人重组钙依赖性磷脂结合蛋白V在大肠杆菌中的高效表达、纯化及细胞凋亡检测

目的：为细胞凋亡研究提供快速可靠的实验方法。方法：利用RT－PCR技术从人外周血单核细胞系U937 cDNA文库中扩增出编码钙依赖性磷脂结合蛋白V（Annexin V) cDNA,并克隆到大肠杆菌表达载体中,在大肠杆菌中表达含凝血酶识别序列的MS2 Annexin V融合蛋白。表达产物经凝血酶消化,可除去MS2细菌蛋白,再经离子交换层板纯化,可得成熟的Annexin V纯品,FITC标记后的Annexin V可用于细胞凋亡的检测。结果：在大肠杆菌表达的人重组Annexin V占菌体蛋白的56％,经纯化获得99％纯度的非融合型Annexin V,FITC标亡的Annexin V能有效地检测凋亡细胞。结论：成功地建立了批量获取Annexin V的技术路线,为推广高效检测凋亡技术提供了基础。     

冠心病患者血小板膜连蛋白Ⅴ及P选择素的检测及临床意义

人膜连蛋白Ⅴ（AnnexinⅤ）是钙离子依赖的磷脂结合蛋白Annexin家族成员之一，与人AnnexinⅤ有关的血栓形成机制是当前血栓学研究的热点课题之一。冠心病是严重威胁人类生命健康的常见疾病，冠状动脉粥样斑块破裂后血小板活化与血栓形成存在密切关系。我们应用流式细胞术（FCM）检测冠心病患者血小板AnnexinⅤ及P选择素（CD62p）的变化，以探讨其临床意义。     

不同胃癌证型中Annexin V的表达差异研究

目的研究Annexin V在脾胃虚寒、痰食交阻、痰淤互结三种证型中的表达差异，为胃癌辨证提供实验支持。方法采用链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物（SABC）免疫组化方法检测55例胃癌组织中Annexin V蛋白；并与慢性胃炎比较，确定其表达特点。结果在三种证型中，Annexin V表达有显著性差异；与慢性浅表性胃炎比较表达也有显著差异。结论Annexin V在不同证型及非肿瘤病变中表达有特异性，可以作为辨证论治的参考依据。     

三氧化二砷诱导神经母细胞瘤细胞凋亡及对livin基因表达的影响

目的探讨三氧化二砷(As2O3)诱导人神经母细胞瘤 SK-N-SH 细胞凋亡效应及其对livin基因表达的影响.方法比色法观察As2O3对神经母细胞瘤 SK-N-SH 细胞增殖的影响;Annexin V荧光探针和流式细胞仪检测早期凋亡细胞;RT-PCR 分析转染前后livin mRNA 的表达;Western检测Livin蛋白的表达.结果 As2O3 明显抑制 SK-N-SH 细胞的增殖; As2O3诱导 SK-N-SH 细胞凋亡时livin基因表达降低.结论 livin基因表达降低可能是As2O3诱导神经母细胞瘤细胞凋亡的机制之一.     

奥曲肽诱导人胆管癌细胞凋亡过程中细胞内游离钙的变化

目的 探讨奥曲肽是否通过诱导人胆管癌细胞凋亡而抑制肿瘤生长，以及与细胞内游离钙的关系。方法 采用人胆管癌细胞SK－ChA-1，应用生长曲线，片段DNA琼脂糖凝胶电泳，Annexin V-FITC技术及激光共聚焦显微镜技术等方法进行检测和观察。结果 在奥曲肽作用下SK－ChA-1细胞生长受抑制。奥曲肽处理SK－ChA-1细胞后，Annexin V标记的凋亡细胞增多，DNA凝胶电泳显示典型的凋亡梯状图谱。细胞凋亡的同时细胞内游离钙浓度升高。结论 奥曲肽通过细胞内游离钙的变化，诱导人胆管癌细胞凋亡，是奥曲肽抑制胆管癌生长的机理之一。     

免疫抑制剂对人外周血活化T淋巴细胞凋亡的影响

目的研究免疫抑制剂霉酚酸(MPA)和环孢素A(CsA)对人外周血活化T淋巴细胞凋亡的影响,并探讨其作用的途径及机理.方法以植物血凝集素M活化人外周血T淋巴细胞,光学显微镜及透射电镜观察细胞凋亡的形态学特征,琼脂糖凝胶电泳检测DNA断裂,流式细胞仪分析细胞膜联蛋白V(Annexin V)表达.结果MPA作用后,外周血活化T淋巴细胞出现凋亡特征性形态改变和DNA梯形条带,CsA作用后则无此表现.0.1～10mmol/L的MPA作用外周血活化T淋巴细胞24、48h,Annexin V阳性细胞均明显增加(P＜0.05或0.01),并呈药物浓度依赖性(r=0.752,P＜0.01)和作用时间依赖性(r=0.583,P＜0.01);0.1～1mmo/L CsA作用外周血活化T淋巴细胞24、48h,Annexin V阳性细胞均明显减少(均P＜0.05).结论治疗浓度的MPA可诱导人外周血活化T淋巴细胞凋亡,CsA则抑制活化T淋巴细胞凋亡.     

黄曲霉毒素B1对人脐静脉内皮细胞毒性作用及机制研究

目的探讨AFB1对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的毒性损伤及作用机制。方法不同浓度AFB1与HUVEC细胞共孵育后,采用CCK-8法检测细胞存活率,测定细胞LDH释放率,采用Annexin V/PI双染、DAPI染色检测细胞死亡机制。结果 AFB1对HUVEC细胞具有显著毒性作用,随着AFB1作用时间和剂量的增加,细胞存活率降低、LDH释放率增高;Annexin V/PI双染检测到细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻;DAPI染色检测到细胞核断裂。结论 AFB1对HUVEC细胞有显著毒性损伤作用,其可能通过凋亡的机制引起细胞死亡。     

膜联蛋白V在子痫前期蜕膜组织中的表达及其意义

目的 探讨膜联蛋白V(Annexin V)在子痫前期蜕膜组织中的表达及意义.方法 采用荧光实时定量PCR、Western blot和免疫组织化学技术分别对正常足月妊娠妇女(对照组)35例、晚发型重度子痫前期33例及早发型重度子痫前期38例的Annexin V mRNA及蛋白进行测定.结果 Annexin V主要表达于蜕膜细胞的胞膜、胞浆及间质.荧光实时定量PCR,Western blot和免疫组化表达等各方法验证结果显示:Annexin V mRNA及蛋白在正常妊娠组蜕膜组织中表达最高;晚发型子痫前期组中次之;早发型子痫前期中最低,正常妊娠组与早发组和晚发组差异有统计学意义(P<0.01),早发组和晚发组差异没有统计学意义(P>0.05).结论 Annexin V在子痫前期蜕膜组织中表达下调,Annexin V 的低表达可能与子痫前期高凝状态形成有关.

Abstract：

Objective To investigate the expression of annexin V in the decidua tissues of preeclampsia patients and explore its clinical significance.Methods Real-time PCR,Western blotting and immunohistochemistry were employed to detect the mRNA and protein expressions of annexin V in the deciduas from 35 normal pregnant women at full term.38 early onset severe preeclampsia patients and 33 late onset severe preeclampsia patients. Results Annexin V was found on the cell membrane and in the cytoplasm of the decidual cells and stroma.Both the mRNA and protein of annexin V expressions in the decidua tissues were significantly different between normal pregnancy group and early or late onset severe preeclampsia group (P<0.05),being the highest in normal pregnancy group and the lowest in early onset severe preeclampsia group.Conclusion The low expression of annexin V in the deciduas might participate in the hypercoagulability state in preeclampsia patients.     

姜黄素对人乳腺癌MCF-7细胞增殖抑制作用及机制研究

目的:探讨姜黄素对人乳腺癌MCF-7细胞增殖抑制、诱导凋亡作用及其分子作用机制。方法:MTT法检测姜黄素对MCF-7细胞的增殖抑制作用;流式细胞术PI单染法检测细胞周期;Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡;RT-PCR法检测凋亡相关基因Bcl-2和Bax的mRNA表达水平。结果:姜黄素对MCF-7细胞生长有明显抑制作用,并呈剂量、时间依赖性;FCM结果显示姜黄素能使MCF-7细胞阻滞在G1/S期;Annexin V/PI双染法验证姜黄素可以诱导细胞凋亡;RT-PCR结果显示Bax mRNA水平明显上调,而Bcl-2的mRNA表达水平降低。结论:姜黄素对人乳腺癌MCF-7细胞增殖具有显著的抑制作用并可诱导细胞凋亡,其作用机制可能与其上调Bax基因表达水平的同时,下调Bcl-2基因表达水平,从而诱导细胞凋亡有关。     

激光共聚焦显微镜观察FITC-Annexin V/PI双染色法检测人肺癌细胞凋亡

目的激光共聚焦显微镜观察FITC-Annexin V／PI双染色法检测人肺癌细胞凋亡的形态。方法对不同剂量含药血清处理的体外培养人肺癌PGLH7细胞株进行Annexin V／PI双染,激光共聚焦显徽镜观察细胞凋亡的形态特征。结果Annexin V／PI双染色法加激光共聚焦显微镜观察,经含药血清作用的人肺癌细胞ee,凋亡早期细胞呈AnnexinV高染而PI低染,细胞膜呈绿色而细胞核不着色;凋亡中、晚期细胞则AnnexinV和PI均为高染,细胞膜呈绿色而细胞核呈红色;部分细胞的核呈碎片状或梅花状,为典型的细胞凋亡形态。结论FITC—AnnexinV／PI双染色法加激光共聚焦显微镜观察凋亡细胞是目前观察凋亡的理想方法,特别适用于凋亡细胞的早期检测。     

生长抑素类似物诱导人胆管癌细胞株凋亡及对胞内游离钙的影响

目的 探讨生长抑素类似物SMS201－995（SMS）是否通过诱导人胆管癌细胞凋亡而抑制肿瘤生长，以及与细胞内游离钙的关系。方法 采用人胆管癌细胞系SK－ChA-1，应用MMT比色法，Annexin V-FITC技术及激光共聚焦显微镜技术等进行检测和观察。结果 在SMS作用下CK－ChA-1细胞生长受抑制。SMS处理SK－ChA-1细胞后，Annexin V标记的凋亡细胞增多。细胞凋亡的同时细胞内游离钙浓度升高。结论 SMS可能通过诱导SK－ChA-1细胞[Ca^2 ]i依赖性细胞凋亡，抑制胆管癌生长。     

人膜联蛋白在胎儿不同组织中的表达

目的 观察HBV感染相关因子——人膜联蛋白（Human Annexin V,HA—V）在胎儿各组织中的表达。方法 用SP免疫组化法检测HA—V在胎儿肝脏、心脏、肾脏、卵巢、输卵管、脾脏、胸腺中的表达及分布。结果 肝脏、肝内胆管系统、心脏、肾脏、卵巢、脾脏、输卵管、胸腺中均有HA—V表达,HA—V分布于这些组织的实质细胞及问质细胞的胞质;免疫组化图像分析系统显示胎儿肝脏组织中HA．V表达显著多于其他组织（P〈0．05）,其余组织之间无明显差别（P〉0．05）。结论 HA—V是人体组织中的一种固有蛋白,分布于多种组织中,这种分布的广泛性可能与HBV泛嗜性感染相关,而肝脏组织中HA—V表达明显多于其他组织可能是HBV主要侵犯肝组织的重要原因之一。     

白藜芦醇诱导肿瘤细胞凋亡和细胞周期阻滞的作用及机制

目的:探讨白藜芦醇(RES)诱导人肝癌HepG2、人慢粒K562肿瘤细胞凋亡和细胞周期阻滞的作用及机制. 方法: 应用形态学方法,Annexin V荧光染色检测HepG2,K562细胞凋亡的发生,应用流式细胞术(FCM)检测细胞周期,应用四唑蓝比色法(MTT)检测HepG2,K562肿瘤细胞对,RES的药物敏感性. 结果: RES对人肝癌HepG2细胞的生长有明显的抑制作用,并诱导肿瘤细胞发生凋亡. 凋亡细胞表现为细胞固缩, 核染色质碎裂. Annexin V荧光染色检测HepG2细胞凋亡率为33.7%,用FCM检测细胞周期明显阻止于G1期,而K562细胞凋亡率为9.97%. MTT检测表明RES对人肝癌HepG2细胞有剂量-效应关系. 但RES对人K562细胞的生长无明显的抑制作用. 结论:RES通过诱导HepG2细胞凋亡抑制肿瘤的生长,并有剂量-效应关系. 同时RES对肿瘤细胞的抑制及诱导凋亡的作用有细胞选择性.     

生长抑素类似物诱导人胆管癌SK-ChA-1细胞调亡及调亡相关基因表达的研究

目的：探讨生长抑素类似物SMS201－995（SMS）抑制人胆管癌生长时对SK－ChA-1细胞凋亡调控基因bcl-2和bax的作用。方法：用DNA凝胶电泳和流式细胞仪检测Annexin V标记凋亡细胞技术研究SMS诱导细胞凋亡的情况;用免疫组化和原位杂交分析SMS凋亡调控基因bcl-2和bax的影响。结果：SMS处理SK－ChA-1细胞后,Annexin V标记的凋亡细胞增多,DNA凝胶电泳显示典型的凋亡和梯状图谱,同时SMS可使细胞bcl-2蛋白表达下降,使bax蛋白和mRNA表达升高。结论：SMS能诱导SK－ChA-1细胞发生凋亡,bax和bcl-2凋亡基因介导了SMS对SK－ChA-1细胞凋亡的发生。     

新型重组纤维蛋白原受体拮抗剂的表达、纯化及活性研究

目的:构建两个预期能够成为纤维蛋白原受体拮抗剂的重组融合蛋白.方法:人工合成北美水蛭素Decorsin的基因序列,利用基因工程的方法构建两个重组蛋白,分别是AnnV-D39:Annexin V加上Decorsin全序列和AnnV-D27:Annexin V加上Decorsin的羧基端27个氨基酸序列.在AnnV-D39的Annexin V和Decorsin序列之间加入了由10个氨基酸组成的连接肽GGGGSGGGGS.利用质粒pET-28(a )作为载体,将上述融合蛋白在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中以包涵体的形式进行高效表达,纯化后,进行抗血小板聚集活性测试.结果:基因表达的产物在变性条件下用DEAE-Cellulose52和SepharoseCL-4B层析纯化.随后进行的血小板聚集分析表明,AnnV-D39具有良好的抗血小板凝集活性,而AnnV-D27没有显示相似活性.结论:AnnV-D39作为一种新的纤维蛋白原受体抑制剂显示了良好的活性,而Annv-D27需要进行进一步的修饰.     

细胞凋亡和继发性坏死的Annexin法定量检测

目的　探讨分析凋亡与坏死淋巴瘤 (Raji)细胞的定量方法。方法　以 1.0 μm ol/ L 地塞米松(DEX)诱导 Raji细胞凋亡 ,用异硫氰酸荧光素标记的连接素 V(Annexin V)和碘化丙锭 (PI)分别与凋亡细胞膜上的磷脂酰丝氨酸和继发性坏死细胞内降解的 DNA结合 ,并以流式细胞术分析和分选标记细胞 ,用电镜和 DNA凝胶电泳对分选细胞及其 DNA进行鉴定。结果　 Annexin+细胞数随 DEX孵育时间的延长而增加 (r=0 .97) ;Annexin+/ PI- 与 Annexin+/ PI+细胞经电镜和 DNA梯形带确证具有凋亡与坏死细胞的特征 ;Annexin法可准确测定 10 5～ 10 6细胞中的标记细胞。结论　 Annexin法可快速、准确地定量混合细胞内的凋亡与坏死细胞数     

塞来昔布对人肺腺癌增殖及凋亡的影响

目的探讨选择性环氧合酶-2抑制剂塞来昔布在人肺腺癌A549细胞株增殖和凋亡中的作用及其机制。方法应用3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）法分析1、5和10μmol·L-1塞来昔布对A549细胞分别处理0、12、24、48和72 h后的增殖能力,分光光度法检测Caspase-3和Caspase-9活性,用免疫荧光法检测凋亡标志分子Annexin V的表达。结果塞来昔布处理组细胞的增殖能力明显低于未处理对照组细胞,差异有统计学意义（P〈0.05）,且抑制作用呈时间和剂量依赖性;处理组癌细胞Caspase-3、Caspase-9和Annexin V的表达水平显著高于未处理对照组（P〈0.05）。结论塞来昔布可抑制人肺腺癌A549细胞的增殖并诱导凋亡,可作为肺癌患者靶向性预防和治疗药物。     

单核细胞趋化蛋白-1诱导人脐静脉内皮细胞的凋亡

目的:研究单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)对人脐静脉内皮细胞(hUVEC)凋亡的影响.方法:培养并鉴定hUVEC;用不同浓度MCP-1(0.1,1.0,10,100μg/L)对其作用24,48h;Annexin V/PI双染细胞,流式细胞仪观察内皮细胞凋亡;琼脂糖凝胶电泳检测细胞染色体"DNA ladder"的形成.结果:MCP-1能诱导hUVEC的凋亡,其效应随浓度和时间的增加而增强(P＜0.01);Annexin V/PI显示凋亡细胞明显增加;细胞DNA呈明显的"DNAladder".结论:MCP-1能诱导hUVEC凋亡.     

灰树花多糖治疗卵巢癌体外实验观察

目的体外实验探讨灰树花多糖治疗卵巢癌的作用。方法以不同浓度灰树花多糖(终浓度为100、250和500μg/ml)处理人SKOV3细胞,台盼蓝染色和MTT检测对细胞增殖的抑制作用,Annexin V/PI双标记流式细胞术检测与荧光显微镜观察检测细胞凋亡。另设阴性对照组,仅用培养液;10μg/ml顺铂(DDP)作为阳性对照。结果台盼蓝排染和MTT检测证实,灰树花多糖明显抑制SKOV3细胞增殖;Annexin V/PI双染流式细胞术检测显示,灰树花多糖100、250、500μg/ml作用细胞24、48、72 h均能诱导细胞凋亡,凋亡率与时间、剂量存在依赖关系;Annexin V/PI双染荧光显微镜观察检查细胞凋亡率显示了与流式细胞术检测类似结果。结论灰树花多糖显著抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖并诱导细胞凋亡。     

人重组钙依赖性磷脂结合蛋白Ⅴ在大肠杆菌中的高效表达、纯化及细胞凋亡检测

目的：为细胞凋亡研究提供快速可靠的实验方法。方法：利用RT-PCR技术从人外周血单核细胞系U937 cDNA文库中扩增出编码钙依赖性磷脂结合蛋白Ⅴ（Annexin Ⅴ) cDNA,并克隆到大肠杆菌表达载体中,在大肠杆菌中表达含凝血酶识别序列的MS2 Annexin Ⅴ融合蛋白。表达产物经凝血酶消化,可除去MS2细菌蛋白,再经离子交换层析纯化,可得成熟的Annexin Ⅴ纯品,FITC标记后的Annexin Ⅴ可用于细胞凋亡的检测。结果：在大肠杆菌表达的人重组Annexin Ⅴ占菌体蛋白的56 %,经纯化获得99 %纯度的非融合型Annexin Ⅴ, FITC标记的Annexin Ⅴ能有效地检测凋亡细胞。结论：成功地建立了批量获取Annexin Ⅴ的技术路线,为推广高效检测凋亡技术提供了基础。