核转染增强型绿荧光蛋白对兔原代骨髓基质细胞向神经细胞方向分化的影响

目的研究以最近发展起来的核转染技术转染增强型绿荧光蛋白（EGFP）质粒进行基因修饰对兔原代骨髓基质细胞向神经细胞方向分化的影响。方法从兔股骨抽取骨髓，密度梯度离心法获取原代骨髓基质细胞。以Nucleofector^TM技术转染pEGFP—C2（EGFP组），以同期培养未转染的细胞作为对照组（control组）。以“CYTOKINE·神经干细胞培养基”＋10％胎牛血清诱导BMSCs向神经细胞方向分化。流式细胞仪检测转染效率。比较两组细胞的生长增殖以及Nestin、NSE、GFAP抗原的表达情况。结果在转染后24h成功发现EGFP的表达。两组细胞具有相似的形态学变化以及生长曲线。诱导18d，两组细胞NSE、GFAP的表达比例无统计学意义。结论Nucleofector^TM技术是一种简易而高效的转染兔原代骨髓基质细胞的方法；EGFP可以作为兔骨髓基质细胞有效的基因表达标记；核转染pEGFP-C2对兔原代骨髓基质细胞体外增殖及向神经细胞方向分化无明显影响。     

外源EGFP和hTH基因在恒河猴骨髓源神经干细胞内的稳定表达

目的构建携带人酪氨酸羟化酶(hTH)的荧光真核表达质粒-pEGFP-C2-hTH,转染骨髓基质细胞源神经干细胞(BMSCs-D-NSCs),观察外源EGFP和hTH基因在BMSCs-D-NSCs中的表达情况。方法应用基因重组技术,将pWAV2-TH中的TH目的基因亚克隆到荧光真核表达载体 pEGFP-C2,以酶切和测序鉴定重组质粒pEGFP-C2-hTH的正确性:pEGFP-C2-hTH经NucleofectorTM 核转染仪转染培养的恒河猴BMSCs-D-NSCs,24 h后观察绿色荧光蛋白的瞬时表达情况,10 d后行 TH单克隆抗体的免疫组化和TH基因的RT-PCR。结果 (1)酶切、PCR和DNA序列鉴定均证实插入片段的正确性;(2)细胞转染24 h后,荧光显微镜下可观察到绿色荧光蛋白(GFP)的表达,观察到 80％的转染细胞发出绿色荧光;转染10 d后细胞的RT-PCR检测到hTH基因的表达,TH单克隆抗体免疫组化结果显示转染细胞呈阳性染色,同时在荧光显微镜下观察到绿色荧光。结论构建的 hTH荧光真核表达重组质粒pEGFP-C2-hTH,经电转染方法转染至BMSCs-D-NSCs内,成功表达hTH 和EGFP,为BMSCs-D-NSCs基因治疗提供了实验基础。     

重组质粒pcDNA3.1 his-hTH与pEGFP-C2共转染骨髓基质细胞源神经干细胞的实验研究

目的 构建携带人酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase，TH)目的基因片段的真核表达重组质粒-pcDNA3．1his-hTH，与pEGFP-C2共转染恒河猴骨髓源神经干细胞，观察hTH基因在骨髓源神经干细胞中的表达情况。方法 应用基因重组技术，将pWAV2-TH中TH基因亚克隆到pcDNA3．1his真核表达载体，以酶切和测序方法鉴定重组质粒pcDNA3．1his-hTH的正确性；将pcDNA3．1his-hTH和pEGFP-C2经电击穿孔法共转染恒河猴骨髓源神经干细胞，24h后观察EGFP瞬时表达情况，10d后进行hTH基因RT-PCR，以及hTH和6His单克隆抗体的免疫组化检测。结果 (1)酶切和测序结果均证实pcDNA3．1his-hTH的正确性；(2)细胞转染24h后，荧光显微镜下可观察到EGFP的表达，80％以上细胞发出绿色荧光；10d后RT-PCR检测到细胞内有hTH基因的表达，免疫组化结果显示细胞有hTH和6His抗原表达。结论 成功构建的pcDNA3．1．his-hTH和pEGFP-C2能够共转染恒河猴骨髓源神经干细胞，hTH、EGFP和6His基因在细胞内有效表达。该系统可以作为体外检测转染率、细胞移植治疗帕金森病活体跟踪移植细胞的技术平台。     

大鼠骨髓基质细胞生物学特性研究

目的 观察大鼠骨髓基质细胞的生物学特性。方法 取SD大鼠骨髓，分离培养骨髓基质细胞，相差显微镜下观察其形态，传代后MTT法绘制其生长曲线。结果 原代培养20天后可分离得到骨髓基质细胞，典型的骨髓基质细胞可分为两个类型，传代后2小时贴壁率达70％以上。结论 骨髓基质细胞具有多态性和贴壁生长特性,通过贴壁培养方法能够较容易地对其进行分离扩增，可作为多种疾病细胞治疗和基因治疗的载体。     

重组小鼠pEGFP-GDNF质粒的构建及其在骨髓基质干细胞中的表达

目的 克隆小鼠胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)并转染骨髓基质于细胞，制备转基因工程细胞。方法 应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法从新生小鼠大脑皮层细胞克隆出GDNFcDNA片断，以pEGFP-C1质粒为载体导入骨髓基质于细胞，用流式细胞仪检测转染率，用荧光显微镜和免疫细胞化学方法检测蛋白质的表达。结果 流式细胞仪检测转染率约50％，荧光显微镜下见转染pEGFP／GDNF质粒的骨髓基质干细胞(MSC)发出明亮的绿色荧光，免疫细胞化学方法检测发现转基因MSC抗GDNF蛋白染色成强阳性，正常MSC染色成阴性。结论 成功制备了高效表达外源性基因GDNF的MSC。绿色荧光蛋白作为报告基因可反应GDNF表达情况。     

生长分化因子5真核表达质粒转染小鼠骨髓基质干细胞体外诱导向软骨细胞分化

背景：生长分化因子5是软骨与骨组织形成、发育的重要调解因子,在诱导软骨形成,促进骨、软骨、肌健韧带损伤修复方面发挥重要作用。 目的：小鼠骨髓基质干细胞体外转染真核表达质粒pcDNA 3.1(+)/生长分化因子5,检测与软骨形成分化相关的细胞外基质及蛋白多糖的表达。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2008-03/12在武汉协和医院中心实验室完成。 材料：雄性昆明种小鼠20只,由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。生长分化因子5真核表达质粒pcDNA 3.1(+)/生长分化因子5为自备。 方法：全骨髓贴壁法体外分离培养小鼠骨髓基质干细胞,取传至第3代细胞接种到6孔板,在细胞生长到90%融合时开始转染。设立3组：转染组采用LipofectamineTM2000进行脂质体介导pcDNA3.1(+)/生长分化因子5重组质粒瞬时转染;空质粒组转染空质粒pcDNA 3.1(+);空白对照组只加入等量脂质体,其余步骤相同。 主要观察指标：转染后72 h通过RT-PCR及免疫细胞化学检测生长分化因子5基因与蛋白的表达鉴定转染是否成功,同法检测软骨基质Ⅱ型胶原的表达,转染后14 d阿尔辛蓝染色检测蛋白聚糖的表达。 结果：转染组有一大小为219 bp的特异性扩增条带,骨髓基质干细胞胞浆内呈棕色阳性染色;而空质粒组、空白对照组均未发生生长分化因子5基因转录,无特异性扩增条带,且细胞胞浆未见明显染色。转染组可检测到Ⅱ型胶原基因的表达,基因大小225 bp,Ⅱ型胶原细胞胞浆中可见棕黄色染色;空质粒组、空白对照组均未检测到Ⅱ型胶原基因的表达,SP染色均无明显染色。阿尔辛蓝染色后转染组细胞呈蓝染,空质粒组、空白对照组均未见明显异染性着色。 结论：pcDNA3.1(+)/生长分化因子5转染骨髓基质干细胞能显著增加Ⅱ型胶原及蛋白聚糖的表达,促进骨髓基质干细胞向软骨细胞方向分化。     

pcDNA3.1-成骨生长肽真核表达载体在骨髓基质干细胞中的表达**

背景：成骨生长肽具有明显的促进成骨细胞增殖、分化、成熟的作用。 目的：观察成骨生长肽基因转染兔骨髓基质干细胞后的表达及表达产物对骨髓基质干细胞向成骨细胞分化的影响。 方法：构建重组真核表达载体pcDNA3.1-成骨生长肽,并在脂质体介导下,将其导入兔骨髓基质干细胞。通过G418筛选获得阳性克隆。RT-PCR方法检测成骨生长肽基因在骨髓基质干细胞内的表达,并观察转染pcDNA3.1-成骨生长肽后骨髓基质干细胞向成骨细胞分化的情况。 结果与结论：实验成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-成骨生长肽,转染pcDNA3.1-成骨生长肽的骨髓基质干细胞可见成骨生长肽mRNA的表达,同时羟脯氨酸的分泌水平增加,碱性磷酸酶活性增高。证实经pcDNA3.1-成骨生长肽转染的兔骨髓基质干细胞不仅可以表达成骨生长肽,而且具有向成骨细胞分化的特性。     

构建外源性重组pcDNA3.1-hBMP-7真核表达载体转染兔骨髓基质干细胞

背景：在细胞获取、培养、移植等体外环境体系下,骨髓基质干细胞能否有效的应用于局部基因治疗尚不清楚。 目的：课题创新性提出构建外源性hBMP-7基因真核表达载体,并期望可提高被转染的兔骨髓基质干细胞诱导成骨能力。 设计、时间及地点：细胞-基因学体外观察,于2006-07/2007-07在哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心完成。 材料：人健康新鲜胎盘组织由哈尔滨医科大学附属二院妇产科提供,产妇知情同意。健康雄性新西兰大耳白兔1只,由哈尔滨医科大学动物中心提供。 方法：从人胎盘组织中克隆出hBMP-7基因,与真核表达载体pcDNA3.1连接,构建重组pcDNA3.1-hBMP-7真核表达载体。从兔骨髓中分离培养骨髓基质干细胞,分为3组：pcDNA3.1-hBMP-7转染组、空载体pcDNA3.1转染组、未转染组。转染前1 d取第2代骨髓基质干细胞5×106个,接种到60 mm3含无抗生素培养基的培养皿中进行转染。 主要观察指标：使用RT-PCR、免疫组织化学等方法检测hBMP-7在骨髓基质干细胞中的表达,检测各组细胞碱性磷酸酶、胶原、骨钙蛋白的合成情况。 结果：转染72 h后,pcDNA3.1-hBMP-7转染组于1.3 kb处出现特异性条带,细胞胞浆有棕色的颗粒出现,另2组均呈阴性。pcDNA3.1-hBMP-7转染组骨髓基质干细胞碱性磷酸酶活性于转染后第2天显著增高,第8天达峰值,各时间点pcDNA3.1-hBMP-7转染组骨髓基质干细胞碱性磷酸酶活性、羟脯氨酸合成量、骨钙蛋白含量均明显高于其他2组(P < 0.05或0.01)。 结论：实验成功构建了pcDNA3.1-hBMP-7真核表达载体。结局证明了外源性hBMP-7基因可在兔骨髓基质干细胞中充分、高效表达,并且这种外源性hBMP-7基因具备促进兔骨髓基质干细胞向成骨细胞转化的能力。     

重组腺病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因转染兔骨髓间充质干细胞

背景：目前仍没有合适的标记方法追踪观察兔骨髓间充质干细胞组织修复及基因治疗的效果。 目的：观察重组腺病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因在兔骨髓间充质干细胞中的表达,及转染后干细胞活性的变化,以寻找稳定标记兔骨髓间充质干细胞的方法。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2008-03/05在南京市第一医院骨科干细胞实验室完成。 材料：健康2月龄纯种新西兰大白兔4只,由南京医科大学实验动物基地提供。重组腺病毒Ad5/F35-EGFP为北京本元正阳基因有限公司产品。 方法：用密度梯度离心法分离纯化兔骨髓间充质干细胞,贴壁法纯化扩增。取传至第4代细胞,流式细胞仪检测细胞标志的表达,消化离心重悬后进行计数,平均分成5组,每组细胞数5.0×105个,接种于25 m2培养瓶,空白组加入50 μL的PBS液,剩余4组加入重组腺病毒Ad5/F35-EGFP进行转染,感染复数(MOI)分别为10,20,50,100,继续传代培养。 主要观察指标：骨髓间充质干细胞的生长状态及表面标志鉴定,转染后骨髓间充质干细胞增强型绿色荧光蛋白的表达及活性变化。 结果：原代培养48 h后见细胞贴壁,8 d时细胞铺满瓶底80%以上,绝大多数呈梭形,传代后细胞增殖速度加快,三四天即可传代,第4代细胞CD29和CD44呈阳性表达,CD34与CD45呈阴性表达。转染后24 h可见绿色荧光,7 d时荧光最强,细胞转染率与感染复数值的呈线性增长关系,至49 d时仍可见绿色荧光。转染后0,7,14,28,49 d,感染复数=50组的骨髓间充质干细胞数量均与空白组基本相似(P均> 0.05),即转染后细胞增殖能力无明显变化。 结论：重组腺病毒载体能高效标记骨髓间充质干细胞,感染复数为50时较为理想,增强型绿色荧光蛋白基因可持续表达49 d,且标记后不影响骨髓间充质干细胞的增殖活性。     

重组pcDNA3.1-hBMP-2转染兔脂肪干细胞体外诱导的成骨分化

背景：骨形态发生蛋白2具有很强的诱导干细胞成骨活性。 目的：构建人骨形态发生蛋白2基因真核表达载体,探讨其转染脂肪干细胞后的成骨效果。 方法：通过噬菌斑原位杂交筛选人混合细胞cDNA文库获得人骨形态发生蛋白2基因,与真核表达载体pcDNA3.1-连接,构建重组质粒pcDNA3.1-hBMP-2。利用脂质体Lipofectamine™ 2000分别介导人骨形态发生蛋白2 基因、EGFP基因转染第4代脂肪干细胞,并经G418进行筛选。 结果与结论：酶切鉴定及DNA测序结果证实重组质粒pcDNA3.1-hBMP-2构建成功。经计算脂质体介导的脂肪干细胞瞬时转染率为(18.0±0.42)%,并经过G418筛选后获得了稳定转染的细胞。细胞生长曲线表明转染后对脂肪干细胞生长、增殖无明显影响。ELISA检测发现人骨形态发生蛋白2组的人骨形态发生蛋白2因子表达量均高于EGFP组及未转染组,且能够稳定表达。经人骨形态发生蛋白2基因转染的脂肪干细胞的Ⅰ型胶原含量、碱性磷酸酶活性以及钙结节数目均比EGFP组及未转染组有明显升高。     

人β-NGF及BDNF基因共转染对大鼠骨髓基质细胞分化的影响

目的 探讨人β-神经生长因子(β-NGF)和脑源性神经营养因子(BDNF)基因共转染对大鼠骨髓基质细胞(BMSCs)分化的影响. 方法 梯度离心法分离培养大鼠胫股骨骨髓中BMSCs,用Src癌基因同源区3抗体(SH3)的免疫细胞化学染色鉴定BMSCs.按照3μL脂质体/1μg(3 μL)pSVCEP NGF/BDNF-CAT质粒的比例共转染第一代BMSCs,并转染pEGFP-C1质粒作为转染的标记.BMSCs培养4周后,荧光显微镜观察增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的表达并计算转染率,细胞免疫荧光染色后用激光扫描共聚焦显微镜观察表达产物以及BMSCs分化情况. 结果 体外培养能够获得纯化的原代和传代BMSCs,传代后仍然保持增殖和分化功能;免疫组化SH3染色阳性证实为纯化的BMSCs.人β-NGF/BDNF基因共转染BMSCs后,BMSCs能够稳定和持续表达NGF和BDNF;BMSCs也能表达Nestin、NSE、NF-M和GFAP. 结论 经脂质体介导的外源性目的 基因NGF/BDNF cDNA均能分别和共同在BMSCs中成功表达,基因转染后的BMSCs能诱导分化为神经前体细胞或神经样细胞.     

外源性EGFP和TH基因修饰骨髓基质细胞源神经干细胞帕金森病猴模型脑内移植后的跟踪观察

目的评价外源性酪氨酸羟化酶(TH)和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因修饰的骨髓基质细胞源神经干细胞(BMSCs-D-NSCs)在猴帕金森病(PD)模型脑内移植后长期存活情况及其功能评定。方法应用MPTP制成偏侧PD猴模型。将构建的pEGFP-hTH转染培养的自体BMSCs- D-NSCs,而后植入PD猴模型脑内,观察其行为学变化,并进行单光子发射计算机体层摄影术(多巴胺转运蛋白显像)和正电子发射计算机体层摄影术(葡萄精代谢显像)检查。用免疫组化法检测移植细胞的存活情况。结果成功构建pEGFP-hTH和pEGFP-C2转染的BMSCs-D-NSCs中TH和EGFP基因均有效表达;细胞移植后5个月PD猴症状仍有所改善。多巴胺转运蛋白显像见细胞移植组术侧纹状体平均标准摄取值低于对侧及健康猴,而高于PD猴术侧。葡萄糖代谢显像见细胞移植组术侧纹状体平均标准摄取值低于对侧及健康猴,而高于PD猴术侧,而细胞移植组间明显差异。免疫组化发现, 细胞移植术后5个月移植区仍存存大量TH、EGFP阳性细胞。结论 pEGFP-hTH和pEGFP-C2转染的BMSCs-D-NSCs存体外和体内均长期表达外源性TH、EGFP基因,基因工程细胞在PD猴脑内存活并发挥治疗作用。     

脊髓小脑性共济失调3型真核表达载体的构建及在PC12中的表达

目的构建以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)作为报告基因、带有脊髓小脑性共济失调3型(SCA3)基因的真核细胞表达载体,并转染PC12细胞,观察外源基因的表达情况。方法将含有正常和突变SCA3基因的pcD-NA3．0-ataxin3Q28(基因内CAG重复28次)、pcDNA3．0-ataxin3Q84(基因内CAG重复84次)双酶切,水解片段插入pEGFP-C1,测序鉴定后脂质体转染法转染PC12细胞并优化转染条件,荧光显微镜观察EGFP的表达,Western印迹检测目的蛋白ataxin3的表达。结果真核表达载体pEGFPC1-ataxin3Q28、pEGFPC1-ataxin3Q84得以成功构建,EGFP及目的基因产物ataxin3Q28、ataxin3Q84顺利地在PC12细胞中表达,由此建立了SCA3的真核细胞表达模型。结论构建SCA3的真核表达载体并建立其细胞模型,对研究SCA3的发病机制有重要意义。     

软骨源形态发生蛋白基因转染自体骨髓间充质细胞修复关节软骨缺损

背景：以支架或干细胞在一定程度上能够修复软骨缺损,但是研究中发现较大块的缺损修复效果还达不到令人满意的程度。基因转染后的干细胞能够不断的释放生长因子有可能够为软骨缺损研究带来突破。 目的：进一步验证软骨源形态发生蛋白转染的骨髓间充质干细胞是否会促进体内兔软骨修复。 方法：从兔骨髓内分离获得骨髓间充质干细胞,脂质体感染的方法将软骨源形态发生蛋白基因转染到骨髓间充质干细胞中。实验组移植转染后的细胞;单纯骨髓间充质干细胞组移植未转染的骨髓间充质干细胞;空白对照组缺损区不移植细胞。术后行组织学检测及组织学评分分析修复情况。 结果与结论：体内修复过程中,软骨源形态发生蛋白转染的骨髓间充质干细胞促进了软骨再生。透明软骨填充了软骨缺损区,并且深部区域显示了软骨下成骨。透明软骨的重建区域优于单纯骨髓间充质干细胞移植组。组织学评分实验组高于骨髓间充质干细胞对照组和空白组。提示转染软骨源形态发生蛋白基因的骨髓间充质干细胞能够促进和提高关节软骨的改建和修复。     

慢病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因修饰人骨髓基质细胞***☆

背景：原代细胞的转染效率低下一直是制约其发展的主要因素之一,慢病毒转染以其独特的优势成为各种干细胞基因修饰良好的转染方法。 目的：验证慢病毒载体介导增强型绿色荧光蛋白基因修饰人骨髓基质细胞的可行性。 方法：将携带增强型绿色荧光蛋白基因的慢病毒在含血清或无血清条件下按不同的MOI值分别转染人骨髓基质细胞,长期观察荧光蛋白表达情况。将经修饰的细胞通过立体定向移植入大鼠纹状体内,观察移植细胞的存活及目的基因的表达情况。 结果与结论：基因转染48 h后,可见人骨髓基质细胞成功表达绿色荧光蛋白,无血清条件下的转染效率高于含血清条件下的转染效率,转染成功的细胞在体外持续培养2个月以上未见明显的荧光消减。转染后的细胞可在大鼠纹状体存活并持续表达绿色荧光蛋白2个月以上。提示慢病毒是一种高效的转染人骨髓基质细胞的载体,慢病毒载体介导增强型绿色荧光蛋白基因转染可以作为人骨髓基质细胞的示踪标志用于体内移植研究。     

pIRES2-AcGFP1-CD真核表达载体构建及其在骨髓间充质干细胞中的表达☆○

背景：骨髓间充质干细胞在体外易分离和扩增，还易于外源基因的转入及表达，在人类医学上被认为是一种理想的治疗性细胞和基因治疗中的靶细胞。 目的：探讨脂质体介导胞嘧啶脱氨酶基因转染兔骨髓间充质干细胞及其基因的表达。 设计：单一样本观察。 单位：大连市干细胞与组织工程研发中心，大连医科大学基础医学院生化室。 材料：实验于2006-03/2007-06在大连市干细胞与组织工程研发中心及大连医科大学基础医学院生化室完成。新西兰大白耳兔，5月龄，雌雄不拘，体质量2.0~2.5 kg。 方法：以大肠杆菌JM109基因组DNA为模板，用PCR方法获得目的基因片段，定向克隆至载体pMD19-T，限制性内切酶消化鉴定、基因测序后，构建pIRES2-AcGFP1-CD真核表达质粒。同时对兔骨髓间充质干细胞取材、培养、鉴定。真核表达质粒经酶切鉴定后，采用Lipofectamine 2000介导法转染经过鉴定的兔骨髓间充质干细胞。并于转染后24 h 在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达。 主要观察指标：表达载体的构建及基因转染骨髓间充质干细胞鉴定。 结果：实验克隆出胞嘧啶脱氨酶基因，并将其与带荧光的真核表达载体pIRES2-AcGFP1连接。经转染兔骨髓间充质干细胞24 h 后，在倒置荧光显微镜488 nm 蓝光激发下观察，pIRES2-AcGFP1-CD组和pIRES2-AcGFP1空载体组均可见细胞发出绿色荧光，未经转染的细胞未见发出绿色荧光，说明胞嘧啶脱氨酶基因成功转染了骨髓间充质干细胞。 结论：骨髓间充质干细胞有望成为胞嘧啶脱氨酶基因治疗中的理想载体。     

菲立磁标记兔BMSCs自体移植脊髓后的核磁共振活体示踪及形态学研究

目的通过观察菲立磁标记兔骨髓源性神经干细胞(BMSCs)自体移植脊髓后的核磁共振活体示踪及形态,期待找到一种应用非侵袭性方法来识别、跟踪BMSCs的存活状态及与宿主组织整合情况的方法。方法无菌条件下股骨取骨髓,梯度密度离心法分离获取兔骨髓基质细胞;使用“Feridex-多聚赖氨酸复合物(FE-PLL)”标记骨髓基质细胞,采用普鲁士兰染色和台盼蓝排除实验等方法鉴定FE-PLL标记兔骨髓基质细胞的效率和细胞的活力;体外标记的细胞自体脊髓移植,磁共振、免疫组织化学染色和透射电镜检查。结果普鲁士蓝染色显示FE-PLL标记骨髓基质细胞胞质内出现细小的蓝色铁颗粒;与正常未标记的细胞相比较,FE-PLL标记对骨髓基质细胞的活力、增殖和分化等能力没有明显的影响;经菲立磁标记的兔BMSCs自体脊髓移植后,可在核磁共振上活体示踪。结论菲立磁与核磁共振联合可无创性活体标记检测移植的神经干细胞基本的存在部位、存在方式及其一些生物学特性,可以用来活体示踪移植的BMSCs。     

富血小板血浆诱导兔骨髓基质干细胞向成骨细胞的分化

背景：对于骨髓基质干细胞向成骨细胞的定向诱导分化,目前大多存在诱导物价格昂贵、制备困难或细胞培养周期长、成骨能力低等缺点,近年研究发现浓缩血小板中存在的生长因子有诱导骨再生的作用。 目的：观察富血小板血浆对体外培养兔骨髓基质干细胞的增殖和成骨细胞分化作用。 方法：从8只兔双侧股骨大转子抽取骨髓,体外分离培养兔骨髓基质干细胞,传至第3代分为两组,实验组用含1%富血小板血浆的DMEM进行干预,对照组加入普通DMEM条件培养液。 结果与结论：倒置显微镜下,原代培养细胞24~36 h后开始贴壁,10~12 d细胞融合成单层。实验组细胞培养第2天已贴壁,第6天细胞大部分融合;对照组细胞形态学变化较实验组晚出现1~3 d。培养第2,6,10,14天,碱性磷酸酶活性测定和茜素红钙结节染色结果显示,体外培养的兔成骨细胞生长良好,生化指标稳定,表现出与典型的成骨细胞相似的形态特征和生物学特性,证实富血小板血浆能促进体外培养的兔骨髓基质干细胞增殖,并能促使其向成骨细胞分化。