结核杆菌RV1737多肽免疫特性和诊断价值研究

研究结核杆菌RV1737多肽免疫特性及在结核病中诊断鉴别能力,多肽抗原模拟干扰素γ(IFN-γ)释放实验(IGRA),刺激后潜伏结核感染(LTBI)组IFN-γ高于结核(TB)组(P＜0.05),A+B+C联合组的灵敏度高于多肽A、B、C与融合D(P＜0.05).同时多肽建立间接ELISA法检测血清结核IgG抗体,TB组有更好的反应性,多肽A的IgG抗体吸光度高于多肽B、C(P＜0.05),组间绘制ROC,多肽A面积最大,联合A+B+C多肽,曲线面积升高且与单独面积比较差异有统计学意义(P＜0.05).RV1737多肽有成为潜伏结核诊断候选抗原潜力.多肽抗原建立ELISA检测外周血结核IgG抗体可能成为血清学实验结核病筛选新抗原且多肽A效果较突出.     

高分辨率熔解曲线技术用于结核分枝杆菌临床分离株异烟肼耐药性的快速检测

目的评价高分辨率熔解曲线分析技术(high-resolution melting curve,HRM)检测结核分枝杆菌异烟肼耐药性的应用价值。方法 1)通过传统比例法药敏实验对本实验室保存的49株结核分枝杆菌进行异烟肼耐药性分析。2)进一步对该结核分枝杆菌进行异烟肼耐药相关基因KatG基因和inhA基因进行异烟肼耐药决定区测序分析,筛查突变位点。3)根据筛查到的突变位点设计高分辨率熔解曲线分析所用的特异性引物,对异烟肼耐药基因耐药决定区进行高分辨率熔解曲线分析检测DNA突变,评估用高分辨率熔解曲线分析技术对结核分枝杆菌异烟肼耐药性检测的效率。结果 1)比例法药敏结果显示,49株实验菌株中20株为异烟肼耐药株,29株为异烟肼敏感株。2)测序分析结果显示:(1)KatG基因出现了4种突变形式,分别是234单位点突变;234、315双位点突变;234、463双位点突变;234、315、463三位点联合突变。(2)inhA基因检测到3种突变,即-8位、-15位、-152位。3)(1)对耐药株的基因突变进行分析发现:20株异烟肼耐药株中11株存在KatG基因第315位密码子的突变、占异烟肼耐药株的55%;6株存在inhA基因-15(4株)位碱基、-8(1株)位碱基、-152(1株)位碱基的突变,共占异烟肼耐药株的30%;2株同时存在基因KatG315密码子和inhA-15位碱基的突变,占异烟肼耐药株的10%;1株均未检测到KatG基因和inhA基因的突变,占异烟肼耐药株的5%。通过基因突变检测结核分枝杆菌异烟肼耐药性的敏感性为95%、特异性为100%。(2)用高分辨率溶解曲线检测实验菌株耐药基因突变的结果显示,18株存在基因突变,24株不存在基因突变,检测的灵敏度为94.7%、特异性为80%。(3)以高分辨率熔解曲线检测到突变为耐药的判断标准,检出19株为耐药株,24株为敏感株。以比例法药敏结果为参照,检测的灵敏度为95%、特异性为82.76%。结论高分辨率溶解曲线用于结核分枝杆菌对异烟肼耐药性的检测具有较好的灵敏度,耗时短,在异烟肼耐药结核病的快速诊断方面具有一定的应用价值。     

结核分枝杆菌Ag85蛋白复合物的原核表达及其在血清学诊断中的应用研究

目的构建结核分枝杆菌Ag85复合物原核表达载体并表达和纯化重组蛋白,评价该家族蛋白在结核病血清学诊断中的应用价值。方法以标准株H37Rv基因组为PCR模板扩增fbpA、fbpB及fbpC基因并克隆至原核表达载体,转化至C43(DE3)菌株后经诱导、表达、纯化获得重组蛋白Ag85A、Ag85B、Ag85C。分别以纯化蛋白包被酶标板,采用方阵滴定确定Ag85A、Ag85B、Ag85C蛋白间接ELISA的最佳条件,用优化的ELISA检测367份健康对照组血清及86份痰涂阳性结核病患者血清中的特异IgM、IgG抗体。结果成功构建Ag85复合物基因的重组质粒,经诱导表达获得Ag85A、Ag85B、Ag85C重组蛋白。分别以纯化的Ag85A、Ag85B、Ag85C为包被抗原,采用ELISA检测结核病人血清IgG抗体,灵敏度分别为65.1%、69.8%和41.8%,特异性分别为75.1%、78.1%和64.2%;以Ag85B+Ag85A或Ag85CIgG抗体阳性为判断标准,检测血清结核分枝杆菌IgG抗体的灵敏度为60.4%,特异性为86.1%。结论以Ag85B+Ag85A或Ag85C血清IgG抗体阳性为判断标准,检测血清结核分枝杆菌IgG抗体具有较好的灵敏度与特异性,可作为结核病血清学诊断方法。     

绵羊附睾种布鲁氏菌019株外膜蛋白基因序列比较研究

目的证实新疆分离绵羊附睾种布鲁氏菌019株与参考菌株的差异性。方法采用PCR扩增绵羊附睾种布鲁氏菌019株外膜蛋白的Omp31、Omp25、Omp22、Omp2a、Omp2b基因,并进行序列比较分析。结果绵羊附睾种布鲁氏菌019株的5种外膜蛋白基因序列与绵羊种布鲁氏菌参考株在核苷酸水平和氨基酸水平上均存在差异。结论绵羊附睾种布鲁氏菌019株是独特的新疆地方株。     

新疆喀什地区结核分枝杆菌分离株氧氟沙星耐药基因gyrA突变位点分析

目的了解新疆喀什地区、石河子地区及华东地区结核分枝杆菌临床分离株对氧氟沙星的耐药性,分析耐药相关基因gyrA喹诺酮耐药决定区(QRDR)突变的位置及类型,以比例法药敏试验为参照,评价DNA测序技术检测氧氟沙星耐药的效率。方法采用比例法药敏试验检测191株结核分枝杆菌临床分离株对氧氟沙星药物的耐药性;对喹诺酮类药物耐药相关基因gyrA的QRDR区进行扩增与测序,分析耐药相关突变位点。以药敏试验结果为标准,通过Kappa值评价DNA测序和药敏试验在结核分枝杆菌临床分离株氧氟沙星耐药检测的一致性。结果 191株临床分离株结核分枝杆菌中16株为氧氟沙星耐药株,氧氟沙星总耐药率为8.37%。对gyrA基因QRDR区域扩增后测序,共发现4个位点存在突变;分别是第56、74、90、94位密码子。其中,第56位密码子处由CTC→CTG,为同义突变。74位密码子突变均发生在喀什分离株,由GCC→GTA,氨基酸由Ala突变为Val;90位密码子由GCG→GTG,氨基酸由Ala突变为Val;94位密码子突变占临床分离株耐药位点突变的71%,共发现GAC→TAC、GAC→GCC、GAC→GGC3种突变类型,第94位氨基酸Asp分别突变为Thr、Ala、Gly。与药敏试验结果比较,DNA测序对结核分枝杆菌临床分离株氧氟沙星耐药检测具有高度一致性(Kappa=0.895)。结论 gyrA基因第74、90、94位密码子的突变与结核分枝杆菌对氧氟沙星药耐药有关,喀什分离株存在74位新突变位点。用DNA测序技术分析结核分枝杆菌gyrA基因氧氟沙星耐药相关突变对判断结核分枝杆菌氧氟沙星类药物耐药性具有较高的灵敏度和特异性,可为结核分枝杆菌氟沙星耐药性诊断提供依据。     

实时定量PCR检测siRNA对小鼠巨噬细胞中FTH1基因表达的抑制作用

目的通过实时定量PCR(real-ti me PCR)检测基因表达的mRNA,建立一种直接观察小干扰RNA(si RNA)抑制目的基因表达的方法。方法化学设计合成对应于FTH1(ferritin heavy chain1,FTH1)基因表达mRNA的si RNA,经TurboFectTMin vitro Transfection Reagent转染小鼠RAW264.7巨噬细胞,48h后,提取总RNA,逆转录为cDNA。以3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)为内参,定量检测FTH1的表达,比较干扰前后FTH1基因mRNA的量。结果 3种si RNA处理的小鼠巨噬细胞中FTH1基因的表达抑制率最高为97.60%。结论实时定量PCR方法的建立为研究布鲁氏菌在侵染巨噬细胞过程中FTH1的功能提供了有效途径。     

布鲁氏菌外膜蛋白VirB4在感染胚胎滋养层细胞中的作用分析

目的：筛选布鲁氏菌侵染牛胚胎滋养层细胞过程中与Ⅳ型分泌系统VirB4蛋白结合的潜在靶蛋白。方法设计引物并PCR扩增布鲁氏菌的virB4基因,构建表达载体pGBKT7-VirB4,酶切鉴定,测序分析正确后,转化酿酒酵母菌感受态细胞Y187,进行自激活和毒性检测;建立布鲁氏菌侵染牛胚胎滋养层细胞模型,构建布鲁氏菌侵染牛胚胎滋养层细胞cDNA文库;采用酵母双杂交技术筛选与VirB4相互作用的滋养层细胞蛋白,实时定量PCR检测靶蛋白表达量的变化。结果成功构建了pGBKT7-virB4诱饵质粒,转入Y187后无毒性,不能自激活;获得了布鲁氏菌侵染牛胚胎滋养层细胞cDNA文库;筛选到了13个阳性质粒,其中蛋白辅酶Q10和SLC3A2在布鲁氏菌侵染后mRNA表达量均增加。结论本试验对VirB4蛋白与宿主细胞的互作研究为进一步阐明布鲁氏菌感染宿主细胞的发病机制奠定了基础。     

布鲁氏菌抗体胶体金免疫层析法快速检测技术的建立

目的建立一种快速检测布鲁氏菌抗体的新方法。方法利用胶体金免疫层析技术,以大肠埃希菌表达、纯化的OMP31与BP26重组蛋白作为检测抗原,以金黄葡萄球菌A蛋白(SPA)作为胶体金标记物,制备胶体金免疫层析试纸条,用于检测布鲁氏菌抗体,并分析方法的敏感性和特异性。结果以粒径为40nm胶体金制备的试纸条检测布鲁氏菌抗体的敏感性最高,胶体金最佳标记pH为6.2,SPA蛋白最适标记量为6μg/ml。交叉试验证明试纸条不与其他非相关疾病感染血清反应,特异性高。试纸条检测结果与琥红平板试验方法的符合率为92%。结论制备的布鲁氏菌抗体胶体金免疫层析试纸条具有敏感、特异、简便、快速的特点,可用于鉴别布鲁氏菌自然感染和人工免疫,并可区分牛、羊种布鲁氏菌感染,可在基层推广使用。     

布鲁氏菌强毒株16M和疫苗株M5-90诱导巨噬细胞凋亡线粒体途径相关因子的表达比较

目的比较布鲁氏菌强毒株16M和疫苗株M5-90侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7后其凋亡相关因子的转录和表达。方法建立16M、M5-90侵染RAW264.7模型,采用CFU计数法比较16M、M5-90侵染RAW264.7 4、8、12、24h后的胞内生存情况;采用qRT-PCR检测AIF、Bcl-2、Bax、Apaf-1、Bcl-xl基因转录水平的变化;采用ELISA检测TNF-α和Cyt C在细胞内的表达;采用激光共聚焦检测Cyt C在细胞内共定位表达情况。结果布鲁氏菌16M在侵染后4h~24h胞内CFU呈增多趋势,而M5-90CFU先增多后减少。qRT-PCR显示AIF基因的转录水平在侵染后4h~24h内呈上升趋势,且M5-90侵染组与16M侵染组比较差异无统计学意义(P0.05);由M5-90侵染诱导的Apaf-1基因转录水平与16M侵染组比较有统计学意义(P0.05);Bcl-xl的转录量随着侵染时间增长而不断增加,且16M诱导组与M5-90组比较差异无统计学意义(P0.05);M5-90侵染组Bax和Bcl-2水平与16M组比较差异均有统计学意义(P均0.05);M5-90侵染组Bax/Bcl-2比值与16M侵染组比较差异无统计学意义(P0.05)。ELISA分析显示TNF-α、Cyt C分泌量随着时间增长而增加,且M5-90诱导组与16M组比较差异无统计学意义(P均0.05)。激光共聚焦显示Cyt C定位在RAW264.7内,属于胞浆表达,且M5-90诱导的表达量与16M组比较差异无统计学意义(P0.05),并随感染时间的延长不断增加。结论布鲁氏菌疫苗株M5-90侵染RAW264.7 4h~24h内,凋亡相关因子Cyt C、AIF、Bax/Bcl-2、Apaf-1的表达量高于强毒株16M侵染组,而Bcl-xl则相反,表明在此侵染阶段M5-90具有更强的促细胞凋亡作用。     

绵羊种布鲁氏菌019株侵染绵羊巨噬细胞cDNA文库的构建

目的 构建绵羊种布鲁氏菌019株侵染绵羊肺泡巨噬细胞的cDNA文库。培养绵羊肺泡巨噬细胞,用绵羊种布鲁氏菌019株侵染绵羊巨噬细胞,用试剂盒构建侵染后绵羊肺泡巨噬细胞的cDNA文库,并对文库中的部分克隆进行测序。结果 表明,构建的绵羊种布鲁氏菌019株侵染绵羊巨噬细胞cDNA文库达到建库要求;所测序列与牛的基因组编码序列同源性最高。在绵羊种布鲁氏菌019株侵染绵羊肺泡巨噬细胞过程中,以50∶1（细菌∶细胞）的个数比,侵染3.5h,能有效构建侵染后绵羊肺泡巨噬细胞的cDNA文库。