大鼠Clara细胞分泌蛋白CC16基因的克隆和原核表达及纯化

目的 克隆大鼠Clara细胞分泌蛋白(CC16)基因,原核表达并纯化重组的CC16蛋白,为进一步研究CC16蛋白的功能及对炎症性气道疾病的治疗作用奠定基础.方法 制备大鼠肺组织总RNA,根据大鼠CC16基因全长编码序列(GenBank登录号:NM_013051)的开放阅读框设计引物并进行逆转录PCR(RT-PCR)扩增,扩增产物经双酶切后连接入pET30a(+)载体,重组质粒转化大肠埃希菌(E.coli DH5α),阳性菌落经PCR和双酶切鉴定并测序.将重组质粒pET30a(+)-rCC16转化至E coli Rosetta(DE3)并加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结合考马斯亮蓝染色检测表达产物,重组融合蛋白经Ni2+琼脂糖凝胶亲和纯化.分别以抗His标签抗体和山羊抗CC16抗体进行免疫印迹(Western blotting)分析并鉴定重组蛋白.结果 RT-PCR扩增产物约为290 bp.菌落PCR、双酶切及测序结果显示,重组质粒pET30a(+)-rCC16构建成功.SDS-PAGE结果显示,经IPTG诱导获得相对分子质量约16 kDa的可溶性重组蛋白.Western blotting结果表明,诱导表达的蛋白质为带His标签的重组融合蛋白,且能被山羊抗CC16抗体识别.结论 成功构建基因重组体pET30a(+)-rCC16,并制备出可溶性大鼠重组CC16蛋白.     

人肺癌相关基因HLCDG1在大肠杆菌中的表达

目的构建新克隆的肺癌抑瘤基因候选者HLCDG1的融合表达质粒pGEX-6P-1/HLCDG1并在原核表达系统中表达。方法采用多聚酶链式反应(PCR)扩增HLCDG1基因蛋白编码序列,将该片断插入原核表达载体pGEX-6P-1中,转化大肠杆菌BL-21扩增。构建的融合表达质粒经酶切和测序鉴定后,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE后考马斯亮蓝染色和W estern b lot鉴定实验结果。结果构建的融合表达质粒酶切和测序鉴定阅读框架正确,导入大肠杆菌中经IPTG诱导出一条分子量约为46kD的新蛋白带,主要存在于细菌沉淀中,W estern b lot鉴定其为GST-HLCDG1融合蛋白。结论HLCDG1基因编码的蛋白质能够在原核细胞中有效表达,为进一步研究该蛋白质的结构和功能奠定研究基础。     

柱上切除GST标签制备幽门螺杆菌Lpp20蛋白

目的表达幽门螺杆菌Lpp20-GST融合蛋白,获取切除GST标签的重组蛋白。方法采用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组表达质粒Lpp20/pGEX-4T-1在大肠埃希菌BL21(DE3)中表达,收集菌体并采用反复冻融、溶菌酶裂解及超声破菌3种细胞破碎方法,表达产物在谷胱甘肽琼脂糖树脂4B柱上纯化,利用凝血酶切除GST标签,用鼠抗Lpp20单克隆抗体进行纯化产物western blot鉴定。结果高效表达出Lpp20-GST融合蛋白,相对分子质量约为4.5 kDa,产物以部分可溶性形式表达,凝血酶成功切除GST标签,纯化产物能被鼠抗Lpp20单克隆抗体识别。结论凝血酶柱上切除GST标签获得目的蛋白。     

单纯疱疹病毒2型糖蛋白G的表达、纯化及鉴定

目的 对pGEX-4T- 1/gG-2重组质粒进行诱导表达,并纯化、鉴定表达的目的蛋白.方法 用最佳诱导条件对重组质粒进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE电泳检测验证后,对存在于超声离心上清液中的融合蛋白用亲和层析技术进行纯化,并用ELISA间接法对纯化的GST/gG-2融合蛋白的灵敏性和特异性等生物活性进行鉴定.结果 目的蛋白经诱导后表达于上清中,经鉴定纯化的目的蛋白保留了天然蛋白原有的生物活性.结论 GST/gG-2融合蛋白的获得,为研制以重组蛋白代替传统的全病毒作为检测抗原的新型HSV-2型特异性免疫学检测试剂盒奠定了基础.     

华支睾吸虫蛋白酶体β1新基因克隆与表达

目的通过筛选华支睾吸虫cDNA文库发现蛋白酶体β1（CsPSMB1）新基因。表达其重组蛋白，为进一步研究CsPSMB1的功能及应用提供基础数据。方法将插入于pBluscripetⅡSK（＋）载体中的cDNA随机测序。发现CsPSMB1新基因。根据pGEX-4T-1的多克隆位点及CsPSMB1编码区序列设计引物，进行PCR扩增。双酶切后连接到pGEX-4T-1载体中。重组表达质粒pGEX-4T-1-CsPSMB1经PCR、双酶切及测序鉴定后，转化大肠埃希菌BL21（DE3），异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达，表达产物经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）鉴定。结果发现了编码PSMB1基因的一个新成员CsPSMB1，CsPSMB1全长749个核苷酸，编码一个217个氨基酸残基的蛋白。理论分子量为24kD。预测的蛋白与人的PSMB1蛋白同源性为50％并且含有一个蛋白酶体结构域。序列已经成功登录GeneBank，登录号为AY849971。构建成功重组质粒pGEX-4T-1-CsPSMB1，经IPTG诱导后表达出PSMB1的GST融合蛋白。结论发现了华支睾吸虫新基因CsPSMB1，成功构建pGEX-4T-1-CsPSMB1重组表达载体并表达出了CsPSMB1的GST融合蛋白。     

结核分枝杆菌Rv2994基因原核表达及鉴定

目的构建结核分枝杆菌Rv2994基因原核表达载体并进行表达,为进一步研究奠定基础。方法PCR扩增Rv2994基因编码序列,定向克隆入融合蛋白原核表达载体pGEX-1λT获得重组表达质粒pGEX-2994,转化大肠杆菌测序后诱导表达,纯化目的蛋白并免疫新西兰大白兔获取多价抗体。结果从结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA中扩增出Rv2994基因,成功构建了融合表达质粒pGEX-Rv2994,转化大肠杆菌JM109后,经IPTG诱导,表达出约73kDa重组融合蛋白,用Western blotting证实其有良好的抗原性,纯化蛋白免疫新西兰大白兔,获得了高效价的抗体。结论成功构建了原核表达载体pGEX-2994,获得并纯化了GST-Rv2994融合蛋白,制备了高效价的多价血清,为Rv2994基因的功能研究奠定了基础。     

甲型副伤寒沙门菌鞭毛蛋白fliC-a基因的克隆、原核表达及鉴定

目的:克隆甲型副伤寒沙门菌1相鞭毛蛋白抗原(H1抗原)fliC-a基因,构建原核表达系统并鉴定重组蛋白的抗原性。方法:PCR方法扩增fliC-a基因,克隆到质粒pET-42a构建原核表达载体pET-fliC-a,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导目的重组蛋白rfliC-a表达,用SDS-PAGE鉴定rfliC-a,Western blot和双向免疫扩散法鉴定rfliC-a的抗原性和免疫原性。结果:成功表达并纯化获得相对分子量为14.4 kDa的重组蛋白rfliC-a,rfliC-a能与兔抗甲型副伤寒沙门菌全菌血清发生特异性结合,免疫家兔获得高效价抗体。结论:成功构建了fliC-a基因原核表达系统,所表达的rfliC-a具有良好的抗原性。     

弓形虫微线体蛋白8胞质尾蛋白的表达及纯化

目的 制备弓形虫微线体蛋白8羧基端胞质尾(MIC8t)蛋白片段.方法 以弓形虫基因组为模板,PCR扩增MIC8t基因片段,构建MIC8t/pGEX-4T-1原核表达系统;IPTG诱导表达GST-MIC8t融合蛋白;亲和层析纯化融合蛋白.结果 构建了MIC8t原核表达系统,表达并纯化了GST-MIC8t融合蛋白.结论 在体外制备并纯化了GST-MIC8t融合蛋白,为后续研究MIC8t的功能奠定了基础.     

H5N1型流感病毒M2蛋白全长编码基因的克隆与原核表达

目的:构建H5N1流感病毒基质蛋白M2基因的原核表达系统,为研究其在体液免疫中的作用奠定物质基础。方法:应用PCR方法从流感病毒H5N1cDNA中扩增出M2的全基因序列,插入至表达质粒载体pGEX6P-3上,构建重组原核表达质粒pGEX-6p-3/M2。重组质粒经测序分析确认后,转化感受态大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达M2蛋白后,对其表达产物进行SDS-PAGE和Western Bloting分析。结果:PCR扩增的M2基因长度为297bp,经酶切和测序分析,插入到载体的基因与GeneBank公布的序列相似性达100%;SDS-PAGE和Westem Bloting分析显示,经IPTG诱导出分子质量为37.2 KD的目的蛋白。结论:成功构建了H5N1流感病毒基质蛋白M2原核表达载体pGEX-6p-3/M2,并在大肠杆菌中获得表达。     

脆性X智力低下蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化

目的:在大肠杆菌中对脆性X智力低下蛋白(FMRP)进行重组表达,获得高产量及高纯度的可溶性重组蛋白。方法:以人脑cDNA文库为模板,PCR扩增FMR1基因后将其克隆至融合表达载体pGEX-6P-1中,重组载体转化进入大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,并用IPTG进行诱导表达。应用谷胱甘肽-琼脂糖凝胶4B进行亲和层析纯化GST-FMRP融合蛋白,并以SDS-PAGE电泳和Westernblot对融合蛋白的表达进行检测。结果:亲和纯化后的融合蛋白经FMRP及GST单抗分别进行Westernblot鉴定为GST-FMRP融合蛋白。结论:大肠杆菌中FMRPISO10的重组表达产量高,纯化得到可溶性重组蛋白,为FMRP抗体的制备及FXS检测试剂盒的开发奠定基础。     

1996 outlook: systems, for-profit chains, medical groups, religious healthcare, managed care, post-acute care, finance, purchasing, info systems, labor, legal, construction

It's put-up-or-shut-up time for healthcare providers in 1996. Two years ago, everyone talked about fixing the healthcare system. Not much happened. Last year, providers and politicians concentrated on squeezing medical costs. According to some of Modern Healthcare's key beat reports, this year it's back to the basics of running a business.     

机体代谢变化与晕船的关系

目的　探讨晕船对血清铁、铜、锌、尿素氮、肌酐、乳酸脱氢酶、肌酸激酶的影响。方法　以 3 0名 2 0～ 2 2岁男学员为研究对象 ,测定出航前与晕船发生后的血清铁、铜、锌和尿素氮、肌酐、乳酸脱氢酶、肌酸激酶的变化。结果　出航前、后受试者血清锌、铁、尿素氮、肌酐的含量分别为 (10 60± 0 3 3 ) μmol/L ,(2 0 48± 0 96) μmol/L ,(4 2 9±0 18)mmol/L ,(88 13± 3 0 3 ) μmol/L和 (11 98± 0 44 ) μmol/L ,(9 68± 0 66) μmol/L ,(7 11± 0 3 0 )mmol/L ,(10 8 5 9± 3 90 ) μmol/L ,差异有显著性 (P <0 0 1) ;血清铜、乳酸脱氢酶、肌酸激酶在航行前后分别为 (14 2 9± 1 10 ) μmol/L、(12 9 3 3± 4 12 )U/L、(2 17 13± 40 0 4)U/L和 (13 67± 0 5 6) μmol/L、(146 63± 9 2 2 )U/L、(148 0 7± 9 94)U/L ,无显著性差异。结论　晕船对血清微量元素和尿素氮、肌酐含量有显著影响 ,表现为血清锌、尿素氮、肌酐显著升高 ,血清铁显著下降 ,而对血清铜、乳酸脱氢酶、肌酸激酶无明显影响