C/EBPα不同截短功能域GST融合蛋白表达载体的构建及表达的研究

目的 构建GST-C/EBPa融合蛋白表达载体,并在大肠埃希茵(E.coli)中诱导表达.方法 以质粒pcDNA3.1-C/EBPa为模板,用PCR法扩增C/EBPα全长及各个截短片段,通过EcoRI和XhoI酶切位点将C/EBPα全长及各个截短突变体定向插入pGEX-5X-1中,构建原核表达质粒pGEX-5X-1-C/EBPα及其截短突变体,并转化E-coliDH5α筛选阳性重组子,限制性内切酶酶切鉴定和DNA序列测定正确后,转入E.coli BL21中,异丙基硫代β-D半乳糖苷诱导表达,SDS-PAGE和SDS-PAGE鉴定.结果 酶切及测序结果证明,成功构建了原核表达质粒pGEX-5X-1-C/EBPα及其截短突变体,并用SDS-PAGE方法证实了GST-C/EBPa全长及各个截短突变体融合蛋白的表达.结论 成功构建了C/EBPa原核表达载体及其截短突变体,并证实了融合蛋白的表达,为进一步纯化C/EBPa蛋白和研究C/EBPa的生物学功能奠定了基础.     

迁移侵袭抑制蛋白 MIIP 基因 K167E 位点突变体的构建和表达

目的构建人迁移侵袭抑制蛋白（MIIP）蛋白K167E突变体的原核表达载体pGEX-4T-1-MIIP（K167E）并进行表达和纯化,为MIIP的后续功能研究提供有效工具。方法以pGEX-4T-1-MIIP重组质粒为模板,PCR扩增得到人MIIP基因（K167E）突变体的eDNA全长,将其克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,构建获得pGEX-4T-1-MIIP（K167E）突变体,经酶切鉴定及测序验证完全正确后,将其转化至大肠杆菌B121细胞中诱导表达,纯化获得GST—MIIP（K167E）融合蛋白。结果酶切鉴定和测序结果显示,pGEX-4T-1-MIIP（K167E）突变体表达载体构建成功。经诱导表达及纯化后,成功获得的GST—MIIP（K167E）融合蛋白。结论成功构建了pGEX-4T-1-MIIP（K167E）突变体表达载体,并获得了GST—MIIP（K167E）融合蛋白。     

GST/RIPX融合蛋白表达载体的构建及其在大肠埃希菌中的表达

目的 构建GST/RIPX融合蛋白基因表达载体,并在大肠埃希菌(E.coli)中诱导表达.方法 以质粒pcDNA3.1.RIPX为模板,通过BamH1和Xho1酶切位点将RIPX定向插入pGEX-4T-2中,构建原核表达质粒pGEX-4T-2-RIPX,并转化E.coil DH5а,筛选阳性重组子,限制性内切酶酶切鉴定和DNA序列测定正确后,转入化E.eoli BL21中,异丙基硫代β-D半乳糖苷诱导表达.鉴定.结果 酶切及测序结果证明,成功构建了原核表达质粒pGEX-4T-2-RIPX,并用SDS-PAGE方法证实了GST/RIPX融合蛋白的表达.结论 成功构建了RIPX原核表达载体,并证实了融合蛋白的表达,为进一步纯化RIPX蛋白和研究RIPX的生物学功能奠定了基础.     

GST-LMO1融合蛋白表达载体的构建及其在原核细胞中的表达

 目的构建GST-LMO1 融合蛋白表达载体,并在原核细胞大肠埃希菌（Ecoli ）中诱导表达。方法以人胎脑文库为模板,用PCR方法法扩增出LMO1基因全长及各个截短突变体,通过BamH Ⅰ和EcoRⅠ酶切位点分别将其定向插入pGEX-5X-2载体中,构建原核表达质粒pGEX-5X-2-LMO1及其截短突变体,通过酶切电泳鉴定和DNA 序列测定正确后,转入Ecoli BL21中,经异丙基硫代茁-D 半乳糖苷诱导表达,SDS-PAGE 和Western blot 鉴定。结果酶切电泳及测序结果证明,成功构建了原核表达质粒pGEX-5X-2-LMO1及其截短突变体,并用Western blot 方法证实了GST-LMO1 全长及各个截短突变体融合蛋白的表达。结论成功构建了LMO1 全长及其截短突变体原核表达载体,并证实了其在原核细胞大肠埃希菌中的表达,为LMO1 结构与功能的研究提供了前提基础。     

GST-hCAP融合蛋白表达载体的构建及其在原核细胞中的表达

目的:构建GST标签的人c-Cbl相关蛋白(GST-hCAP)融合蛋白表达载体,并在大肠埃希菌(E.coli)中诱导其表达.方法:从COS-1细胞中提取mRNA,反转录为cDNA.用PCR方法扩增出hCAP基因全长,通过EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点将其定向插入pGEX-5X-1载体中,构建原核表达质粒pGEX-5X-1-hCAP,并转化E.coli DH5α,通过限制性内切酶酶切电泳和DNA测序鉴定正确后,转入E.coli BL21中,经异丙基硫代β-D半乳糖苷大量诱导表达,SDS-PAGE电泳和Western blot鉴定.结果:酶切电泳及测序结果证明,原核表达质粒GST-hCAP构建成功,用Western blot方法也证实了GST-hCAP融合蛋白的表达.结论:成功地构建了GST-hCAP原核表达载体,证实了其在原核细胞大肠埃希菌中的表达,为进一步纯化CAP及研究其结构与功能提供了前提基础.     

多功能转录因子CTCF重组质粒构建及其表达鉴定

目的 构建人CTCF cDNA全长及N端、Zn指、C端3个片段的原核融合表达载体,纯化融合蛋白并进行鉴定.方法 以编码CTCF全长序列的质粒为PCR模板,分别构建GST融合表达重组质粒pGEX-4T-2-CTCF,pGEX-4T-2-CTCF-N,pGEX-4T-2-CTCF-Zn,pGEX-4T-2-CTCF-C,转化大肠杆菌BL21,酶切、测序鉴定;优化IPTG诱导表达条件,并对亲和层析纯化的GST融合蛋白CTCF,CTCF-N,CTCF-Zn,CTCF进行Far-West-ern blot鉴定.结果 重组质粒经双酶切和测序鉴定证实构建成功.GST融合蛋白CTCF,CTCF-N,CTCF-Zn,CTCF-C均在大肠杆菌中成功诱导表达,融合蛋白经亲和层析纯化获得纯化蛋白.各纯化蛋白经SDS-PAGE和Far-Western blot鉴定,均为诱导表达蛋白质.结论 成功构建了GST融合表达CTCF,CTCF-N,CTCF-Zn,CTCF-C的重组质粒,对融合蛋白表达条件进行了优化.获得了高效表达的GST融合蛋白.     

RUNX3全长和不同结构域原核表达载体的构建及其重组蛋白表达

目的：构建RUNX3全长和不同结构域的原核表达载体并表达其重组蛋白。方法：以pcDNA3.1-myc-RUNX3为模板,采用PCR法扩增RUNX3全长和各个结构域片段,通过EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点将RUNX3全长和不同结构域定向插入谷胱甘肽转移酶（GST）融合表达载体pGEX-4T-2中,在大肠杆菌(E.coli) BL21中诱导其融合蛋白表达,SDS-PAGE电泳检测其蛋白表达情况。结果：EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后得到与预期大小相符的FL（1 245 bp）、ΔRunt(843
 bp)、Nter（159 bp）、Runt（402 bp）和Cter（684 bp）5个载体片段。SDS-PAGE电泳检测,RUNX3全长及各个结构域截短GST-RUNX3截短融合蛋白（GST-FL、GST-Runt、GST-Nter和GST-Cter）相对分子质量分别为72 000、40 000、32 000和51 000。 结论：成功构建RUNX3全长和各个结构域截短的GST标签的原核表达载体,并实现其重组蛋白在原核细胞中的表达。
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GST-CTCF融合蛋白原核表达载体的构建及表达

目的构建人CCCTC结合因子(CCCTC-binding factor,CTCF)与谷胱甘肽转移酶(glutathione S-transferase,GST)重组蛋白的原核表达载体,并进行诱导表达。方法以pEASY-T1-SIMPLE-CTCF为模板,设计引入限制性酶切位点的CTCF引物,PCR方法扩增目的片段,产物经限制性内切酶酶切后与原核表达载体pGEX-4T-1连接,构建成pGEX-4T-1-CTCF原核表达载体,转化至大肠埃希菌BL21中,经异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)进行诱导,Western blot检测GST-CTCF融合蛋白的表达情况。结果经菌液PCR、质粒双酶切分析、基因测序分析证实重组表达质粒pGEX-4T-1-CTCF构建成功,GST-CTCF融合蛋白产物经Western blot鉴定为特异性表达。结论成功构建了pGEX-4T-1-CTCF原核表达质粒,获得特异性的GST-CTCF融合蛋白,为进一步研究转录因子CTCF的功能奠定了基础。更多还原     

GST-HPV16E7融合蛋白的原核表达与纯化

目的 构建HPV16地方株E7基因原核表达质粒,使其在原核细胞中高效表达并进行纯化.方法 将成都本地某宫颈癌患者所感染的HPV16 E7全长片段插入原核表达载体pGEX-4T-1,构建重组子pGEX-4T-1-HPV16E7,转化宿主菌E.coli BL-21.经IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE、Western blot分析证实蛋白表达的特异性.并用GST亲和层析法对融合蛋白进行纯化.结果 该患者所感染的HPV16为东亚株,成功构建了原核表达载体pGEX-4T-1-HPV16E7并表达出GST-HPV16E7融合蛋白,证实了蛋白表达的特异性,并获得了GST-HPV16E7融合蛋白的纯品.结论 成功表达、纯化了本地流行株GST-HPV16E7融合蛋白,为进一步研究HPV16E7蛋白的功能奠定了实验基础.     

结核分枝杆菌RD1区PPE68/GST融合蛋白表达质粒的构建及表达

目的:构建结核分枝杆菌PPE68/GST融合蛋白表达质粒,并在大肠杆菌JM109中诱导表达. 方法: 利用PCR技术从结核杆菌H37Rv中扩增Rv3873基因,并将其定向克隆pGEX-4T-1中,构建重组表达质粒pGEX-4T-1-Rv3873并转化E.coli JM109,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达.采用GST蛋白纯化试剂盒进行重组融合蛋白纯化,SDS-PAGE和Western Blot鉴定重组表达产物. 结果:成功构建原核表达质粒pGEX-4T-1-Rv3873并表达出约Mr 63 000大小的PPE68/GST融合蛋白,占总菌体的40%. Western Blot检测该融合蛋白能和结核患者多价抗血清发生反应. 结论:成功地构建了原核表达质粒pGEX-4T-1-Rv3873,并在大肠杆菌得到表达.     

人p21活化激酶6基因截短区域的GST标签原核表达质粒的构建及其重组蛋白的表达

目的：构建人p21活化激酶6(PAK6)的各个截短区域原核表达质粒,并诱导和鉴定其融合蛋白的表达,为探讨PAK6基因的生物学功能提供依据。方法：以真核表达质粒pcDNA3.1-GFP-PAK6 为模板,PCR扩增出 PAK6基因的各个截短片段。所获得的各截短片段经EcoRⅠ/XhoⅠ双酶切后克隆至GST标签的原核表达载体pGEX-5X-1中。将构建的PAK6各截短质粒转化入E.coli BL21中,采用IPTG诱导PAK6基因截短融合蛋白表达, 采用Western blotting 法鉴定PAK6基因截短融合蛋白的表达。结果：EcoRⅠ/XhoⅠ双酶切后得到与预期大小相符的载体片段（5 000 bp）和PAK6 1-55(165 bp)、PAK6 56-210(465 bp)、PAK6 211-410（600 bp）及PAK6 385-681（891 bp） 4个片段。Western blotting检测, PAK6各截短区域质粒GST-PAK6截短融合蛋白相对分子质量分别为32 000、43 000、48 000和60 000。结论：成功构建PAK6基因各个截短区域GST标签原核表达质粒并表达其重组蛋白。     

人类疱疹病毒8型ORF50基因截短片段和vIL-6全长基因的克隆?表达及表达产物的纯化

目的:克隆人类疱疹病毒8型(human herpesvirus 8,HHV-8)ORF50截短基因和编码病毒IL-6(vIL-6)全长基因,将其置于大肠杆菌中作融合表达.并纯化融合表达的vIL-6.方法:分别以本实验室先前构建的重组质粒pcDNA3.1+ORF50和peD-NA3.1+vIL-6为模板,PCR扩增目的基冈片段,克隆到原核表达载体pGEX-6p-1中,构建含HHV-8 ORF50截短基因的重组原核表达质粒pORF50-C1,pORF50-C2,pORF50-C3和含vIL-6伞长基因的重组原核表达质粒pvIL-6.重组质粒经酶切鉴定和核酸序列测定正确后转化大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)感受态细胞,以异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白.用glutathione Sepharese 4B亲和层析柱纯化vIL-6表达产物.用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和Western blot检测GST融合蛋白的表达和纯化情况.结果:核酸序列分析的结果表明,克隆的序列与基因数据库中已登记的HHV-8相应序列呈现100%同源:IPTG诱导后的菌体.经SDS-PAGE,显示有相应大小的融合表达蛋白产生.Western blot亦在预期的位置检测到特异性条带.结论:在E.coli中获得了正确表达的HHV-8 ORF50基因3个截短片段和vIL-6全长基因,并成功纯化vIL-6融合蛋白.     

人胰高血糖素样肽-1突变体基因的构建和表达

目的构建人胰高血糖素样肽-1突变体（^2Gly-hGLP-1）基因，并表达GST一^2Gly-hGLP-1。方法用限制性内切酶双酶切载有hGLP cDNA的重组克隆质粒PMD18T simple和原核表达质粒pGEX-4T-1，将GLP-1定向插入原核表达载体pGEX-4T-1^＊中，筛选出阳性克隆。在获得重组hGLP-1基因工程菌的基础上，利用定向突变的技术改造其第2位丙氨酸为甘氨酸，经酶切克隆于pGEX-4T-1^＊中，构建pGEX-4T-1^＊／^2Gly-hGLP-1表达载体。转化大肠杆菌BL21并进行诱导表达。结果经测序分析，证明^2Gly-hGLP-1已经克隆到pGEX-4T-1^＊中。Western blot证实，该蛋白可被特异性hGLP-1识别。结论成功构建和表达了人胰高血糖素样肽-1突变体原核表达质粒。     

犬博卡病毒结构基因VP2多片段原核表达载体的构建及表达条件的优化

目的 构建重组pGEX-4T-3-VP2-A、pGEX-4T-3-VP2-B、pGEX-4T-3-VP2-C、pGEX-4T-3-VP2-D原核表达质粒,并在大肠杆菌中进行表达,对诱导表达条件进行优化,为下一步获得大量纯化的融合蛋白奠定基础.方法 应用蛋白二级结构软件,设计合成MVC-VP2基因片段引物.用PCR法扩增不同长度的cDNA片段,通过EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点分别将四个不同的片段插入到pGEX-4T-3中,构建四种原核表达重组质粒,并转化E.coli DH5α,筛选阳性重组子,限制性内切酶酶切鉴定和DNA序列测定正确后,转入E.coli BL21中,异丙基硫代β-D半乳糖苷（IPTG）诱导表达,对表达条件（诱导剂浓度、诱导时间、诱导温度）进行优化,并通过SDS-PAGE鉴定.结果 酶切及测序结果证明,成功构建了四种原核表达重组体质粒pGEX-4T-3-VP2-A、pGEX-4T-3-VP2-B、pGEX-4T-3-VP2-C、pGEX-4T-3-VP2-D,成功表达四种融合蛋白,优选出IPTG诱导终浓度为0.5 mmol＆#183;L-1,诱导时间为12h,诱导温度为18℃.结论 成功构建了原核表达重组体质粒pGEX-4T-3-VP2-A、pGEX-4T-3-VP2-B、pGEX-4T-3-VP2-C、pGEX-4T-3-VP2-D,优化出最佳诱导条件,为下一步获得大量纯化的目的蛋白、制备VP2多克隆抗体奠定基础.     

HCK SH3结构域与HIV-1 Nef蛋白体外结合活性的检测

目的构建重组原核表达质粒pGEX-4T-1/SH3,检测原核表达的SH3蛋白的生物学活性。方法利用PCR方法扩增HCK SH3基因,并将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中,构建原核表达质粒pGEX-4T-1/SH3,转化E.coli DH5α,进行双酶切和测序鉴定。筛选阳性质粒,转化至E.coli BL21(DE3)中进行表达,对表达产物进行SDS-PAGE和蛋白质印迹检测,同时纯化SH3蛋白。表达并纯化HIV-1 Nef蛋白,利用GST pull-down方法检测SH3蛋白与Nef蛋白的结合活性。结果成功获得重组质粒pGEX-4T-1/SH3,测序正确,高效表达并纯化了SH3蛋白。GST pull-down实验结果显示SH3与HIV-1 Nef蛋白具有良好的结合活性。结论成功地克隆、表达和纯化了GST-SH3蛋白,SH3与Nef蛋白具有体外特异性结合活性,为进一步研究针对Nef与SH3结合的靶向药物的筛选提供了实验基础。     

类泛素化修饰蛋白SUMO3/GST融合蛋白表达载体的构建及表达

目的:构建pGEX-4T- 1/SUMO3重组表达质粒,并在大肠杆菌中表达和纯化出类泛素化修饰蛋白SUMO3/GST融合蛋白.方法:采用PCR技术利用pcDNA3.1-SUMO3质粒为模板,扩增出SUMO3全长编码序列(312 bp),并将其重组于谷胱甘肽硫转移酶(GST)融合蛋白表达质粒pGEX-4T-1中,酶切、测...     

雄激素受体基因各功能域片段的原核表达与功能鉴定

目的 系统构建雄激素受体(AR)野生型全长和4个功能域截短体的原核表达质粒，Western blot与凝胶迁移(EMSA)实验鉴定各融合蛋白及其功能。方法 基于pGEX-4T-1载体，构建AR全长及各功能域的谷胱甘肽巯基转移酶(GST)融合表达重组质粒。应用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)对重组质粒进行诱导表达，确定各重组蛋白的最佳参数。分别用AR内源性抗体和GST标签抗体进行Western blot鉴定，分析诱导前、诱导后细菌裂解液中的目的蛋白，并利用谷胱甘肽琼脂糖树脂进一步纯化。将纯化后蛋白与病毒荧光探针进行孵育，复合物于非变性凝胶中电泳检测纯化蛋白功能。结果 成功构建了AR全长和3个功能域截短体的原核表达质粒。PCR和双酶切鉴定均显示在各插入片段大小相符处出现阳性条带，且测序结果与NCBI GenBank标准株比对一致。其中，96 ku GST-AR-NTD+DBD与86 ku GST-AR-NTD两个融合蛋白得以成功表达及后续纯化。纯化蛋白可与病毒基因组DNA直接结合。结论 来源同一基因序列的AR截短体重组质粒原核表达条件不同，纯化后的AR蛋白可用于深入了解AR各功能域...     

痢疾杆菌GST-IpaH4.5载体构建及其在大肠杆菌中的表达

目的构建痢疾杆菌GST-IpaH4.5融合蛋白表达质粒,并在大肠杆菌（E.coli）中诱导表达。方法以痢疾杆菌福氏2a 301株全基因组为模板,PCR扩增痢疾杆菌ipaH4.5基因,在ipaH4.5的上游加上BamHⅠ酶切位点,下游加上XholⅠ酶切位点,将ipaH4.5基因定向插入质粒pGEX-4T-1中,构建原核表达质粒pGEX-IpaH4.5并转化E.coliDH5α,筛选阳性重组子,限制性内切酶切鉴定和DNA序列测定,DNA序列正确后提取质粒转化E.coli BL21,筛选阳性转化子,异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定表达结果。结果成功构建IpaH4.5原核表达质粒pGEX-IpaH4.5并表达出大小约86 000Mr的GST-IpaH4.5融合蛋白。结论 GST-IpaH4.5融合表达载体的构建,为进一步纯化IpaH4.5蛋白和研究其在痢疾杆菌致病机制中的作用奠定了基础。     

迁移侵袭抑制蛋白MIIP的GST融合蛋白表达及生物学活性鉴定

目的构建人MIIP蛋白与谷胱甘肽转移酶(GST)重组的融合蛋白原核表达载体并进行表达及生物学活性鉴定。方法 RT-PCR扩增得到人MIIP基因全长编码序列,采用重组DNA技术将其克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,构建获得重组原核表达载体pGEX-4T-1-MIIP,经酶切鉴定及测序验证完全正确后,将其转化至大肠杆菌BL21细胞中,用异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导表达,经纯化获得目的蛋白,用Western blot鉴定所得融合蛋白。结果构建了pGEX-4T-1-MIIP原核表达载体,在大肠杆菌中表达获得了GST-MIIP融合蛋白,经Glutathione Agarose纯化和Western blot检测,证实所得GST-MIIP融合蛋白具有生物学活性。结论成功获得了有生物学活性的GST-MIIP融合蛋白。     

pGEX-5X-1-hLMO4原核质粒构建及重组蛋白表达

目的:构建hLMO4的原核表达载体并诱导、纯化和鉴定其表达。方法:hLMO4全长编码基因经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后,克隆至GST融合表达载体pGEX-5X-1,异丙基β-D硫代半乳糖苷(IPTG)在BL21大肠杆菌中诱导GST-hLMO4融合蛋白表达,利用Glutathione Sepharose 4B纯化诱导的融合蛋白,并经Western blot鉴定结果。结果:hLMO4编码序列克隆至pGEX-5X-1载体中,双酶切鉴定片段大小为500 bp,在E.coli BL21中IPTG诱导融合蛋白的表达,分子质量约为49 000 Da,成功纯化出GST及GST-hLMO4蛋白,Western blot检测到蛋白表达。结论:构建了hLMO4基因原核表达载体,鉴定了GST-hLMO4融合蛋白表达。