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目的构建人源性严重发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)单链抗体(scFv)文库,并用SFTSV颗粒对文库进行初步筛选。方法提取8例SFTS恢复期患者外周血淋巴细胞的总RNA,逆转录为cDNA;并以此为模板PCR扩增人源抗体轻链库(Vκ和Vλ)和重链库(VH),再经过重叠PCR随机拼接成scFv基因文库,最后克隆入噬菌粒载体pComb3XSS中,将重组噬菌粒电转化感受态XL1-Blue细胞,得到SFTSV抗体文库,检测文库库容及多样性,并用SFTSV颗粒作抗原对抗体文库进行初步筛选。结果构建的人源SFTSV抗体文库的库容为2.8×10~7,测序结果表明文库多样性好,经过初步筛选获得21个克隆的人源化scFv,具有与SFTSV颗粒结合的活性。结论成功构建了人源抗SFTSV的scFv文库。 相似文献
2.
目的克隆、表达发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(SFTSV)非结构蛋白NSs,对其功能初步鉴定。方法采用PCR法扩增经密码子优化后的SFTSV NSs基因,并克隆至PGEX-4T-2载体中,构建原核表达载体PGEX-4T-2-NSs,经酶切、测序鉴定后转化表达菌BL21(DE3),再经诱导、纯化得到谷胱甘肽S-转移酶(GST)-NSs融合蛋白,用Western Blot验证融合蛋白GST-NSs的抗原性。结果成功构建了GST-NSs融合蛋白原核表达载体,并在BL21细菌中获得高效表达;纯化后的融合蛋白具有良好的抗原性。结论实现了SFTSV重组NSs蛋白的原核高效表达,为进一步深入研究其结构与功能奠定了基础。 相似文献
3.
目的基于上转化发光(UPT)免疫层析技术,建立发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)总抗体的现场快速检测方法。方法将SFTSV重组NP蛋白与上转化发光颗粒(UCP)偶联,制备UCP-NP免疫层析试纸条,评价该试纸条检测SFTSV总抗体的灵敏性、特异性和稳定性,并检测SFTSV血清254份,与酶联免疫法(ELISA)比较。结果该方法可在15min内完成SFTSV总抗体检测,可检测1∶500稀释度的SFTSV阳性血清,与其他出血热病毒无交叉反应,加样14d内稳定性较高。UPT免疫层析法与ELISA法检测临床血清样品一致性极高(Kappa=0.967),约登指数为0.973。结论建立了基于UPT免疫层析技术的SFTSV总抗体快速检测方法,该方法灵敏、特异,且操作简便、快速,结果稳定,适合在基层门诊和体检现场推广。 相似文献
4.
[目的]构建甲型流感病毒H1N1亚型NS1蛋白真核表达载体,并在293T细胞中表达.[方法]采用RT-PCR技术,从甲型流感病毒H1N1毒株提取的病毒总RNA中,扩增NS1全长基因,将其克隆至pMD18-T Vector中构建pMD18-T-NS1质粒,双酶切pMD18-T-NS1与PXJ40-HA后,构建真核表达载体PXJ40-HA-NS1,经酶切及测序鉴定后将质粒转染到293T细胞中,通过免疫印迹法鉴定NS1蛋白的表达.[结果]酶切、测序证明重组真核表达载体PXJ40-HA-NS1构建成功,免疫印迹法可见NS1基因编码蛋白表达.[结论]成功构建甲型流感病毒H1N1亚型NS1蛋白真核表达载体PXJ40-HA-NS1,并在293T细胞中传染表达,该表达载体的构建为后期建立稳定表达NS1蛋白的细胞模型和NS1蛋白功能研究提供了材料. 相似文献
5.
目的:构建甲型H1N1流感病毒非结构蛋白NS1真核表达载体并表达其编码蛋白(转染293T细胞)。方法:从江苏首例甲型H1N1流感病毒毒株(A/Nan jing/1/2009(H1N1))提取病毒RNA,采用RT-PCR技术扩增NS1全长基因,将其克隆至pMD18-T Vector中构建pMD18-T-NS1质粒,双酶切pMD18-T-NS1与PXJ40-HA后,构建真核表达载体PXJ40-HA-NS1,经酶切及测序鉴定后将质粒转染到293T细胞中,通过Western blot鉴定NS1蛋白的表达。结果:经双酶切、测序鉴定证实NS1基因的真核表达载体构建成功。West-ern blot法可见NS1基因编码蛋白的成功表达。结论:成功克隆NS1全长基因,并构建了其真核表达载体,该表达载体的构建为后期建立稳定表达NS1蛋白的细胞模型和NS1蛋白功能研究提供了材料。 相似文献
6.
目的筛选及表达抗严重发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)包膜糖蛋白(Gn)单链抗体(scFv)。方法利用人源化SFTSV的scFv文库与固相化包被的SFTSV-Gn蛋白特异性结合,经过4轮"吸附-洗脱-扩增"筛选能特异性结合SFTSV-Gn蛋白的噬菌体scFv,随机挑取最后一轮单菌落进行噬菌体-ELISA鉴定,将经过测序鉴定正确的阳性克隆转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中原核表达,用Western blot法鉴定scFv的表达, ELISA鉴定纯化后scFv的结合活性。结果筛选出3株不同序列的抗SFTSV-Gn蛋白的scFv, Western blot法结果显示scFv得到正确表达, ELISA结果显示纯化后的scFv具有结合活性。结论成功筛选及表达了抗SFTSV-Gn蛋白的scFv。 相似文献
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目的:构建甲型H3N2流感病毒非结构蛋白-1( nonstructal-1,NS1)真核表达载体并表达其编码蛋白;探讨NS1对细胞增殖的影响?方法:从江苏省甲型H3N2流感病毒毒株提取病毒RNA,采用RT-PCR技术扩增NS1全长基因,将其克隆至pMD18-T Simple Vector中构建pMD18-T/NS1质粒,双酶切pMD18-T/NS1与pXJ40-HA后,构建真核表达载体pXJ40-HA-NS1,经酶切及测序鉴定后将质粒转染到293T细胞中,通过免疫印迹法鉴定NS1蛋白的表达?3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐[3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide,MTT]法检测NS1转染细胞后对细胞增殖的影响? 结果:经双酶切?测序鉴定证实NS1基因的真核表达载体构建成功;免疫印迹法证实NS1蛋白的表达?MTT法证实转染NS1质粒后对细胞增殖有抑制作用?结论:成功克隆了NS1全长基因,构建了其真核表达载体,并初步验证了NS1蛋白过表达后能抑制细胞的增殖,该表达载体的构建为后期建立稳定表达NS1的细胞模型和NS1蛋白对细胞增殖和凋亡作用机制的进一步研究提供了基础? 相似文献
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目的分段表达发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(SFTSV)Gn和Gc蛋白。方法采用PCR方法克隆了SFTSV Gn和Gc基因上三段相互重叠的基因片段Gn1、Gn2、Gn3、Gc1、Gc2、Gc3,将PCR产物分别连接到原核表达载体pET28a(+)上,经酶切、PCR、测序鉴定,获得重组质粒pET28a-Gn(Gn1)、pET28a-Gn(Gn2)、pET28a-Gn(Gn3)、pET28a-Gc(Gc1)、pET28a-Gc(Gc2)、pET28a-Gc(Gc3),将其分别转化感受态菌BL21,IPTG诱导表达,通过Western blot鉴定Gn1、Gn2、Gn3、Gc1、Gc2、Gc3蛋白的表达。结果成功构建重组质粒pET28a-Gn(Gn1)、pET28a-Gn(Gn2)、pET28a-Gn(Gn3)、pET28a-Gc(Gc1)、pET28a-Gc(Gc2)、pET28a-Gc(Gc3),Western blot可见Gn1、Gn2、Gn3、Gc1、Gc2和Gc3编码蛋白的成功表达。结论 Gn和Gc蛋白的分段表达成功,为进一步深入研究SFTSV的Gn和Gc蛋白结构与功能及精确定位其抗原表位奠定了基础。 相似文献
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目的构建高致病性禽流感病毒H5N1亚型核蛋白(NP)的真核表达载体,并在哺乳动物细胞中表达、鉴定其编码重组蛋白NP。方法采用RT-PCR法扩增NP基因,T-A克隆到pMD18-T载体中构建pMD18-T-NP质粒。经PCR、双酶切鉴定后,双酶切阳性质粒与pXJ40-HA载体,电泳后胶回收,连接目的片段,构建pXJ40-HA-NP质粒,经PCR、双酶切、测序分析鉴定为阳性的质粒即为NP蛋白的真核表达载体。转染293T细胞后,采用免疫印迹法(Western blot)鉴定重组NP蛋白的表达。结果成功构建了高致病性禽流感病毒H5N1亚型NP基因的真核表达载体,并在293T细胞中成功表达出分子量为56kD的重组蛋白。结论成功构建的NP蛋白真核表达载体为进一步研究其功能,研发高致病性禽流感病毒H5N1亚型的诊断、治疗方法和疫苗奠定了基础。 相似文献
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