肝癌细胞PI3K/Akt信号通路在干扰素2α上调ISG15表达中的作用

目的 探讨肝癌细胞中干扰素2o(IFN-2α)通过磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路上调ISG15表达的机制.方法 向培养的肝癌细胞HepG2细胞系中加入IFN-2α和/或PI3K抑制剂(LY294002).采用蛋白免疫印迹检测各组Akt、磷酸化-蛋白激酶B(p-Akt)和干扰素刺激基因15(...     

抑制PI3K/Akt信号通路对胃癌细胞转移和侵袭影响的研究

目的:探讨PI3K/Akt信号通路对胃癌细胞转移和侵袭的影响.方法:选用PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002体外作用于胃癌细胞株SGC-7901,Western blot检查总Akt和p-Aktser473蛋白表达,细胞粘附实验观察细胞与基质的粘附力,Transwell法检查细胞侵袭能力,RT-PCR及免疫细...     

抵抗素通过磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信号通路诱导H9c2心肌细胞肥大机制研究

目的探讨抵抗素激活磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路诱导H9c2心肌细胞肥大的分子机制。方法取生长状态良好的H9c2心肌细胞,使用含1 g·L~(-1)胎牛血清的高糖达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)处理24 h使其细胞同步化后进行不同干预。随机将H9c2心肌细胞分为Con组、R50组、LY294002+R50组和LY294002组,Con组为空白对照;R50组细胞应用50μg·L~(-1)抵抗素处理48 h组;LY294002+R50组细胞预先应用PI3K/Akt通路抑制剂LY294002干预2 h后再用50μg·L~(-1)抵抗素处理46 h;LY294002组细胞应用PI3K/Akt通路抑制剂LY294002处理2 h组。4组心肌细胞加含药物DMEM培养48 h后进行细胞面积、单细胞蛋白质合成量测定,Western blot检测心肌细胞α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、原癌基因c-myc蛋白及PI3K/Akt非磷酸化及磷酸化水平表达。观察抵抗素(50μg·L~(-1))处理细胞不同时间(0、1、2、3 h)后运用Western blot测定磷酸化(p-Akt)的蛋白表达水平,检测抵抗素处理1 h后4组心肌细胞PI3K/Akt信号通路磷酸化表达水平。结果抵抗素处理H9c2心肌细胞0、1、2、3 h组p-Akt蛋白表达水平分别为0.60±0.26、0.71±0.67、0.52±0.32、0.51±0.32;与0 h组比较,抵抗素处理H9c2心肌细胞1 h组p-Akt蛋白表达水平显著增高(P<0.01);与1 h组比较,抵抗素处理H9c2心肌细胞2、3 h组pAkt蛋白表达水平显著降低(P<0.01);抵抗素处理H9c2心肌细胞2 h与处理3 h后H9c2心肌细胞中p-Akt蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。抵抗素处理H9c2心肌细胞48 h后,与Con组比较,R50组、LY294002+R50组心肌细胞面积、单细胞蛋白含量及α-SMA蛋白表达水平显著升高(P<0.05),而LY294002组其心肌细胞面积、单细胞蛋白含量及α-SMA蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05);与R50组比较,LY294002+R50组、LY294002组心肌细胞面积、单细胞蛋白含量及α-SMA蛋白表达水平均显著降低(P<0.05);与LY294002+R50组比较,LY294002组心肌细胞面积、单细胞蛋白含量及α-SMA蛋白表达水平均显著降低(P<0.05)。Con组、R50组、LY294002+R50组、LY294002组c-myc蛋白表达水平分别为0.45±0.30、0.68±0.32、0.56±0.33、0.16±0.20,4组间比较差异有统计学意义(F=178.91,P<0.05);与Con组比较,抵抗素处理H9c2心肌细胞48 h后,R50组c-myc蛋白表达水平显著增高(P<0.05);而LY294002+R50组c-myc蛋白表达水平较Con组、LY294002组升高但低于R50组(P<0.05)。经抵抗素处理H9c2心肌细胞3 h后,R50组PI3K/Akt信号通路磷酸化水平较Con组、LY294002+R50组、LY294002组显著升高(P<0.05),其余各组PI3K/Akt信号通路磷酸化水平表达比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论抵抗素通过激活PI3K/Akt通路,提高Akt磷酸化水平来诱导H9c2心肌细胞肥大。     

Ghrelin对脂肪间充质干细胞神经分化的影响

目的 探讨Ghrelin联合LY294002对脂肪间充质干细胞（ADSCs）神经分化的影响,并阐明其作用机制。 方法 倒置相差显微镜下观察ADSCs形态表现,流式细胞术鉴定ADSCs表面抗体阳性表达率,将第4代ADSCs分为对照组（不进行干预）、LY294002组［给予40 μmol·L^－1磷酸酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）通路特异抑制剂LY294002］、Ghrelin组（给予0.1 μmol·L^－1 Ghrelin）、Ghrelin+LY294002组（给予40 μmol·L^－1 LY294002+0.1 μmol·L^－1 Ghrelin）。倒置相差显微镜下观察各组ADSCs神经分化后的形态表现,免疫荧光染色法检测各组ADSCs中神经元特异性烯醇化酶（NSE）、巢蛋白（Nestin）和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）阳性细胞百分率,Western blotting法检测各组ADSCs中 PI3K/Akt通路蛋白表达水平,并计算磷酸化PI3K（p-PI3K）/PI3K和磷酸化Akt（p-Akt）/Akt比值。 结果 ADSCs表面抗体CD90和CD13高表达,CD34、CD45和CD106低表达。与对照组比较,LY294002组仅部分细胞由长梭形转变为类圆形胞体,突起较短、数量减少,而Ghrelin组细胞由长梭形转变为类圆形胞体速度增快;与LY294002组比较,Ghrelin+ LY294002组细胞由长梭形转变为类圆形胞体速度增快,且突起数量增加。与对照组比较,LY294002组ADSCs中NSE和Nestin阳性细胞百分率及p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt比值明显降低（P<0.05）,Ghrelin组ADSCs中NSE和Nestin阳性细胞百分率及p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt比值升高（P<0.05）;与LY294002组比较,Ghrelin+LY294002组ADSCs中NSE和Nestin阳性细胞百分率及p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt比值升高（P<0.05）;各组ADSCs中GFAP阳性细胞百分率比较差异无统计学意义（P>0.05）。 结论 Ghrelin通过激活PI3K/Akt通路促进ADSCs神经分化。     

肠三叶因子对胃黏膜上皮细胞增殖的影响及其信号转导机制的研究

目的：肠三叶因子（ intestinal trefoil factor , ITF）对胃黏膜具有保护作用,但其机制尚不明确。文中探讨重组ITF对胃黏膜上皮细胞增殖能力的影响及其可能作用的分子机制。方法将体外培养的GES-1细胞分为3组,其中1组作为细胞增殖活力实验空白对照组,其他2组分别加入浓度为100和500 ng/mL的人重组ITF形成低浓度ITF组和高浓度ITF组。光镜下观察细胞形态,并采用CCK-8试剂盒检测GES-1细胞的增殖活力。体外培养的GES-1细胞株分别用100 ng/mL的ITF和浓度为15μmol/L的PI3 K/Akt 信号通路抑制剂LY294002进行处理,分为信号通路蛋白表达实验空白对照组、ITF组、LY294002组和ITF＋LY294002组,光镜下观察细胞形态。随后采用CCK-8试剂盒检测GES-1细胞处理后的增殖活力,采用Western blot检测PI3K/Akt信号通路中p-Akt和Akt蛋白的表达情况。结果与空白对照组相比, ITF刺激下GES-1细胞增殖活力明显增强,且ITF浓度越高、增殖活力越强。使用LY294002处理后,能够显著抑制ITF刺激的细胞增殖。 Western blot检测结果表明,ITF提高了p-Akt蛋白的表达水平,激活PI3K/Akt信号通路。结论 ITF促进GES-1细胞的增殖,推测其分子作用机制主要是通过激活PI3K/Akt信号通路促进细胞增殖。     

磷脂酰肌醇-3激酶/Akt在体外神经干细胞存活和分化中作用的实验研究

目的:探讨磷脂酰肌醇-3激酶/Akt信号途径在体外培养神经干细胞存活、分化中的作用.方法:分为对照组、wortmannin组和LY294002组;免疫组化检测Nestin、NSE和S100的表达;TUNEL评价细胞凋亡率;Western Blotting检测磷酸化Akt、Caspase-9的表达.结果:随着wortmannin和LY294002浓度增大,细胞凋亡率逐渐增加.随着wortmannin和LY294002浓度增大,磷酸化Akt的表达逐渐减弱.高浓度时磷酸化的Caspase-9表达减弱.结论:神经干细胞存活依赖于PI3K/Akt途径的活化,其机制可能是PI3K/Akt活化后,促进了Caspase-9等蛋白的磷酸化,抑制了细胞凋亡事件的发生.     

PI3K/Akt通路对缺氧缺血皮质神经元细胞GLUT3转位的影响

目的 研究PI3K/Akt通路对大鼠缺氧缺血皮质神经元细胞葡萄糖转运蛋白3(GLUT3)转位的影响.方法 将原代培养的大鼠皮质神经元随机分为对照组、缺氧缺血组、缺氧缺血加LY294002 (PI3K特异性抑制剂)组,用Western blot检测3 h后3组细胞中PI3K/Akt磷酸化蛋白的表达,RT-PCR检测GLU...     

靶向抑制 PI3K 对PDK-1/Akt信号通路调控成骨细胞分化的影响

目的 通过观察磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)特异性抑制剂LY294002在成骨细胞分化过程中的影响,探讨PI3K通过调控PDK-1 /Akt信号通路对成骨细胞分化影响的分子机制。方法 采用体外培养C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)。通过CCK-8检测LY294002的最大安全浓度。对照组使用成骨细胞诱导培养基(OBM)处理BMSC,干预组在OBM中添加LY294002。检测两组细胞碱性磷酸酶（ALP）活性和细胞矿化能力,并分别采用Western-Blot和RT-PCR检测PDK-1 /Akt信号通路及下游蛋白和转录因子基因的表达水平。结果 CCK-8结果提示,在3.2 μM及以下浓度对BMSC的增殖没有影响;LY294002对成骨细胞分化的影响呈剂量依赖性（P＜0.05）;干预组ALP阳性细胞和细胞外基质矿化较对照组明显减少 (P＜0.05); Western-Blot 检测结果显示,干预组p-PDK 1和p-Akt蛋白表达水平较对照组明显降低 (P＜0.05);RT-PCR 结果提示,干预组成骨细胞相关基因ALP和骨钙素（OCN）mRNA较对照组表达明显下降 (P＜0.05)。结论 靶向抑制PI3K可通过PDK-1 /Akt信号通路明显下调成骨细胞相关基因ALP和OCN的表达,并抑制成骨细胞的分化。     

肝癌干细胞样细胞的分离及其耐药性受PI3K/Akt通路调节

目的 分离肝癌干细胞样细胞,初步探讨PI3 K/Akt通路调节其对化疗药物阿霉素的敏感性.方法 将人肝癌细胞株PLC、HepG2、Hep3B置于无血清条件培养基中培养,形成细胞球,选用PLC细胞株进行后续实验.采用流式细胞仪、克隆形成实验、SCID小鼠体内成瘤实验鉴定PLC细胞球(肝癌干细胞样细胞)的肿瘤干细胞特性.MTT法、流式细胞仪测定PLC细胞球对化疗药物阿霉素的敏感性.流式细胞仪分析加入PI3 K/Akt通路特异性抑制剂LY294002、阿霉素共同孵育细胞球后,其凋亡率的变化.Western blot法比较PLC细胞球、PLC贴壁细胞中p-Akt1(Ser473)蛋白分子表达量及加入抑制剂LY294002作用于细胞球后,p-Akt1(Ser473)、Akt1蛋白分子表达量的变化.结果 肝癌干细胞标志物CD90在细胞球中的表达较贴壁细胞显著升高(P＜0.01).细胞球的克隆形成数目(123.00±28.48)为贴壁细胞(56.33±7.37)的2.18倍(P＜0.05).同样细胞数接种于SCID小鼠皮下7周后,细胞球的致瘤率明显大于贴壁细胞.以5μg/mL的阿霉素分别处理细胞球和贴壁细胞48 h后,细胞球的增殖率明显高于贴壁细胞[(71.83±12.30)％ vs (45.68±5.95)％,P ＜0.05],凋亡率显著低于贴壁细胞[(11.73 ±3.77)％ vs (41.22±6.73)％,P＜0.01],而以阿霉素5μg/mL和LY294002共同孵育细胞球后,其凋亡率[(35.44±6.65)％]显著增加(P＜0.01).Western blot检测到细胞球的p-Akt1(Ser473)蛋白分子表达量显著高于贴壁细胞(P＜0.01),加入抑制剂LY294002处理细胞球后,p-Akt1(Ser473)蛋白表达量明显降低(P＜0.05),Akt1的表达量无明显变化(P＞0.05).结论 肝癌干细胞样细胞对化疗药物阿霉素具有耐药性,其耐药机制与Akt信号通路第473位点磷酸化Akt1分子有关.     

LY294002抑制PI3K/Akt信号通路对人胃癌SGC-7901细胞的影响

目的 探讨低氧环境下PI3K抑制剂2-(4-吗啉基)- 8-苯基- 4氢-1-苯并吡喃- 4-酮(LY294002)对人胃癌SGC-7901细胞中磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/丝氨酸苏氨酸激酶(Akt)信号通路、细胞生长、细胞凋亡及低氧诱导因子-1α(HIF-1α)mRNA表达的影响.方法 应用LY294002作用于低氧环境中的人胃癌SGC-7901细胞(低氧+LY294002组),采用CCK-8试剂盒检测SGC-7901细胞生长;流式细胞仪检测细胞凋亡百分比;Western blotting检测PI3K和p-Akt蛋白表达;RT-PCR检测HIF-1α mRNA表达.以低氧环境中未加LY294002的细胞作为对照(低氧组).结果 LY294002能抑制低氧环境中SGC-7901细胞增殖,抑制效果在药物作用后第2～6天时最为明显(P＜0.05),低氧+LY294002组中细胞凋亡百分比明显高于低氧组(P＜0.01).LY294002能明显抑制PI3K、p-Akt蛋白以及HIF-1α mRNA的表达,与低氧组比较差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 LY294002能抑制低氧环境中人胃癌SGC-7901细胞生长,促进细胞凋亡,抑制PI3K/Akt信号通路及其下游HIF-1α mRNA的表达.     

GDNF干预对化疗致精原干细胞耗竭小鼠生精细胞恢复效果的研究

目的：研究外源胶质细胞源性神经营养因子（ glialcell line - derived neurotrphic factor, GDNF）对化疗致不育小鼠生精细胞的恢复效果,明确GDNF促进在体精原干细胞再生的效果。方法：4周龄雄性C57小鼠腹腔注射白消安（30mg／kg）,注射后4周按601．Lg／kg体重剂量腹腔注射GDNF进行干预,每天一次连续注射7d。在干预后第4周收集睾丸,检测睾丸重量、通过HE染色检测生精小管中生殖细胞恢复情况;通过RT—PCR检测GDNF和SCF基因表达评价GDNF注射对小鼠精原干细胞微环境的影响。结果：在GDNF干预后第4周,睾丸重量明显得到恢复,生精小管中上皮细胞数量明显得到恢复,精原干细胞微环境中再生因子GDNF和分化因子SCF表达水平稳定。结论：GDNF干预可以促进化疗致精原干细胞耗竭小鼠睾丸中生精细胞数量明显恢复,且维持了精原干细胞微环境中再生分化调控的平衡关系。     

血清培养对大鼠精原干细胞生长周期的影响

目的探讨血清培养对大鼠精原干细胞生长周期的影响。方法采用percoll分离及差速贴壁法纯化精原干细胞.抗端粒酶逆转录酶免疫组化进行鉴定，用流式细胞仪对细胞生长周期进行判断。结果在有血清的培养基中培养的精原干细胞，其OD值逐渐升高（P〈0．05）；精原干细胞DNA合成期（S期）含量的增多。结论抗端粒酶逆转录酶免疫组化可作为鉴定精原干细胞提供较为充分的依据；血清能促进精原干细胞的体外增殖。     

精原干细胞体外非分化扩增的初步研究

目的探讨精原干细胞体外非分化性扩增的影响因素。方法采用昆明系小白鼠骨髓基质细胞原代培养,待细胞长成单层后经丝裂霉素C处理,作为精原干细胞培养的饲养层,细胞在37℃环境下培养。结果接种后2～4d,精原干细胞数明显增加,细胞单个、成双或成群,非精原干细胞开始出现崩解死亡;接种4～8d,精原干细胞增殖不明显,处于相对静止期;接种10d后,又开始出现明显的分裂增殖,15d已具有精原干细胞特征,继续培养25d,细胞形态未见明显改变,胞质桥仍明显。结论精原干细胞能在37℃环境温度下,在以骨髓基质饲养层上保持良好非分化性扩增。     

小鼠精原干细胞染色体G带显示及其影响因素研究

目的:探索精原干细胞染色体G带显示技术及其影响因素,为如何鉴定培养状态下干细胞的染色体核型提供实验参考.方法:培养昆明系小白鼠精原干细胞,待细胞生长到15～20天时,吸出克隆细胞团,吹打分散后滴加秋水仙素处理4～6小时.收集细胞悬液,再经低渗处理后滴片染色制成.结果:正常小鼠精原干细胞染色体呈粒状、棒状,核型为20对,40条.结论:小鼠精原干细胞染色体受到细胞所处的分裂时期、低渗处理的效果、滴片时细胞的分散程度及胰酶浓度及消化时间等因素的影响.     

大鼠A型精原干细胞的分离和纯化

目的摸索完善A型精原干细胞分离、纯化的方法与技术。方法选用9d的SD大鼠,不连续Percoll梯度液分离纯化精原干细胞,应用选择性贴壁法进一步纯化精原干细胞;台盼蓝排斥实验确定精原干细胞的活力;HE染色法观察细胞形态;c-kit细胞免疫组化鉴定细胞类型并进行细胞纯度分析。结果台盼蓝实验显示细胞活力维持于88.73%±0.85%;c-kit细胞免疫组化结果显示分离得到细胞为精原干细胞;细胞纯度为90.48%±1.78%。结论应用梯度离心及选择性贴壁法获得了纯度较高的A型精原干细胞。     

原癌基因A-myb对大鼠精原干细胞活性的影响

目的研究原癌基因A-myb在体外培养的9日龄大鼠精原干细胞活性中的作用。方法用不连续密度的Percoll液结合差速贴壁方法分离和纯化精原干细胞;用RT-PCR检测A-myb mRNA的表达;用Western blot检测A-myb表达产物A-myb的表达;用MTT比色法观察反义A-myb脱氧寡核苷酸(oligodeoxynucleo     

鹿茸多肽联合GDNF基因修饰的雪旺细胞对人骨髓间质干细胞体外增殖的影响

目的：探讨鹿茸多肽（PAP）联合胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）基因修饰的雪旺细胞对人骨髓间质干细胞（BMSCs）体外增殖的影响。方法：按常规方法抽取10 mL健康志愿者骨髓,接种于培养瓶中进行培养,原代培养细胞完全融合前进行传代,传至第3代时收获BMSCs,调整细胞浓度为5×10⁶ mL^-1备用。加入4 μL GDNF基因修饰的雪旺细胞为GDNF组,加入4 μL （10 mg·L^-1） PAP联合GDNF基因修饰的雪旺细胞作为联合组,对照组未加入任何药物仅加入等量的培养基。采用酶联免疫检测法检测各组细胞细胞增殖活力,ELISA法检测各组BMSCs中增殖细胞核抗原（PCNA）水平,AnnexinⅤ-FIFC/PI细胞凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡率。结果：原代培养48 h后大部分细胞贴壁,形态转变为多角形,少数呈梭形。传代细胞几乎呈梭形,为BMSCs,且均为非造血干细胞。与对照组比较,GDNF组和联合组细胞增殖活力和BMSCs中PCNA水平升高（P<0.05）,细胞凋亡率降低（P<0.05）;与GDNF组比较,联合组细胞增殖活力和BMSCs中PCNA水平升高（P<0.05）,细胞凋亡率降低（P<0.05）。结论：PAP联合GDNF基因修饰的雪旺细胞对人BMSCs体外增殖具有明显的促进作用。     

骨髓基质饲养层对精原干细胞体外培养的影响

目的以原代培养小鼠骨髓基质细胞为饲养层，探讨精原干细胞能否在该饲养层上生长及生长的影响因素。方法采用原代培养的小鼠骨髓基质细胞，待细胞长成单层后用丝裂霉素C处理并接种生精细胞共培养。结果原代的小鼠培养骨髓基质细胞能很好的维持精原干细胞的非分化性扩增。结论小鼠原代培养的骨髓基质细胞能作为饲养层支持精原干细胞体外非分化性扩增，该细胞有望成为干细胞培养的新的饲养层。     

黄芪注射液对大鼠精原干细胞增殖作用的影响

目的：研究黄芪注射液对体外培养的精原干细胞增殖过程中所起的调控作用;建立完善的精原干细胞体外培养体系,为精原干细胞的体外大量扩增提供技术和方法,为治疗男性不育等提供相关技术.方法：选用9日龄的SD大鼠睾丸,应用不连续Percoll梯度液分离纯化精原干细胞,并应用选择性贴壁法进一步纯化精原干细胞;细胞计数法研究不同浓度（0、5、10、20、50、100 g/L）黄芪注射液对精原干细胞增殖的效应;MTT法研究不同浓度黄芪注射液对精原干细胞增殖的效应.结果：细胞计数法结果显示,与对照组相比,黄芪注射液对精原干细胞有增殖作用（P﹤0.01）.MTT结果也显示实验组比对照组细胞数量均显著增多（P﹤0.01）.结论：黄芪注射液能够促进精原干细胞的增殖.     

人脐血间充质干细胞培养鉴定和慢病毒载体介导胶质源性神经营养因子在脐血间充质干细胞中的表达

目的 体外分离和培养人脐血间充质干细胞(UCB-MSCs),对其生物学特性进行鉴定.用含有胶质源性神经营养因子(GDNF)的慢病毒载体转染UCB-MSCs,初步评价基因转染后UCB-MSCs生物学功能变化,探讨GDNF在UCB-MSCs中的表达水平.方法 采用密度梯度离心法从脐血中分离单核细胞,通过贴壁培养和控制消化时间得到形态较均一的长梭形细胞,流式细胞仪(FACS)检测其细胞表面标记,诱导其向脂肪方向分化,对UCB-MSCs的生物学特性进行鉴定.将GDNF基因克隆人慢病毒载体,包装出病毒上清,以不同拷贝数转染UCB-MSCs,通过检测细胞表面抗原,观察细胞形态学和增殖分化能力的差异,初步评价基因转染对细胞生物学功能的影响.采用酶联免疫吸附实验(ELISA)和实时定量多聚合酶链反应(real-time PCR)技术分别测定不同转染组GDNF的蛋白及mRNA表达水平.结果 采用密度梯度离心法成功在体外分离和培养出UCB-MSCs,并诱导其向脂肪细胞分化.FACS检测结果显示,UCB-MSCs中CD90、CD73及CD105蛋白表达阳性,CD14、CD34、CD45、CD19、HLA-DR、Stro-1及CD106蛋白表达阴性.ELISA和real-time PCR检测结果显示,用含GDNF基因的慢病毒载体转染UCB-MSCs后,其GDNF蛋白分泌量和mRNA表达水平与转染拷贝数有关,转染拷贝数越高,GDNF表达量越高.GDNF基因转染后UCB-MSCs的原有生物学功能无明显改变.结论 成功在体外分离和培养出UCB-MSCs.用含有GDNF基因的慢病毒载体转染UCB-MSCs可通过转染拷贝数在一定水平上控制GDNF蛋白分泌量和mRNA表达水平,使其持续高表达GDNF.