结核分枝杆菌85B基因原核表达及间接ELISA方法的建立

目的原核表达结核分枝杆菌85B融合蛋白,建立该抗原对结核病患者诊断的ELISA方法。方法制备结核分枝杆菌基因组DNA,从结核分枝杆菌H37Rv基因组中进行PCR扩增85B基因并构建至表达载体p GEX4T-1上。原核表达GST-85B融合蛋白,并通过包涵体对其进行变性和透析复性后,进行GST亲和层析纯化得到可溶性的目的蛋白。用聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹分析重组蛋白,ELISA检测表达融合蛋白的抗原性。结果扩增出了结核分枝杆菌85B基因,构建了具有正确基因序列的质粒载体p GEX4T-85B,转化大肠杆菌BL21后经诱导产生了高水平的表达产物。超声裂菌法分离的结果显示,目的蛋白在菌体沉淀中以包涵体形式居多。将包涵体变性、复性后用GST亲和层析纯化,蛋白纯化后可被结核病患者血清特异性识别。结论构建了质粒载体,并诱导表达了GST-85B融合蛋白,为进一步研究结核菌的免疫机制奠定了基础。     

结核分枝杆菌rPstS1-HspX融合蛋白的制备及其血清学诊断价值

目的表达、纯化结核分枝杆菌rPstS1-HspX（rPH）融合蛋白,评价其在结核病血清学诊断方面的价值。方法异丙基．陆D一硫代吡喃半乳糖苷（帆）诱导rPH融合蛋白表达,并用镍离子螯合亲和层析柱纯化融合蛋白。Western印迹分析纯化后融合蛋白的免疫反应性。最后用ELISA法检测194份血清抗体样本,其中来源于肺结核患者94份,非结核肺部疾病患者52份,健康对照者48份。结果rPH融合蛋白在大肠埃希菌中主要以可溶性非包涵体形式表达,相对分子质量为51000。经亲和层析后得到了浓度为0．62ng／mL,纯度达92％的融合蛋白。Western印迹实验证实纯化后融合蛋白能与结核病阳性血清发生特异性免疫应答。重组蛋白rPH血清检测的灵敏度为77．6％（73／94）,特异性为92．0％（92／100）。结论成功表达和纯化了rPH融合蛋白,其用于结核病血清学诊断具有较好的灵敏度和较高的特异性,是ELISA的可靠抗原。     

结核分枝杆菌rESAT-6-CFP-10融合蛋白的制备及其血清学诊断价值

目的 表达、纯化结核分枝杆菌rESAT-6-CFP-10(rEC)融合蛋白,评价其在结核病血清学诊断方面的应用价值.方法 用镍离子螯合亲和层析柱纯化融合蛋白,用ELISA法检测血清样本中的抗结核抗体,以37例PPD阴性患者正常血清A492+2s为正常限值,评价rEC诊断的特异性及灵敏度.结果 rEC融合蛋白在大肠埃希菌中以可溶性非包涵体形式表达,表达浓度为0.19 mg/mL.rFC检测抗结核抗体在PPD阳性健康人群中的特异性为100%(30/30),在痰涂片或细菌培养阳性和两法均阴性的结核病患者中灵敏度分别为75.56%(34/45)和67.3]%(35/52).结论 结核分枝杆菌rEC融合蛋白以可溶性形式高效表达,具有较强的免疫反应性和较高的血清学诊断价值.     

结核分枝杆菌Rv3914抗原的克隆表达与纯化

目的构建结核分枝杆菌Rv3914蛋白的重组质粒,并在大肠埃希菌中表达及纯化,为结核病血清学诊断提供候选抗原。方法用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增Rv3914基因片段,插入到pET-28b(+)载体中,构建pET28b-Rv3914重组质粒,转化大肠埃希菌E.coli BL21plysS(DE3),经IPTG诱导表达后,应用Ni-NTA亲和柱纯化重组蛋白。结果 PCR扩增出Rv3914基因序列,重组质粒经测序并经BLAST分析后发现无点突变。pET28b-Rv3914重组质粒在大肠埃希菌E.coli BL21plysS(DE3)中主要以可溶性形式表达,重组蛋白占细胞蛋白总表达量的30%以上,经Ni-NTA柱纯化后,得到纯度超过90%、相对分子质量约为14.7×103的目的蛋白质。结论高纯度结核分枝杆菌Rv3914重组蛋白的获得为研究结核互补特异性抗原组合在结核病血清诊断中的价值奠定了基础。     

结核分枝杆菌分泌蛋白MPT 64的克隆、表达、纯化和复性

目的构建结核分枝杆菌分泌蛋白MPT 64的重组质粒,并在大肠杆菌中表达及纯化和复性重组蛋白。方法用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出mpt 64基因片段,插入PKRX-T载体中,再亚克降到表达载体PET30a中,在大肠杆菌中表达;应用组氨酸标签(His-Tag)纯化重组蛋白;在PBS中通过半透膜恢复重组蛋白的天然结构。结果构建了含MPT 64重组质粒的大肠杆菌工程菌,并以包涵体形式表达重组蛋白MPT 64,其占细胞总蛋白的20%~30%;重组蛋白变性后经镍柱纯化,其纯度达90%以上;通过半透膜完全恢复重组蛋白的天然结构。结论具有天然结构和高纯度的重组融合蛋白有可能成为有效的结核病血清学诊断的候选抗原。     

结核分枝杆菌分泌蛋白NPT64的克隆、表达、纯化和复性

目的 构建结核分枝杆菌分泌蛋白MPT 64的重组质粒,并在大肠杆菌中表达及纯化和复性重组蛋白.方法 用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出mpt64基因片段,插入PKRX-T载体中,再亚克降到表达载体PET30a中,在大肠杆菌中表达;应用组氨酸标签（His-Tag）纯化重组蛋白;在PBS中通过半透膜恢复重组蛋白的天然结构.结果 构建了含MPT64重组质粒的大肠杆菌工程菌,并以包涵体形式表达重组蛋白MPT 64,其占细胞总蛋白的20%～30%;重组蛋白变性后经镍柱纯化,其纯度达90%以上;通过半透膜完全恢复重组蛋白的天然结构.结论 具有天然结构和高纯度的重组融合蛋白有可能成为有效的结核病血清学诊断的候选抗原.     

重组结核分枝杆菌PPE17蛋白原核可溶性表达纯化和血清学诊断研究

目的利用原核系统可溶性表达结核分枝杆菌PPE17蛋白并进行纯化,研究其免疫学特性,并评价该重组蛋白在结核病血清学诊断方面的价值。方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中利用PCR扩增PPE17核酸序列然后克隆至融合表达载体pET-DsbC中,转入大肠埃希菌BL21(DE3)进行诱导、表达和纯化,用Western Blot和EL ISA方法进行抗原性初步评价。结果融合蛋白Ds-bC-PPE17在原核系统内经IPTG诱导表达后,主要以可溶性形式表达存在,经镍柱层析获得了纯的重组蛋白,纯度达95%以上。Western Blot和EL ISA方法结果证明重组DsbC-PPE17蛋白具有较强的抗原活性。用纯化的PPE17蛋白做抗原,临床诊断结核病人血清,阳性率达60%。结论融合蛋白DsbC-PPE17在大肠埃希菌中以可溶性表达形式存在,高纯度的重组融合蛋白有可能成为结核病的血清学诊断抗原。     

亚洲带绦虫包虫诊断抗原P-29基因克隆表达

目的 识别亚洲带绦虫包虫诊断抗原P-29(Hydatid disease diagnostic antigen P-29)的已知序列并行克隆和蛋白表达及免疫学研究.方法 利用在线生物信息学工具序列分析后以亚洲带绦虫成虫包虫诊断抗原P-29基因克隆到原核表达质粒pET-28a(+)中,在大肠埃希菌BL21/DE3中诱导表达,重组后的蛋白用His-镍蛋白纯化柱纯化,纯化的重组蛋白用蛋白印迹进行免疫学分析.结果 重组体构建成功并以包涵体形式存在,破包涵体纯化蛋白并得到高纯度的蛋白,且该重组蛋白可被亚洲带绦虫及牛带绦虫病人血清识别,表明其具有免疫反应性.结论 亚洲带绦虫成虫包虫诊断抗原P-29可在原核表达系统中获得具有免疫活性的高效表达.     

恙虫病东方体蛋白基因的原核表达及活性鉴定

目的 对恙虫病东方体Gilliam株56kDa外膜蛋白基因进行原核表达，并对表达产物进行纯化，以获得有生物活性的重组蛋白，用于恙虫病诊断试剂的研制。方法 根据GiUiam株东方体56kDa蛋白基因序列设计特定引物。用PCR法扩增出编码56kDa抗原长约1320bp的DNA，克隆至原核载体PET28a，构建了表达载体PET-OTG，并获表达。表达产物经镍(Ni2 )柱亲和层析纯化，聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及蛋白印迹(Western—blot)分析鉴定。并用间接ELISA进行抗原性分析。结果SDS—PAGE检测表明重组蛋白分别以可溶性蛋白和包涵体两种方式表达，在相对分子质量约52kDa处有表达目的条带。经 Ni^2 层析柱纯化得到目的蛋白，包涵体蛋白纯化后纯度大于可溶性蛋白，达电泳纯。Western-blot证实该蛋白能被患者阳性血清所识别，用阴性血清则未出现相应印迹。间接ELISA结果表明重组蛋白具有良好的抗原性，能有效区分恙虫病阳性和阴性血清。结论 重组蛋白具有免疫反应活性。有望作为诊断抗原用于恙虫病的诊断。     

结核分枝杆菌毒力基因片段Rv0450c分子克隆及原核表达

目的通过分子克隆的方法对结核分枝杆菌H37Rv中编码MMPL4蛋白的Rv0450c基因以及编码该蛋白一个161氨基酸的膜内区域(I161)和一个371氨基酸的膜外区域(O371)的基因片段在大肠杆菌中的表达和纯化方法进行研究,为进一步探讨MMPL4与结核分枝杆菌耐药相关功能性研究以及抗体制备提供依据。方法以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增Rv0450c基因片段,并克隆到原核表达载体pET28b质粒中,获得的重组质粒转化原核表达宿主大肠杆菌BL2 1(DE3)pLysS中,经IPTG诱导后SDS-PAGE电泳方法检测重组蛋白的表达,并进行纯化。结果从结核分枝杆菌基因组H37RvDNA中成功扩增出Rv0450c基因及编码I161/O371的DNA片段,并构建原核表达质粒pET28b-Rv0450c,pET28b-I161和pET28b-O371重组MMPL4蛋白和I161在大肠杆菌中表达不明显,而膜外区域O371以包涵体形式高表达。结论 Rv0450c基因原核表达质粒可以成功构建并在大肠杆菌内较好表达,为进一步MMPL4功能研究和抗体制备打下良好基础。     

结核杆菌重组Rv3425蛋白的结核病血清学诊断价值的评价

[目的]评价结核分支杆菌重组Rv3425蛋白在结核病血清学诊断中的价值。[方法]以重组Rv3425作为抗原，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测151份确诊结核病人、143份健康人、38份卡介苗接种阳转者和42份非结核病人血清中的抗结核抗体水平，并与结核菌素纯蛋白衍生物（PPD）、Ag85B蛋白及TB—DOT、TB-CHECK-1试剂盒的检测结果进行比较，以此来评价重组Rv3425蛋白在结核病诊断上的价值。[结果]Rv3425与PPD和Ag85B抗原一样能够诊断结核病人，但PPD不能有效区分结核病人和BCG接种者，Rv3425和Ag85B蛋白可以明确区分。[结论]虽然重组Rv3425蛋白对结核病的阳性率尚不能与试剂盒媲美，但由于其能够有效区分结核病人和BCG阳转者，在结核病诊断方面具有很大的应用价值，可以作为结核病诊断的备选抗原之一。     

梅毒密螺旋体Tp47重组蛋白的表达及其应用

目的：在大肠埃希菌中表达梅毒密螺旋体（treponema pallidum,Tp）Tp47重组蛋白，用其建立诊断梅毒的酶联免疫法（enzyme immunoassay,EIA）。方法：应用聚合酶链反应法（PCR）从Tp全基因组中扩增目的片段Tp47，并将其克隆到表达载体pET-30a中，构建重组质粒pET-30a-Tp47。在大肠埃希菌中表达重组蛋白Tp47，亲和层析柱纯化，建立EIA法，检测血清中抗－Tp抗体。结果：获得了Tp47基因重组蛋白的高效表达，该重组蛋白存在于细菌上清中，占全菌体蛋白12％左右，分子量约39kDa。蛋白印迹法（western blot,WB）显示，Tp47重组蛋白具有良好的抗原性。用Tp47重组蛋白建立EIA法，检测11份梅毒血凝试验阳性和28份阴性血清，灵敏度为100％（11／11），特异性为96．4％（27／28）。结论：Tp47重组蛋白EIA可用于梅毒的诊断。     

风疹病毒E1蛋白与DsbA蛋白原核融合表达及应用

目的 利用DsbA蛋白分子伴侣性质,原核系统内可溶性表达风疹病毒E1蛋白并进行纯化,用于检测风疹病毒特异性抗体IgM. 方法 将PCR扩增的风疹病毒E1核酸序列克隆至融合表达载体pET-DsbA中,依次进行表达和亲和纯化,利用产物建立IgM捕获ELISA方法鉴定DsbA-E1融合蛋白的抗原性及实用性. 结果 表达纯化的E1蛋白经酶标记建立IgM捕获ELISA方法,检测60份抗风疹病毒IgM阳性血清和60份健康人血清,其中阳性血清检出例数为45例,检出率为75％;健康人血清检出1例,检出率为1.7％,特异度为98％;用酶标记E1蛋白建立的捕获ELISA法阳性检出率98.3％ (59/60),阴性检出率100％,初步表明E1蛋白抗原表位有较好的抗原特异性. 结论 融合蛋白DsbA-E1在大肠杆菌中以可溶性表达形式存在,该重组蛋白抗原性强,利用其建立的IgM捕获ELISA方法,可用于检测风疹病毒抗体.     

戊型肝炎病毒IgG抗体诊断试剂盒的研制及初步应用

目的 应用大肠杆菌表达的戊型肝炎病毒(HEV)重组抗原建立HEV IgG抗体诊断(ELISA)试剂盒.方法 应用大肠杆菌表达的具有戊型肝炎主要抗原表位的表达蛋白HEV ORF23作为包被抗原,建立检测血清中抗HEV IgG的间接ELISA试剂盒.通过HEV IgG试剂盒对100份戊型肝炎患者血清和150份正常人阴性血清测定结果进行比较,评价本试剂盒的特异性、敏感性及稳定性.另选临床500份肝炎患者血清进行检测,评价本试剂盒的临床应用价值.结果 建立的抗HEV IgG间接ELISA试剂盒特异性、敏感性均为100%,重复性较好,在4℃至少可稳定存放6个月,与同类试剂的符合率为95%以上.500份血清样本中,戊型肝炎患者150例,检出HEV145份,阳性符合率为96.67%.结论 应用大肠杆菌表达的HEV重组抗原建立的检测试剂盒对血清抗HEV IgG的检测具有良好的特异性和敏感性,在戊型肝炎的临床诊断和流行病学调查中具有潜在的应用价值.     

结核分枝杆菌7种表位抗原联合检测技术在聚集性疫情处理中的应用

目的:探讨分析在大规模结核疫情筛查中,结核分枝杆菌7种表位抗原联合检测技术的应用价值。方法:使用结核分枝杆菌抗体IgG诊断试剂盒对61份标本进行检测。对12例结核病患者1、9例密切接触者和30例可能有接触者同时进行结核菌素纯蛋白衍生物(PPD)试验、痰抗酸杆菌涂片和培养。结果:结核分枝杆菌抗体(IgG)诊断试剂盒对确认的12例肺结核患者的检测敏感度100%(12/12),健康组30例检测特异性为100%(30/30),19例密切接触者1例抗体阳性。结论:结核分枝杆菌抗体IgG诊断试剂盒具有较好的敏感度和特异度,是大规模筛查和辅助诊断结核病的有效手段。     

用基因重组蛋白rTPA16与rTPA38检测结核病人血清IgG抗体

[目的]探讨结核分支杆菌重组rTPA38和rTPA16在结核病免疫学诊断中的应用价值。[方法]以rTPA16、rTPA38重组蛋白为抗原，用酶联免疫吸附试验（ELISA），检测结核病人、其他肺部疾病患者、卡介苗接种后结核菌索试验阳转者血清中的抗体，并与结核病菌素试验结果比较。[结果]rTPA16、rTPA38蛋白与结核菌素试验阳性率，82例结核病人血清分别为56．1％、68．3％、78．0％，61例非结核病病人血清分别为9．8％、6．6％、18．0％；与结核菌素试验比较，用rTPA16、rTPA38蛋白检测的特异性分别为84．78％、89．29％。[结论]重组蛋白用于检测结核抗体具有较好的特异性，对结核病的血清学诊断有较高参考价值。     

结核分枝杆菌CFP10 ESAT6重组融合蛋白抗原血清学诊断价值

目的研究重组CFP10 ESAT6蛋白的抗原性,评价其在结核病血清学诊断中的价值,探寻更有效的结核病诊断试剂。方法应用基因工程技术表达、纯化rCFP10 ESAT6蛋白,通过酶联免疫吸附试验检测192例健康者和210例结核病患者血清与纯化rCFP10 ESAT6的抗体反应。结果 rCFP10 ESAT6蛋白在大肠埃希菌细胞内以包涵体形式高效表达,表达量约占菌体总蛋白的25％,分子量约为28 kD,具有良好的抗原特异性。在210例结核病患者血清中,103例菌阳患者和107例菌阴患者抗rCFP10 ESAT6抗体的阳性率分别为30.10％(31/103)和28.97％(31/107),总的灵敏度为29.52%(62/210);在192例健康者血清中,95例PPD阴性者和97例PPD阳性者抗rCFP10 ESAT6抗体的阳性率分别为2.11%(2/95)和6.19%(6/97),总的特异性为95.83%(184/192)。结论rCFP10 ESAT6蛋白可能成为结核病血清学诊断的组合抗原之一。     

酶联免疫吸附试验检测血清结核抗体及临床意义

目的:探讨血清抗结核分支杆菌抗体检测在肺结核诊断中的临床意义,评价临床诊断试验的相关指标。方法:采用高纯度结核分支杆菌纯蛋白衍生物作包被抗原,应用ELISA检测临床诊断肺结核患者116例(其中分菌阳组、菌阴组、治疗后复检组)和112例非结核病患者,健康体检者的血清结核抗体水平;计算诊断试验的相关指标。结果:该检测方法临床诊断肺结核的敏感性为61.20%特异性为95.53%,准确性为78.07%,诊断指数为156.73%,阳性预期值为93.42%,阴性预期值为70.39%;各实验组与实验对照组间率的比较,均P相似文献   

结核分枝杆菌融合蛋白ELISA方法检测

目的探讨融合蛋白ESAT6-38kDa-16kDa对结核病的血清学诊断价值,并与脂阿拉伯甘露糖抗原(LAM)及结核蛋白芯片方法的检测结果进行比较,评价其应用价值。方法表达、纯化重组目的蛋白,分别以此蛋白和LAM为抗原包板,以酶标抗体为二抗,采用ELISA间接法检测肺结核患者血清、肺外结核患者血清及正常人血清,比较敏感性、特异性等,评价其对结核病的诊断价值。结果融合蛋白ESAT6-38kDa-16kDa、LAM、血清及酶标抗体的最佳工作稀释度分别为1、0.5μg/mL,1∶100、1∶4 000;分别用ESAT6-38kDa-16kDa和LAM检测761份结核病人血清,敏感性分别为76.9%、77.4%,特异性为89.2%、89.5%,差异均无统计学意义;ELISA法检测68份肺结核病血清标本融合蛋白,阳性检出率和阴性符合率与芯片检测结果有极高一致性。结论融合蛋白ESAT6-38kDa-16kDa作为抗原对结核病血清学诊断具有一定应用价值。