体1基因的克隆和原核表达及纯化和抗原性分析

目的 克隆刚地弓形虫活化蛋白激酶C受体1(TgRACK1)基因,原核表达、纯化TgRACK1,并分析其抗原性.方法 制备弓形虫RH株速殖子总RNA,根据TgRACK1基因全长编码序列(GenBank登录号:AY547291)的开放阅读框设计引物并进行逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增,扩增产物经双酶切后连接入pGEX-6p-1载体,重组质粒转化大肠埃希菌DH5α,阳性菌落经菌液PCR、双酶切及DNA测序进行鉴定.将重组质粒pGEX-6p-1-TgRACK1转化至大肠埃希菌BL21(DE3)并加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,以十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结合考马斯亮蓝染色检测表达产物;分别以抗GST标签抗体和兔抗弓形虫血清为一抗,免疫印迹(Western blotting)分析鉴定重组蛋白及其抗原性.重组融合蛋白经GST琼脂糖凝胶亲和纯化,纯化蛋白经SDS-PAGE分离,考马斯亮蓝染色结合凝胶成像系统分析其纯度.结果 RT-PCR扩增产物约为970 bp,重组质粒pGEX-6p-1-TgRACK1构建成功.经IPTG诱导获得相对分子质量约63 kDa的可溶性重组蛋白.诱导表达的蛋白质为带GST标签的重组融合蛋白,且能被兔抗弓形虫血清识别.亲和纯化后获得纯度大于95％的重组TgRACK1蛋白质.结论 克隆得到弓形虫活化蛋白激酶C受体1基因,原核表达并纯化出该基因编码的蛋白质,且该重组蛋白具有抗原性.     

人ZP3融合蛋白的原核表达

目的:在原核中表达人卵透明带蛋白3(zone pelluc ida,ZP3)。方法:将人ZP3基因的核心片段克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中。经酶切和序列分析后,用重组质粒转化大肠杆菌BL21,并经丙基β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导产生GST-ZP3融合蛋白。结果:重组菌株明显诱导表达出预期分子质量为63 000 D的融合蛋白。结论:成功地构建GST-ZP3融合蛋白表达载体,并在大肠杆菌中表达GST-ZP3融合蛋白,为进一步开展免疫避孕与生殖免疫的研究奠定基础。     

Ⅰ型流感病毒核蛋白（NP）基因在大肠杆菌中的表达与鉴定

目的：以Ⅰ型流感病毒RNA为模板扩增NP全基因cDNA，并在大肠杆菌中进行表达与鉴定。方法：提取流感病毒RNA，以RT—PCR法扩增编码NP基因cDNA。将扩增所得NP基因克隆于pMD18-T载体，然后定向亚克隆NP基因于原核表达载体pET-28a的多克隆位点中，经酶切鉴定后，将含有NP基因的重组质粒命名为pET-NP。用pET-NP转化受体菌BL21，在大肠杆菌BL21中表达，用诱导剂IPTG以不同浓度进行诱导，并在不同诱导时间收集样品，用SDS-PAGE和Western blot检测表达产物。结果：经SDS-PAGE电泳分析证实NP基因获得了表达，并在终浓度为1mM的IPTG诱导下，6h其表达量达到高峰，经Western—blot分析证实表达的重组核蛋白具有免疫反应活性，大小约为60kd。结论：流感病毒核蛋白基因编码区基因获得成功克隆和构建，为流感病毒诊断试剂及单抗的研制工作提供了基础材料。     

H7N9亚型禽流感病毒核蛋白NP原核表达载体的构建与表达

目的构建甲型H7N9禽流感病毒NP基因的原核表达载体,并表达其编码重组蛋白。方法 RT-PCR法扩增H7N9病毒NP基因,克隆至原核表达载体PET28a(+)中,构建表达载体PET28a(+)-NP质粒;经PCR、双酶切、测序鉴定后,将PET28a(+)-NP质粒转化表达菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达NP重组蛋白。应用western blot法鉴定NP蛋白的表达。结果成功构建NP基因的原核表达载体,在大肠杆菌中表达出分子量为56kD的NP重组蛋白。结论实现了禽流感病毒H7N9NP重组蛋白在原核系统中的高效表达,为禽流感诊断试剂及单抗的研发工作奠定了基础。     

自身免疫性肝炎新型抗原分子高迁移率族蛋白B1的克隆表达鉴定及蛋白纯化

目的获得高纯度的人高迁移率族蛋白B1(high mobility group box-1 protein,HMGB1),为制备单克隆抗体及研究其与自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis,AIH)的关系打基础。方法应用PCR从乳腺文库中扩增得到HMGB1基因片段,并将其克隆到pET28a( )载体上,对获得的pET28a( )-HMGB1重组质粒扩增后进行PCR、酶切和测序鉴定。将鉴定完全正确的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导重组蛋白表达,表达产物经SDS-PAGE电泳分析和Western blotting鉴定。最后进行大量诱导并纯化,得到带His标签的HMGB1蛋白。结果成功构建pET28a( )-HMGB1重组质粒,并经诱导表达,得到了纯化的His-HMGB1蛋白。结论构建pET28a( )-HMGB1重组质粒并得到其表达蛋白,为今后深入研究HMGB1在AIH中的作用机理提供有力的实验工具。     

亚洲牛带绦虫WD40基因表达及免疫学分析

目的 对亚洲牛带绦虫WD40基因进行克隆、表达和免疫学研究.方法 将亚洲牛带绦虫成虫WD40基因克隆到原核表达质粒pET-28a( )中,在大肠埃希菌BL-21/DE3中用异丙硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导表达,表达产物通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定,用镍离子金属螯合剂亲和层析柱进行纯化,纯化的重组蛋白用免疫印迹试验(Western Blotting)进行免疫学分析.结果 PCR、双酶切及DNA测序结果均表明,pET-28a( )-WD40重组质粒构建成功.SDS-PAGE结果表明,目的 基因在大肠埃希菌BL-21/DE3中获得高效表达.重组蛋白能识别感染了亚洲牛带绦虫的猪血清和患者血清,表明其具有免疫反应性.结论 亚洲牛带绦虫WD40基因可在原核表达系统中获得具有免疫学活性的表达,为进一步研究该蛋白的功能提供了基础依据.     

结核分枝杆菌Rv2994基因原核表达及鉴定

目的构建结核分枝杆菌Rv2994基因原核表达载体并进行表达,为进一步研究奠定基础。方法PCR扩增Rv2994基因编码序列,定向克隆入融合蛋白原核表达载体pGEX-1λT获得重组表达质粒pGEX-2994,转化大肠杆菌测序后诱导表达,纯化目的蛋白并免疫新西兰大白兔获取多价抗体。结果从结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA中扩增出Rv2994基因,成功构建了融合表达质粒pGEX-Rv2994,转化大肠杆菌JM109后,经IPTG诱导,表达出约73kDa重组融合蛋白,用Western blotting证实其有良好的抗原性,纯化蛋白免疫新西兰大白兔,获得了高效价的抗体。结论成功构建了原核表达载体pGEX-2994,获得并纯化了GST-Rv2994融合蛋白,制备了高效价的多价血清,为Rv2994基因的功能研究奠定了基础。     

附睾蛋白酶抑制剂Eppin蛋白的原核表达及纯化

目的 构建人附睾蛋白酶抑制剂Eppin蛋白的重组质粒pET28a(+)-Eppin,并研究该质粒在原核细胞中的表达及纯化.方法 本研究以人睾丸组织cDNA为模板获得人Eppin基因片段,将其插入pET28a(+)载体His6-Tag上游,构建重组质粒pET28a(+)-Eppin,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IP...     

肠道病毒71型重组VP1蛋白的原核表达及初步鉴定

目的利用大肠杆菌原核表达系统表达并纯化肠道病毒71型(EV71)VP1蛋白,并对重组蛋白功能进行初步鉴定。方法 PCR扩增EV71VP1全长基因,在测序正确的基础上,将其插入表达载体pET28a(+),构建表达质粒pET28a(+)/VP1,转化表达菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,利用Ni 2+亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,经ELISA和Western Blot,验证EV71VP1的抗原性。结果成功构建pET28a(+)/VP1重组质粒,经大肠杆菌表达、纯化获得分子量约为43kDa的融合蛋白,经ELISA和Western Blot,结果显示该蛋白有良好的抗原性。结论实现了肠道病毒7l型VP1蛋白的原核高效表达,为肠道病毒71型诊断试剂和疫苗的研究奠定基础。     

人肿瘤坏死因子相关凋亡配体克隆、表达及纯化

目的应用基因工程技术克隆人肿瘤坏死因子相关凋亡配体分子胞外区(TRAIL)114~281片段的cDNA,构建其原核表达载体,建立原核表达体系。方法采用RT-PCR方法从外周血单个核细胞的总RNA中扩增TRAIL分子的cDNA,克隆入T载体,阳性克隆经过RT-PCR、酶切和测序鉴定。将阳性克隆中TRAIL再亚克隆至原核表达载体pET28a,构建的表达载体用RT-PCR和酶切来验证,IPTG诱导表达。融合表达蛋白复性后,再用层析纯化表达产物。结果电泳显示RT-PCR产物约500bp,与预期值一致。TA克隆RT-PCR和酶切鉴定时的片段大小也为500bp。阳性克隆测序结果与GeneBank报道一致。构建的原核表达载体经RT-PCR和酶切鉴定后用IPTG诱导后,得到大量的融合表达蛋白,此蛋白是以包涵体形式存在的,对表达的蛋白复性和纯化后,电泳显示得到一条约20kD的蛋白条带。结论成功地构建了人肿瘤坏死因子相关凋亡配体分子原核表达载体。