肠道病毒感染的快速诊断技术

肠道病毒(EV)感染的临床表现多样,用聚合酶链反应(PCR)检测EV具有快速、敏感和特异的优点,因此适用于EV感染的早期诊断。本文介绍的逆转录PCR、套式PCR、竞争性PCR等方法在检测EV中各有特点,而且PCR结合特异性EV引物、抗原捕获、限制性片断长度多态性分析及基因测序等方法还可进行EV分型。     

聚合酶键反应与DNA测序

用一对寡核苷酸引物和DNA聚合酶对基因组中一特定的DNA片段进行体外扩增,这一技术称为聚合酶链反应(Polymerase chain Reaction,PCR),又称体外DNA放大。其过程是;DNA加热而变性解链→退火时引物与相应的DNA顺序(靶基因)互补配对→DNA聚     

细菌随机引物聚合酶链反应分析中随机引物的筛选与反应体系的优化

目的 筛选出最佳随机引物并优化其反应体系用于8种细菌的随机引物聚合酶链反应(AP—PCR)分析。方法 对200条随机引物进行过筛，应用反应曲面设计(RSD)进行AP—PCR反应体系的优化。结果 8种细菌各有1条最佳随机引物，相应的优化反应体系(关键反应成分)浓度差别较大，其中模板浓度差别最大达100倍。结论 以最佳随机引物及优化反应体系，才可使AP—PCR分型条件“标准”化。     

聚合酶链反应在HSV潜伏感染研究中的应用

潜伏感染的形成、持续和激活机制尚不清楚.为此,作者采用改进后的聚合酶链反应(PCR)检测了实验动物和人体各组织中的HSV-1 DNA和RNA序列.改进后的PCR技术包括(1)用套式引物进一步提高PCR     

葡萄球菌染色体mec盒多位点复合PCR分型测定

目的研究用多位点复合PCR分型法高效、快速、准确地测定金黄色葡萄球菌SCCmec型别。方法采用正交设计和平行对比分析,对影响测定结果的退火温度、延伸时间,MgCL2、dNTP、Taq DNA聚合酶、引物的用量进行了测试。结果获得多位点PCR测定的最佳退火温度为55℃、延伸时间为1 min,以及MgCl2、dNTP、TaqDNA聚合酶和各位点引物的最佳用量。结论多位点PCR测定是一种高效、快速、实用的SCCmec分型方法,可用于大规模的MRSA分子流行病学研究。     

等位基因特异性PCR方法检测炭疽芽胞杆菌致死因子基因点突变的评价

目的建立并评价等位基因特异性聚合酶链反应(PCR)在筛选炭疽芽胞杆菌致死基因点突变中的作用。方法等位基因特异性PCR方法。结果等位基因特异性PCR扩增的筛选方法假阳性率较高,其特异性与引物3′端的碱基类型关系不大,与退火温度、模板浓度等均有关系。高保真Taq DNA聚合酶不能改善这种假阳性。结论等位基因特异性PCR筛选方法影响因素较多,假阳性率高,不适于直接作为点突变的筛选方法。     

甲基化特异性PCR技术优化试验

目的建立一种高特异性的甲基化特异性聚合酶链式反应(MSP)法。方法以p15基因为目的基因,以经亚硫酸氢盐转化的全甲基化人类基因组DNA及亚硫酸氢盐转化的全非甲基化人类基因组DNA为模版,采用Methprimer软件预测p15启动子甲基化岛并设计甲基化及非甲基化引物,对甲基化及非甲基化DNA模板进行聚合酶链式反应(PCR)。根据MSP的PCR阶段的退火温度分为普通温度组(甲基化引物及非甲基化引物退火温度分别为58、55℃)及提高温度组(甲基化引物及非甲基化引物退火温度分别为60、57℃)。在普通温度组的基础上,通过增加镁离子(Mg~(2+))浓度、添加PCR反应体系中二甲基亚砜(DMSO)以优化PCR反应体系。结果 MSP的PCR反应阶段,普通温度组出现了非特异性扩增产物,即假阳性及假阴性;提高温度组非特异性扩增减弱,特异性扩增同等降低。普通温度的优化PCR体系组非特异性扩增消失,可以完全消除假阴性及假阳性。结论设置普通退火温度同时适当地增加Mg~(2+)浓度及DMSO有利于保证MSP结果的特异性。     

多重PCR-RFLP检测XRCC1基因两位点多态性

目的 探讨多重聚合酶链反应-限制性片断长度多态性(多重PCR-RFLP)技术在单核苷酸多态性检测中的应用.方法 应用多重聚合酶链反应(Multiplex)(多重PCR)原理设计人类X射线交错互补修复基因1(XRCC1基因)194、399位点引物,通过PCR-RFLP技术判断XRCC1基因2个SNP位点多态性.结果 设计的两对引物可同时PCR扩增分别含2个多态位点的DNA片段,MspI限制性内切酶酶切可判断2位点多态性,PCR和酶切效果均较好.结论 多重PCR-RFLP技术可应用于单核苷酸多态位点的检测,并节省时间和费用,提高检测效率.     

逆转录酶——聚合酶链反应检测肠道病毒

建立一种特异、敏感的检测肠道病毒的逆转录酶—聚合酶链(RT—PCR)方法。在肠道病毒RNA高度保守的5’端非编码区设计、选择、合成三对引物,采用RT—PCR对175株已知肠遭病毒和23份粪便标本进行检测。三对引物RT—PCR均显示高度特异性、敏感性。对23份粪便标本检测,E_1E_2引物有9份阳性,C_1C_2引物为7份阳性,P_1P_2均为阴性,与常规检测结果基本一致。这一检测方法具有较高特异性和敏感性,可用于临床快速检测肠遭病毒。     

聚合酶链反应在乙肝病毒检测中的应用

聚合酶链反应(Polymerase China Reaction,PCR)是近年建立的一种体外基因扩增技术。其原理是:靶DNA变性解链后与特异性引物杂交,在DNA聚合酶作用下使引物延伸,合成新的DNA。上述步骤反复进行,DNA就大量扩增,以指数递增放大。它具有简便、快速、灵敏度高、特异性强等优点,故受到广大科学工作者普遍重视。该技术目前已广泛应用     

用PCR和限制性酶分析快速鉴别汉坦病毒和汉城病毒

汉坦病毒76-118株和汉城病毒SR-11株的短小RNA S片段序列已被确定。通过比较核苷酸序列,作者选择出能扩增这两种病毒株同样大小DNA片段的两套引物序列,并试图用这两株病毒的两套共同引物以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和套式PCR以及PCR产物的限制性酶分析来鉴别汉坦病毒和汉城病毒。     

巢式PCR方法在快速检测新生儿败血症病原菌中的应用

目的探讨巢式聚合酶链反应(PCR)方法在快速检测新生儿败血症病原菌中的应用价值。方法以细菌16S rRNA基因为扩增靶序列,设计一对所有细菌通用引物和一对革兰阴性菌特有引物,用巢式PCR方法扩增已知病原菌,检测其特异性。用巢式PCR方法和培养法同时检测新生儿败血症血液,对2种方法的检测结果进行比较分析。结果已知实验菌株经通用引物扩增后均获得920 bp产物,革兰阴性菌经革兰阴性菌特有引物扩增后获得353 bp产物,而革兰阳性菌、人类基因组DNA、巨细胞病毒和白色假丝酵母菌无相对应产物。2种方法检测病原菌革兰分型吻合度一致,但巢式PCR方法阳性率高。结论巢式PCR方法检测新生儿败血症病原菌,具有快速、敏感度高等优点,并能对病原菌进行革兰分型,具有一定的实用价值。     

双创造酶切位点聚合酶链反应-限制性片段长度多态性检测MGMT基因多态性的应用

目的建立简便易行、经济适用的MGMT基因4个单核苷酸多态性位点的检测方法。方法应用碱基错配创造酶切位点原理设计引物,通过聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术判断MGMT基因四个SNP位点多态性。结果设计一对引物PCR扩增含MGMT84多态位点的DNA片段,另一对引物PCR扩增含MGMT基因143、160、178三个多态位点的DNA片段,使用4种限制性内切酶分别酶切判断4个位点多态性,PCR和酶切效果均较好。结论应用创造酶切位点PCR-RFLP原理建立的MGMT四个多态位点的检测方法具备简便、经济、快速的特点。     

NASBA和RPA两种等温扩增技术在病原菌检测中的应用研究

依赖核酸序列扩增和重组酶聚合酶扩增技术是在PCR基础上发展起来的等温扩增技术。本文介绍了这两个技术的反应原理、引物探针设计原则以及优势，根据其简便、准确性好、灵敏度高、周期短的特点进一步对该技术在病原菌检测中的应用予以综述及展望。     

用4对引物聚合酶链反应检验鼠疫菌的研究

目的 以传统的“四步检验”法为“金标准”，用4对引物聚合酶链反应（PCR）检测鼠疫动物材料，从而探索一种鼠疫快速诊断的方法。方法 毒力测定和4对引物PCR按常规方法进行。结果 在150份动物材料中，传统的“四步检验”作为金标准共检出阳性62份，而PCR法共检出阳性52份，经χ^2检验，差异无统计学意义（χ^2=1．42，P〉0．05）。PCR实验在4h内全部完成。结论 4对引物PCR法具有快速、敏感等优点，可以用于鼠疫的快速诊断和流行病学调查。     

登革2型病毒全长基因组的长链RT-PCR法扩增

目的采用长链RT—PCR技术扩增登革2型病毒新几内亚株（NGC）全长基因组。方法根据登革2型病毒NGC株基因组全序列设计引物，在上游引物中加入Sp6RNA聚合酶启动子核心序列，下游引物中加入Cla Ⅰ内切酶位点。从病毒感染的乳鼠脑中提取RNA，采用长链RT—PCR技术进行扩增。以获得的PCR产物为模板分别扩增3个NGC株特异的基因片段。结果长链RT—PCR法扩增出约11kb基因片段，经PCR法证实为登革2型病毒NGC株特异序列。结论通过长链RT—PCR技术，获得了登革2型病毒NGC株全长基因组，为进一步构建感染性克隆打下基础。     

利用正交设计优化脑膜炎奈瑟氏菌Taqman-MGB探针检测反应体系

[目的]建立Taqman-MGB探针检测脑膜炎奈瑟氏菌的最佳反应体系,探讨影响Taqman-MGB探针检测的多个因素.[方法]利用正交设计,从Buffer、 Taq DNA聚合酶、引物、Mg2 、探针、dNTP 6种因素对实时荧光PCR体系进行优化,在此基础上,进一步细调,寻求实时荧光PCR反应的最佳反应体系.[结果]正交试验结果表明,最佳反应体系为(50μl): Mg2 7.0mmol/L,引物0.6μmol/L, dNTP 300μmol/L, Taq DNA聚合酶2.0U,探针0.1μmol/L, Buffer 1.5×.[结论]Md2 是影响实时荧光PCR的重要因素;所得体系反应稳定,正交法实验设计高效、快捷,科学性强,值得推广.     

国内多聚酶链反应在传染病病原检测方面的应用进展

多聚酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR)技术由Mulis等于1985年首先创建.检测标本中只需少量DNA经放大后即能检测目的基因序列.此项技术经Saiki等用于镰形细胞性贫血的快速诊断,Chehab等用于Barts胎儿水肿综合征(缺失综合型)的产前诊断后,立即展现其广阔的应用前景并为医学微生物诊断开辟了一条新途径.现就国内这一技术应用于传染病病原诊断方面的一些进展作一简述.1 PCR的基本原理PCR是体外酶促合成特异DNA的一种方法,其基本原理是先将目的DNA变性为单链并作为模板,加入两个人工合成的与已变性的单链DNA模板互补的引物,在耐热的DNA聚合酶催化下,使4种三磷酸脱氧核在依模板3’端引物向5’端引物延伸,合成新的DNA.然后经反复变性、延伸、退火等循环20～30周期,极微量的DNA即可放大10~6倍.近年来该方法不断改进发展,建立了逆转录聚合酶链反应、套式聚合酶     

逆转录聚合酶链反应法在北京市流感病毒型别鉴定中的应用

目的：建立在流感病毒型别鉴定中使用的逆转录聚合酶链反应（RT－PCR）法。方法：用常规细胞培养法扩增病毒后,用2对型别鉴定引物和4对亚型鉴定引物进行RT－PCR反应。结果：在23株发生细胞病理变化的标本中RT－PCR阳性标本为10份,其中甲型7株（6株甲3亚型、1株甲1亚型）,乙型3株,结论：该方法快速、特异,灵敏,在流感病毒型别鉴定中具有较大的应用价值。     

国内外鼠疫引物设计研究进展

目的 研究国内外鼠疫PCR引物,了解引物设计种类及特征.方法 收集各文献资料中PCR引物设计方法,进行整理归类.结果 显示PCR引物设计按数量可分为单引物PCR、双引物PCR、多引物PCR.结论 掌握PCR引物设计方法,同时采取相应的防假阴性、假阳性及UDPE防污染措施,可有效地将PCR应用于鼠疫检测中.