聚合酶键反应与DNA测序

用一对寡核苷酸引物和DNA聚合酶对基因组中一特定的DNA片段进行体外扩增,这一技术称为聚合酶链反应(Polymerase chain Reaction,PCR),又称体外DNA放大。其过程是;DNA加热而变性解链→退火时引物与相应的DNA顺序(靶基因)互补配对→DNA聚     

聚合酶链反应及其在病毒性疾病中的应用

聚合酶链反应是近年来发展起来的体外基因扩增的应用。在耐热聚合酶，底物及引物的参与下能在短时间的内使 异的DNA序列大量扩增。聚合酶链反应具有特异性强、敏感性高的优点，现已被广泛应用于基因遗传性疾病等的研究，本文简要介绍其原理及在病情性疾病诊断领域中的应用。     

甲基化特异性PCR技术优化试验

目的建立一种高特异性的甲基化特异性聚合酶链式反应(MSP)法。方法以p15基因为目的基因,以经亚硫酸氢盐转化的全甲基化人类基因组DNA及亚硫酸氢盐转化的全非甲基化人类基因组DNA为模版,采用Methprimer软件预测p15启动子甲基化岛并设计甲基化及非甲基化引物,对甲基化及非甲基化DNA模板进行聚合酶链式反应(PCR)。根据MSP的PCR阶段的退火温度分为普通温度组(甲基化引物及非甲基化引物退火温度分别为58、55℃)及提高温度组(甲基化引物及非甲基化引物退火温度分别为60、57℃)。在普通温度组的基础上,通过增加镁离子(Mg~(2+))浓度、添加PCR反应体系中二甲基亚砜(DMSO)以优化PCR反应体系。结果 MSP的PCR反应阶段,普通温度组出现了非特异性扩增产物,即假阳性及假阴性;提高温度组非特异性扩增减弱,特异性扩增同等降低。普通温度的优化PCR体系组非特异性扩增消失,可以完全消除假阴性及假阳性。结论设置普通退火温度同时适当地增加Mg~(2+)浓度及DMSO有利于保证MSP结果的特异性。     

环介导等温扩增技术的应用

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物,利用一种链置换型DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在恒温65℃左右保温几十分钟快速进行核酸扩增的方法。由于其具有快速、简便、特异性好、灵敏度高、成本低等优点,已经应用于临床诊断、食品卫生检疫及基因芯片的开发,特别是在细菌和病毒的检测方面有重要意义。     

随机引物扩增多态性DNA聚合酶链反应技术用于蚊细胞的鉴定

本文应用随机引物扩增多态性DNA聚合酶链反应技术筛选出引物Pm,用此引物对淡色库蚊细胞系(CPP-512)、中华按蚊卵巢细胞系(Anso-242)、嗜人按蚊细胞系(Ana-104)、白纹伊蚊细胞株(C6/36)4种蚊细胞基因组DNA进行扩增,得出4个相异的多态性DNA扩增产物图谱,各自的DNA扩增条带的分子量(kb)为CPP-512:0.5、0.7、0.8、0.88、1.02、1.22;Anso-242: 0.5、0.88、1.02、1.13、1.22、1.5、2.1、2.4、2.5;Ana-104:0.64、0.98、1.2、1.28、1.4、1.53、1.8、2.3、2.6、3.3;C6/36:0.66、0.8、0.94、1.4、1.42、1.5、1.52、2.9。实验结果表明,随机引物扩增多态性DNA聚合酶链反应技术是一种简便易行、结果重复性好的先进生物学分类技术,引物Pm能满足同时鉴别3属蚊虫的4种蚊细胞的需要。     

多重PCR同时检测苍白密螺旋体、单纯疱疹病毒及杜氏嗜血菌的实验研究

目的 建立多重PCR用于同时检测苍白密螺旋体(梅毒螺旋体)、单纯疱疹病毒和杜氏嗜血菌.方法 根据各病原体特异性基因序列,即单纯疱疹病毒Ⅰ和Ⅱ型(HSV Ⅰ和HSVⅡ)的DNA聚合酶基因、苍白密螺旋体47×103膜蛋白基因及杜氏嗜血菌16S rRNA基因序列,自行设计3对特异寡核苷酸引物,建立同时检测3种病原体DNA的多重PCR.结果 各特异性引物仅扩增相应的病原体DNA,即苍白密螺旋体、单纯疱疹病毒、杜氏嗜血菌扩增靶DNA片段分别为202、252、152 bp;各病原体DNA连续10倍稀释,可检测的DNA最低量为0.012ng;其他几种生殖道常见菌及人基因组DNA不被上述引物扩增.结论 多重PCR同时检测苍白密螺旋体、单纯疱疹病毒和杜氏嗜血菌DNA具有较好的特异性,将可能为患者提供敏感、快速和准确的检测手段.     

三种伊蚊细胞系基因组多态性DNA的研究

目的：探讨3种伊蚊细胞系基因组多态性DNA。方法：应用3个引物，通过随机引物扩增多态性DNA聚合酶链反应技术（RAPD-PCR），对东乡伊蚊、埃及伊蚊和白纹伊蚊的细胞系基因组DNA进行扩增。结果：分别扩增出不同数量和分子大小的多态DNA图谱；3种伊蚊细胞的基因组DNA扩增产物除了有部分相同分子大小的DNA条带外，还有各自独特的DNA条带。结论：此方法简便、快速、精确，可用于蚊虫的分子分类研究。     

白纹伊蚊Cytb基因特异性引物的设计及评价

目的设计并评价白纹伊蚊细胞色素b(Cytb)基因特异性引物。方法根据白纹伊蚊Cytb基因保守区域序列,设计1对引物,优化PCR扩增的退火温度。以白纹伊蚊及同属、同科、同目昆虫基因组DNA为样本,评价引物的特异性;以白纹伊蚊基因组DNA为样本,评价引物的灵敏性;扩增4个口岸捕获的8只白纹伊蚊,评价引物的重复性。结果设计的引物的最佳退火温度为55℃。该引物可成功扩增白纹伊蚊Cytb基因,不能扩增其同属、同种、同目昆虫基因;可扩增来自4个口岸的浓度1.9 ng/μl以上的白纹伊蚊基因组DNA。结论本研究设计的引物的特异性、灵敏性、重复性理想,适用于白纹伊蚊的鉴定。     

等位基因特异性PCR方法检测炭疽芽胞杆菌致死因子基因点突变的评价

目的建立并评价等位基因特异性聚合酶链反应(PCR)在筛选炭疽芽胞杆菌致死基因点突变中的作用。方法等位基因特异性PCR方法。结果等位基因特异性PCR扩增的筛选方法假阳性率较高,其特异性与引物3′端的碱基类型关系不大,与退火温度、模板浓度等均有关系。高保真Taq DNA聚合酶不能改善这种假阳性。结论等位基因特异性PCR筛选方法影响因素较多,假阳性率高,不适于直接作为点突变的筛选方法。     

聚合酶链反应及其在病毒性疾病中的应用

聚合酶链反应是近年来发展起莱的体外基因扩增的应用技术。在耐热聚合酶、底物及引物的参与下能在短时间内使特异的1]NA序列大量扩增。聚合酶链反应具有特异性强、敏感性高的优点,现B被广泛应用于基因遗传性疾病等的研究。本文简要介绍其原理及在病毒性疾病诊断领域中的应用。     

军团菌D-RAPD基因分型研究

〔目的〕建立军团菌的基因分型方法。〔方法〕采用D—RAPD技术 ,应用 6条简并随机引物对 5株军团菌 (包括 3株嗜肺军团菌 )进行基因分型研究。〔结果〕除引物 4 ,其余 5个随机引物均能对军团菌菌株扩增出特异性的DNA条带 ,其中引物 2的分型效果较好。用引物 2、引物 3两引物 ,引物 2、引物 5两引物 ,引物 3、引物 5两引物 ,分别对 5株军团菌DNA进行扩增 ,结果 3对引物在扩增条带的数量和长度上均能有效区分 5株军团菌。〔结论〕D—RAPD技术快速、简便 ,是在分子水平对致病微生物进行检测、发病机理分析、流行病学研究的理想方法。     

食品中沙门菌特异性二重聚合酶链反应检测方法的研究

目的建立二重聚合酶链反应(PCR)方法快速检测食品中的沙门菌(Salmonella spp.)。方法以沙门菌特异性基因invA、hilA为靶基因,选择2对引物对16株沙门菌和24株非沙门菌进行扩增,验证二重PCR的特异性。梯度稀释DNA,以不同稀释度的DNA PCR扩增。在猪肉中以不同菌量人工污染,不同增菌时间培养,提取DNA进行PCR扩增。应用该方法检测实际样品。结果以invA、hilA为靶基因的两对引物对沙门菌的检出均有很好的特异性,PCR能检出0.1332pg的沙门菌DNA,人工污染猪肉的检测限为2.5cfu/ml。本研究共检测了53份食品样品,有21份检出了沙门菌。结论建立了适用于肉类、水产品及蛋糕等食品中的沙门菌检测的快速、灵敏、特异的二重PCR方法。     

应用自动改良的聚合酶链反应系统检测HBV DNA

本文作者曾报道用聚合酶链反应(PCR)检测乙型肝炎病毒HBV DNA。本文在上述研究的基础上,进一步筛选PCR所需的引物,探索Taq聚合酶用于引物杂交和基因扩增的温度.     

DNA扩增制备探针并用于临床白色念珠菌感染鉴定

目的应用聚合酶链反应技术扩增特异DNA片段,并制备成为可应用于临床鉴定白色念珠菌的基因探针. 方法采用聚合酶链反应技术特异地扩增白色念珠菌标准株DNA EO3 125 bp基因片段,然后用半抗原地高辛配基标记,在完成基因探针显色敏感度检测之后,应用该基因探针分别对血液病病房分离的白色念珠菌、热带念珠菌及大肠埃希菌等多种细菌进行斑点杂交测试. 结果基因扩增制备Dig-125 bp DNA探针显色敏感度为0.01 pg,具有白色念珠菌特异性,与其他念珠菌和细菌不发生杂交. 结论基因扩增制备EO3 125 bp DNA探针方法简便可靠,具有很强特异性,可应用于临床鉴定白色念珠菌感染.     

淋球菌PCR检测技术研究进展

聚合酶链反应（PCR）检测技术是一种体外DNA扩增技术。其基本原理是酶促DNA合成反应，即在模板DNA、引物和脱氧核糖核酸存在及DNA聚合酶的作用下，使DNA链扩增。由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成。随着微生物基因组学的发展，对淋球菌的基因结构越来越清楚。1985年Korch等克隆出隐蔽性质粒基因（cppB），1988年Rossau等发现淋球菌16SrRNA存在着另一个独立的基因区域，这个基因区域的核苷酸系列靶目标较多，且较稳定，能把淋球菌与其它非淋球菌区别开来。     

金属β内酰胺酶基因bla_(NDM)重组酶聚合酶扩增方法的建立

目的建立一种基于重组酶聚合酶(recombinase polymerase amplification,RPA)扩增方法金属β内酰胺酶基因bla_(NDM)的快速检测方法,为广泛耐药菌基因类型的确定提供技术支持。方法遵照重组酶聚合酶扩增引物和探针设计原则,以bla_(NDM)基因特异性序列为靶基因,设计相应的RPA扩增引物和探针。取梯度稀释已知拷贝数的DNA模板和致病菌核酸样品进行各扩增体系的RPA扩增实验,分析扩增体系的敏感性、特异性和重复性特征以便筛选和评价bla_(NDM)基因的RPA扩增体系。结果 3组扩增体系的引物和探针能够有效的扩增靶基因,检出限达到2×10~2copys/反应,与其他细菌样品无非特异性扩增反应,能够在2～7 min内实现靶基因有效扩增。结论建立了金属β内酰胺酶基因bla_(NDM)的重组酶聚合酶扩增体系,该反应迅速,检出限较低,具有较高的特异性,适用于耐药菌的现场检测。     

兰州市首起甲型H1N1流感暴发的核酸检测

目的:鉴别一起不明原因导致的突发性发热事件病原体。方法:提取样本中的RNA后,使用针对于甲型H1N1流感病毒相关的不同浓度引物、探针和DNA聚合酶缓冲液等作为反应成份,按照不同的扩增程序,利用逆转录PCR(RT-PCR)和实时荧光定量PCR(real-time PCR)方法分别进行特异性DNA片段的扩增,对扩增产物的电泳图片和扩增图谱进行分析。结果:经RT-PCR方法检测后,分别扩增出235、527、153和80 bp的特异性片段,实时荧光PCR扩增曲线中,出现了与阳性对照一致的扩增图谱。结论:此次事件的病原体为甲型H1N1流感病毒,定性本次事件为甲型H1N1流感暴发事件。     

实时荧光环介导恒温扩增检测无乳链球菌方法的建立与评价

目的建立实时荧光环介导恒温扩增(Rea-LAMP)快速检测无乳链球菌的方法,为无乳链球菌的快速检测提供一种新的方法。方法针对无乳链球菌纤连蛋白fbsB基因的6个区域设计6条特异性引物,利用链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)恒温反应60min,通过荧光信号实时检测无乳链球菌。结果研究的反应体系在使用引物1时,扩增效果最好;在10株相关菌株的检测中,除无乳链球菌出现很好的阳性外,其余菌株均为阴性;本研究检测无乳链球菌DNA的灵敏度可达到300pg/μl。结论 Rea-LAMP检测无乳链球菌的特异性强、稳定性高、操作简便快速,具有较大的推广应用前景,可用于无乳链球菌的快速检测。     

聚合酶链反应技术

1 概述聚合酶链反应(Polymerase Chain Rea-ction,PCR)是一种在体外酶促合成特定DNA片段的方法。用一对寡核苷酸引物,结合到待扩增的模板DNA片段的特定区域的两相对单链上,延伸产生新链。如此重复进行模板变性(解链)、引物复性与延伸三步骤,结果以指数形式产生特定的DNA片段,几小时可得到百万倍的扩增产物(图1)。     

多重聚合酶链反应检测流感嗜血杆菌

目的 建立检测流感嗜血杆菌的多重聚合酶链反应(M-PCR)方法 .方法 合成扩增流感嗜血杆菌编码P6外膜蛋白基因的引物(Hi),鉴定流感嗜血杆菌种特异性;合成扩增流感嗜血杆菌编码荚膜基因的引物(Hi-cap),鉴定菌株是否具有荚膜;设计并合成6对扩增流感嗜血杆菌不同血清型(荚膜型)编码摹因的引物(Hia-Hif),鉴定菌株的血清型,以其他呼吸道常见病原体菌株做对照,应用M-PCR方法 对200株临床分离的疑似流感嗜血杆菌菌株进行鉴定和血清分型.结果 M-PCR方法 检测流感嗜血杆菌具有高度的敏感性和特异性.对照菌株应用种(Hi)、荚膜(Hi-cap)和荚膜型(Hia-Hif)特异引物没有扩增出DNA片段.M-PCR方法 检测DNA的最低检测量为0.935 Pg.对临床分离的200株疑似流感嗜血杆菌鉴定,189株为流感嗜血杆菌,与API R NH鉴定结果 一致.其中1株具有荚膜,为f血清型,与玻片凝集法鉴定结果 一致.结论 M-PCR方法 检测流感嗜血杆菌具有较高的敏感性和特异性,可用于流感嗜血杆菌感染病例标本的快速检测和病例诊断.