成年大鼠肌源性干细胞的培养和鉴定

目的探讨成年大鼠肌源性干细胞分离及纯化方法。方法采用消化法分离肌源性干细胞,然后用密度梯度离心法和差速贴壁法纯化干细胞;结蛋白(desmin)、CD34、CD45、Sca1免疫细胞化学染色对细胞进行鉴定。结果成功培养出高纯度的肌源性干细胞,免疫细胞化学染色结果为desmin( ),CD34( ),CD45(-),Sca1( )。结论可通过体外原代培养获得高纯度肌源性干细胞,为组织工程的临床应用提供种子细胞。     

新生小鼠肌源性干细胞的生物学特性及表型研究

目的通过体外新生小鼠肌源性干细胞(MDSCs)的培养,观察鼠肌源干细胞的生物学特性及表型。方法采用胶原酶Ⅺ和胰蛋白酶分步消化肌肉,后采用差速贴壁分离技术纯化获得MDSCs。用倒置显微镜观察细胞形态,测定生长曲线,分析MDSCs的增殖能力,采用Sca-1、CD34和Desmin免疫细胞化学染色对细胞进行鉴定,初步确定细胞表型。结果经过两步消化和差速贴壁后,成功培养出高纯度的肌源性干细胞,该细胞呈Sca-1、CD34和Desmin阳性。结论可通过体外原代培养获得高纯度的肌源性干细胞,细胞具有良好的增殖能力,是适用于组织工程和基因治疗研究的一种新型种子细胞。     

当归补血汤对体外造血微环境中小鼠肌源性干细胞分化的影响

目的：观察当归补血汤对体外造血微环境中小鼠肌源性干细胞分化的影响。方法：分离小鼠肌源性干细胞并培养鉴定。制备含有不同剂量当归补血汤的大鼠载药血清及对应剂量的骨髓基质细胞条件培养基。将肌源性干细胞随机分为8组：正常大鼠血清组、当归补血汤载药血清1～3组、正常大鼠血清条件培养基组、条件培养基1～3组,免疫组化法检测CD45的表达情况。结果：培养的肌源性干细胞呈desmin染色阳性;培养3天时载药血清3组、条件培养基两组及3组阳性细胞与正常大鼠血清组之间相比CD45表达量有显著性差异;随当归补血汤载药血清浓度增大CD45表达量增多,10倍剂量载药血清作用效果最佳,条件培养基也呈同样的变化趋势,经10倍剂量载药血清干预的条件培养基作用效果显著。结论：当归补血汤载药血清及含载药血清的条件培养基可促进肌源性干细胞向造血细胞方向分化。     

当归补血汤对体外造血微环境中小鼠肌源性干细胞分化的影响

目的:观察当归补血汤对体外造血微环境中小鼠肌源性干细胞分化的影响。方法:分离小鼠肌源性干细胞并培养鉴定。制备含有不同剂量当归补血汤的大鼠载药血清及对应剂量的骨髓基质细胞条件培养基。将肌源性干细胞随机分为8组:正常大鼠血清组、当归补血汤载药血清1～3组、正常大鼠血清条件培养基组、条件培养基1～3组,免疫组化法检测CD45的表达情况。结果:培养的肌源性干细胞呈desmin染色阳性;培养3天时载药血清3组、条件培养基两组及3组阳性细胞与正常大鼠血清组之间相比CD45表达量有显著性差异;随当归补血汤载药血清浓度增大CD45表达量增多,10倍剂量载药血清作用效果最佳,条件培养基也呈同样的变化趋势,经10倍剂量载药血清干预的条件培养基作用效果显著。结论:当归补血汤载药血清及含载药血清的条件培养基可促进肌源性干细胞向造血细胞方向分化。     

人脐带间充质干细胞的体外分离、培养及诱导分化

目的:体外分离、纯化及培养人脐带间充质干细胞(MSCs),并观察其生物学特性.方法:将剔除动静脉的新鲜人脐带组织切成小块培养,得到贴壁细胞,倒置显微镜观察细胞形态,绘制第1、5及10代细胞生长曲线;流式细胞仪测定细胞表面标记(CD13、CD44、CD14、CD34与HLA-DR);化学染色(油红O、茜素红染色)及RT-PCR检测其体外诱导成脂和成骨分化的能力;RT-PCR检测胚胎十细胞特异性标志基因OCT-4.结果:体外培养4～6 d后,有细胞从组织块中游出;细胞传代培养达10代后无明显的形态和增殖能力改变.培养细胞表达CD13与CD44,但CD14、CD34及HLA-DR呈阴性表达.体外诱导实验证实,该细胞具有成脂和成骨分化的能力.RT-PCR显示其表达OCT-4基因.结论:人脐带MSCs能在体外培养、扩增并且具有和骨髓MSCs类似的生物学特性,可作为组织工程种子细胞来源.     

大鼠乳鼠颌下腺成纤维细胞的分离培养及鉴定

探讨大鼠乳鼠颌下腺成纤维细胞体外分离及培养的方法.采用0.125％胰酶多次消化法收集新生SD大鼠乳鼠颌下腺成纤维细胞.高内涵细胞成像法检测细胞增殖能力,免疫荧光、Western blot和RT-PCR法检测波形蛋白表达水平,CD90标记成纤维细胞、鉴定细胞纯度.最新消化分离得到的细胞呈亮球形,轮廓清晰,单个散在或聚集成团分布,90 min后即有大量细胞贴壁,其中部分细胞已开始伸展.5～6 d可形成单层细胞,传代后的细胞呈长纺锤形或多边形.波形蛋白表达呈强阳性.传代3代的细胞培养体系中成纤维细胞约占87％.含5％FBS的DMEM/F12培养基培养24 h即可检测到细胞的大量增殖.胰酶消化法是获得大鼠乳鼠颌下腺成纤维细胞的有效方法.     

人外周血单个核细胞向内皮祖细胞及内皮细胞分化的实验研究

目的 探讨体外分离、培养成人外周血单个核细胞,并将其定向诱导分化为内皮祖细胞及成熟血管内皮细胞的方法.方法 密度梯度离心法提取人外周血单个核细胞,用含有生长因子的内皮培养基将其体外培养、定向诱导分化为内皮祖细胞及成熟血管内皮细胞;分别用流式细胞技术及RT-PCR通过对内皮祖细胞及内皮细胞表面特异性抗原的检测进行细胞鉴定.结果 分离获得的单个核细胞培养7 d后形成梭状的内皮样细胞,部分细胞积聚成团形成克隆集落,流式细胞仪鉴定该细胞表达内皮祖细胞特异性抗原CD34、CD133及VEGFR.继续培养4周后细胞形成典型铺路石样改变,RT-PCR检测有成熟血管内皮细胞特异性基因vWF、eNOS表达.结论 可成功分离人外周血单个核细胞,并可将其定向诱导分化为内皮祖细胞及成熟内皮细胞.     

人脐静脉内皮细胞的培养与鉴定

目的研究人脐静脉内皮细胞的体外培养方法,并进行细胞鉴定。方法胰蛋白酶灌流消化法收集人脐静脉内皮细胞,加入DMEM/F12混合培养基,37℃5%CO2培养箱中培养,观察细胞形态及生长状况,近融合时消化传代培养。采用形态学观察和CD34免疫组化法进行细胞鉴定。结果原代培养的人脐静脉内皮细胞约于24h完全贴壁,4~5d后融合成单层铺路石样结构。CD34染色证实培养的细胞是人脐静脉内皮细胞。结论胰蛋白酶灌流消化法可获得大量连续传代扩增的人脐静脉内皮细胞。     

骨髓源性血管内皮祖细胞的分离培养及鉴定

目的：探索大鼠骨髓源性血管内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPCs）的培养、诱导分化及鉴定方法。力法：取大鼠股骨并冲洗骨髓腔,梯度密度离心法获单个核细胞后内皮细胞培养液培养,通过细胞形态、免疫组化和免疫荧光检测CD34、vWF、CD133、VSF,以及摄取DiL-aeLDL的能力进行鉴定。结果：新分离的骨髓单个核细胞呈圆形,2d后细胞贴壁,呈梭形或纺锤形,7d呈集落或线状排列,10d接近融合,呈鹅卵石样排列;贴壁细胞CD34、ⅧF、vWF、CD133均表达阳性,能摄取Dil-acLDL并结合FITC-Lectin-UEA-1。结论：从大鼠骨髓中分离出EPCs,并初步建立了骨髓溽性EPCs分离培养、诱导分化及鉴定方法。     

新生大鼠肌源性干细胞的原代培养和鉴定

目的 探讨骨骼肌源性干细胞体外培养、鉴定的方法.方法 采用I型胶原酶和胰蛋白酶两步消化法分离大鼠骨骼肌源性干细胞,经差速贴壁法纯化后,培养液中培养.倒置显微镜观察细胞形态,生长曲线分析肌源性干细胞的增殖能力,结蛋白细胞免疫荧光方法鉴定肌源性干细胞.结果 经过两步消化和差速贴壁后, 成功培养出高纯度的肌源性干细胞,细胞免疫荧光结果为desmin( ).结论 通过体外原代培养获得高纯度肌源性干细胞,结蛋白细胞免疫荧光可以对其早期鉴定,为组织工程的临床应用提供种子细胞.     

小分子水凝胶对大鼠骨髓间充质干细胞心肌分化过程中早期分化基因表达的影响

目的：探讨小分子水凝胶对大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）心肌分化过程中早期分化基因Desmin和α-actin的表达影响。方法：流式细胞仪检测鉴定P9MSCs细胞表面标记物,分别应用10μmol／L5-aza（5．aza组）、小分子水凝胶＋5-aza（水凝胶组）对第9代MSCs进行联合诱导24h,诱导4周后,QRT-PCR和Western—blotting法检测Desmin、α—actinmRNA及蛋白的表达。结果：第9代MSCsCD44阳性表达、CD34阴性表达;诱导4周后,5-aza组细胞难以形成球状细胞团,细胞容易脱落,凋亡及死亡细胞较多;水凝胶组细胞死亡少,数量较诱导前增多。细胞之间的分支连接紧密,有聚集生长的趋势,形成球状细胞团块,个别细胞内形成类肌管状结构。5-aza组和水凝胶组心肌早期分化基因Desmin、α-actin均有阳性表达．水凝胶组mRNA及蛋白表达水平均较5-aza组明显增强（P〈0．05）。结论：小分子水凝胶可作为细胞的三维培养支架．有利于MSCs生长,具有促进5-aza诱导的MSCs向心肌样细胞分化的作用。     

人脐血内皮祖细胞体外诱导分化的研究

目的研究从人脐血中诱导分化出内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPCs）,并对此类细胞进行鉴定。方法术中取健康产妇的新鲜脐静脉血,采用淋巴细胞分离液梯度离心法分离出单个核细胞（mononuclear cells,MNCs）,应用添加诱导因子的培养基于体外诱导分化,观察细胞生长状态。培养7d后将贴壁细胞与含Dil-ac-LDL和FITC-UEA-1的培养基进行孵育并于荧光显微镜下观察,流式细胞仪检测培养细胞表面分子CD34及CD133的阳性率,RT-PCR检测培养细胞表达VEGFR-2mRNA。结果体外诱导7d后90%以上贴壁细胞摄取Dil-ac-LDL呈红色荧光和FITC-UEA-1呈绿色荧光双阳性。流式细胞仪检测CD34及CD133阳性细胞分别为（50.48±5.17）%和（19.12±4.37）%。RT-PCR检验培养细胞VEGFR-2mRNA呈阳性。结论采用密度梯度离心法从人脐血中提取MNCs在体外经诱导分化可以形成EPCs。     

35例胃肠道间质瘤临床病理观察及免疫组化分析

目的探讨胃肠道间质瘤的临床病理及免疫组化特点。方法回顾性观察35例胃肠道间质瘤HE染色切片,复习临床病理资料,用免疫组化SP法检测CD117、CD34、Vimentin、SMA、Desmin及S-1006种抗体的表达情况。结果本组GIST均为成年人,年龄25～77岁,平均年龄51岁,其中男性19例,女性16例。发病部位：胃18例（51%）,小肠8例（23%）,大肠3例（9%）,食管1例（3%）,肠系膜3例（9%）大网膜2例（6%）。临床症状以腹部包块、腹部胀痛不适、消化道出血为主。大体上,肿瘤常有出血、坏死、囊性变等继发改变。肿瘤镜下主要由梭形和上皮细胞组成,呈交叉束状、漩涡状、栅栏状、片块状、巢状等多种排列。CD117、CD34、Vimentin、SMA、Desmin及S-100阳性率分别为：97%、83%、100%、37%、3%、26%。良性7例,交界性5例,恶性23例。结论间质瘤多发生于中老年人,胃肠道是其好发部位,细胞形态多变,排列结构多样。CD117、CD34是其特异和敏感抗体,在间质瘤的诊断和鉴别诊断中起重要作用,核分裂象〉5/50HPF、肿瘤坏死、细胞密集是重要的恶性指征。     

CD34~+细胞在原发性骨髓纤维化症和原发性血小板增多症骨髓组织中的表达

目的:探讨CD34+细胞在原发性骨髓纤维化症及原发性血小板增多症骨髓组织中的表达及临床意义。方法:应用免疫组织化学染色法,检测原发性骨髓纤维化症和原发性血小板增多症实验组及对照组骨髓组织中CD34+细胞表达情况。结果:CD34+细胞在实验组骨髓组织中表达高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);CD34+细胞在原发性骨髓纤维化症及原发性血小板增多症骨髓组织中表达的差异无统计学意义(P>0.05)。结论:CD34+细胞在原发性骨髓纤维化症和原发性血小板增多症的发生中有一定关系,CD34+细胞与两者之间的转化无必然联系。     

肾血管平滑肌脂肪瘤中间充质干细胞的分离培养及鉴定

目的明确经典型肾血管平滑肌脂肪瘤组织中是否存在间充质干细胞。方法收集8例肾血管平滑肌脂肪瘤手术切除的标本,剪碎后PBS洗涤,以胶原酶水解,贴壁培养后传代,流式细胞术检测细胞表型,并行体外成骨、成脂肪分化检测。结果从8例肾血管平滑肌脂肪瘤组织中均分离出具有间充质干细胞形态特征的贴壁细胞,该细胞不表达CD14、CD31、CD34、CD45、CD144等造血细胞或内皮细胞表面标志,而表达间充质干细胞表面标志如CD29、CD44、CD73、CD90、CD105等。在体外诱导后具有向骨、脂肪组织分化的能力。结论肾血管平滑肌脂肪瘤组织中存在具有间充质干细胞形态、表型和功能特征的一群细胞,间充质干细胞可能与肾血管平滑肌脂肪瘤的发生具有密切关系。     

胃肠道神经鞘瘤4例临床病理分析及文献复习

目的：探讨胃肠道神经鞘瘤（GSs）临床病理特征、免疫表型、鉴别诊断。方法对4例GSs患者临床资料、病理形态、免疫表型进行观察，结合文献进行讨论分析。结果4例患者，平均年龄（61.3±9.9）岁，女3例，男1例。患者无特殊临床症状和体征。影像学瘤体表现为界清的稍低密度均质实体灶。大体观察肿瘤无包膜，界清，切面呈实性，有光泽感。镜下瘤组织外围均有丰富的淋巴细胞增生形成的淋巴细胞套，梭形瘤细胞呈交叉束状排列，局部区域细胞核呈不显著的栅栏状，局灶可有显著的核异型性，但核分裂罕见。肿瘤边缘局灶区域可见瘤细胞分隔、包裹胃壁平滑肌现象。免疫组化显示4例瘤细胞S-100、Vimentin呈弥漫强阳性，2例GFAP片灶性阳性，Ki-67阳性指数＜3%，Desmin、CD34、CD117、DOG-1均为阴性。术后随访均未见复发或转移。结论 GSs 是胃肠道罕见的间叶源性良性肿瘤，掌握其相对特征性病理学形态结合 S-100、CD117、CD34、DOG-1等标记物检测有助于诊断和鉴别诊断。     

大鼠骨髓内皮祖细胞的分离培养及其生物学特性

目的：探讨大鼠骨髓内皮祖细胞的分离培养方法及其生物学特性。方法：采用二次贴壁法体外扩增培养大鼠骨髓内皮祖细胞,观测细胞增殖能力;免疫化学检测细胞CD133、CD34、Flk1、CD31的表达;三维培养细胞并观察其体外成血管能力。结果：细胞培养第4天集落样生长,呈圆形或梭形;第10天细胞长满瓶底,呈鹅卵石样外观。原代血管内皮祖细胞CD133、CD34、Flk1均表达阳性;第2代细胞CD34、CD31、Flk1均表达阳性,CD133表达阴性。三维培养第2代血管内皮祖细胞在胶原内有＂出芽式＂生长现象及管腔样结构形成。结论：体外扩增法可以从骨髓中分离培养出内皮祖细胞,三维培养发现其具有体外成血管能力。     

97例胃肠道间质瘤的临床病理分析

目的：探讨胃肠道间质瘤（gastrointestinal stromal tumors,GIST）的临床、病理和免疫组织化学特征.方法：收集新疆维吾尔自治区人民医院2010年8月～2013年3月资料完整GIST患者97例的临床、手术及病理资料、免疫组织化学CD117、DOG-1、CD34、SMA、Desmin、S100蛋白及Ki67表达结果,回顾性分析GIST临床与病理的特点及关系.结果：97例间质瘤位于胃71例（73.19％）,小肠17例（17.53％）,结直肠2例（2.06％）,食道1例（1.03％）,其它部位6例（6.19％）.肿瘤最大径0.3～17cm.肿瘤组织由梭形细胞和/或上皮样细胞构成,梭形细胞形态较一致,呈长梭形,胞质丰富,嗜酸性,胞核呈杆状或长梭形.上皮样细胞体积较大,形态不一,呈多角形或卵圆形,胞质空亮或微嗜酸性,核周出现亮区.肿瘤细胞核分裂像≤5个/50 HPF83例,6～10个/50HPF7例,＞10个/50 HPF者7例.免疫组织化学阳性表达率分别为CD117、DOG-1和CD34阳性率分别为96.91％、94.85％和88.66％.SMA、Desmin和S100阳性率分别为38.14％、15.46％和16.49％.Ki67阳性率1～40％.肿瘤危险度分级,极低危险35例,低度危险30例,中度危险15例,高度危险17例.结论：GIST具有独特的临床和病理学特征,CD117和DOG-1对GIST的诊断具有较高的特异性和敏感性,联合CD34、SMA、Desmin、S100同时检测有助于诊断和鉴别诊断;GIST的危险度评估取决于肿瘤的部位、大小和核分裂数的多少.     

食管粘膜下肿瘤的内镜下切除术

目的探讨消化内镜下切除食管粘膜下肿瘤的方法，并依据临床病理及免疫组织化学表型确定其诊断。方法自2003～2007年我们对38例食管粘膜下肿瘤进行了内镜下切除，对位于粘膜肌层的肿瘤进行圈套电切或电铲除的方法切除，对超声胃镜确定位于固有肌层的肿瘤做内镜下粘膜下层剥离术（ESD）切除，并对切下的标本进行临床病理学检查和免疫组织化学分析，通过连续切片进行CD34、CD117、Vimentin、Desmin染色方法观察免疫组织化学表型，术后3个月随访胃镜检查。结果位于粘膜肌层的26例肿瘤，平均直径为15ram（10～35mm），均一次性完整切除，平均手术时间7min（3～31min）；位于固有肌层的12例肿瘤，平均直径为20mm（12～32mm），均一次性完整切除，平均手术时间110min（96～145min），其中1例术后3个月复发，进行第二次ESD手术。免疫组化结果：本组38例CD34为100％阴性，CD117为100％阴性，Vimentin为81．6％阴性；Desmin为100％阳性（＋＋～＋＋＋），均确定为平滑肌瘤。结论消化内镜下可安全有效地进行食管粘膜下肿瘤切除术，包括源于固有肌层的平滑肌瘤。     

G-CSF体外诱导新生小鼠心肌干细胞分化的研究

目的了解新生小鼠心肌干细胞（cardiac stem cells，CSCs）在体外的分化潜能，为重建缺血及坏死心肌的临床应用提供依据。方法采用组织块贴壁法体外培养小鼠CSCs，以免疫磁珠细胞分离（MACS）系统纯化原代细胞。纯化所得细胞分别予4个浓度的粒细胞集落刺激因子（G—CSF）进行诱导，应用流式细胞术（FCM）、免疫荧光染色（IFS）鉴定细胞表刊，RT—PCR检测心肌转录因子GATA-4与心肌结构基因B—MHC的表达。结果由组织块培养所得的原代细胞经FCM、IFS检测证实其部分表达Sca-1和CD45。采用MACS成功得到高纯度的细胞，行FCM、IFS鉴定其表型为Sca-1＋／CD45-，RT—PCR检测显示其表达GATA-4，不表达β-MHC。纯化的细胞予诱导后培养3周，整个培养过程未见单个或成团细胞的自发搏动。诱导后3周各组细胞再次经FCM检测见Sca-1的表达均比诱导前减弱，RT—PCR检测见诱导后的细胞仍然不表达B—MHC。结论应用MACS后成功得到高纯度的表型为Sca-1＋／CD45-的CSCs；CSCs Sca-1的表达量可能随培养时间的延长而下降；G—CSF未能将CSCs诱导分化为心肌细胞。