牙髓炎模型大鼠血清褪黑素水平及其对牙髓炎症反应的抑制作用

目的：探讨牙髓炎大鼠血清褪黑素水平对核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3/含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1（NLRP3/caspase-1）信号通路的影响,阐明褪黑素对牙髓炎的作用机制。方法：将130只大鼠随机分为对照组（n=40）、牙髓炎组（n=60）和牙髓炎+褪黑素组（n=30）,其中30只牙髓炎大鼠随机分为牙髓炎1 d组、牙髓炎3 d组和牙髓炎5 d组,采用开髓暴露法建立牙髓炎大鼠模型,牙髓炎+褪黑素组大鼠开髓术后腹腔注射褪黑素。HE染色确定各组大鼠牙髓炎建模情况,ELISA法检测各组大鼠血清白细胞介素1β（IL-1β）和褪黑素水平以及牙髓组织中IL-1β水平,RT-PCR法检测各组大鼠牙髓组织中NLRP3和caspase-1 mRNA表达水平,Western blotting法检测各组大鼠牙髓组织中NLRP3和caspase-1蛋白表达水平。结果：HE染色,对照组大鼠牙髓组织正常,牙髓炎组大鼠牙髓有脓腔形成,可见大量炎性细胞聚集。牙髓炎1 d和3 d组大鼠血清IL-1β水平明显高于对照组（P<0.05）,褪黑素水平明显低于对照组（P<0.05）;牙髓炎3 d组大鼠血清IL-1β水平明显低于牙髓炎1 d组（P<0.05）,褪黑素水平明显高于牙髓炎1 d组（P<0.05）;牙髓炎组和牙髓炎+褪黑素组大鼠牙髓组织中IL-1β水平明显高于对照组（P<0.05）,且牙髓炎+褪黑素组大鼠牙髓组织中IL-1β水平明显低于牙髓炎组（P<0.05）;牙髓炎组和牙髓炎+褪黑素组大鼠牙髓组织中NLRP3和caspase-1mRNA和蛋白表达水平均明显高于对照组（P<0.05）,且牙髓炎+褪黑素组大鼠牙髓组织中NLRP3和caspase-1mRNA和蛋白水平明显低于牙髓炎组（P<0.05）。结论：牙髓炎大鼠血清褪黑素水平降低,褪黑素可通过抑制NLRP3/caspase-1信号通路降低牙髓炎大鼠牙髓组织的炎症反应。     

血管紧张素转化酶2参与臭氧暴露导致的小鼠肺部炎症及气道重塑

目的 研究血管紧张素转换酶2（ACE2）在臭氧暴露致小鼠肺部炎症及气道重塑中的作用。方法 16只野生型（WT）C57BL/6J小鼠和16只ACE2 敲除（KO）小鼠分别暴露于空气和臭氧（0.8 ppm）中,每天暴露3 h,连续暴露5 d。分别设置AirWT组,Air KO组,Ozone WT组和Ozone KO组。Masson染色观察小鼠肺组织胶原沉积情况,HE染色观察小鼠肺部病理学改变,并进行评分;收集小鼠支气管肺泡灌洗液（BALF）,并进行细胞计数;分别采用BCA法和酶联免疫吸附法（ELISA）测定BALF总蛋白和细胞因子浓度;荧光定量PCR检测肺组织中气道重塑相关指标的mRNA表达;小鼠的气道阻力采用小动物呼吸机测量（乙酰甲胆碱激发）。结果 臭氧暴露ACE2 KO小鼠肺组织炎症病理学变化总分显著高于臭氧暴露WT小鼠（P<0.05）。Masson染色结果显示,臭氧暴露小鼠肺组织支气管和肺泡周围有大量的胶原沉积,臭氧暴露ACE2 KO小鼠肺组织的支气管和肺泡的胶原沉积阳性区域面积为（19.62±3.16）%、（21.63±3.78）%,高于臭氧暴露 WT 小鼠肺组织的（6.49±1.34）%、（4.44± 0.99）%,两者差异具有统计学意义（P<0.05）。臭氧暴露ACE2 KO小鼠BALF中总细胞数与总蛋白含量均高于臭氧暴露WT小 鼠,差异无统计学意义（P>0.05）。臭氧暴露ACE2 KO小鼠BALF中IL-6、IL-1β、TNF-α、趋化因子（C-X-C基序）配体1（CXCL1/KC）和单核细胞趋化蛋白（MCP-1）水平均高于臭氧暴露WT小鼠,其中IL-1β水平的变化差异具有统计学意义（P<0.05）。臭氧暴露 ACE2 KO 小鼠的肺组织中的基质金属蛋白酶 9（MMP-9）、MMP-13、金属蛋白酶组织抑制剂（TIMP4）、Ⅰ型胶原α1 （COL1A1）、TGF-β的mRNA水平均明显高于WT组小鼠,两组的MMP-9、TIMP4、COL1A1、TGF-β的mRNA水平差异具有统计学意义（P<0.01）。两组小鼠在0、10、25、100 mg/mL的乙酰甲胆碱浓度下的气道阻力的差异无统计学意义（P>0.05）。结论 ACE2参与臭氧暴露导致的小鼠肺部炎症及气道重塑。     

幽门螺杆菌感染的C57BL/6 CD177基因敲除小鼠模型建立

目的建立幽门螺杆菌（Helicobacter pylori, Hp）感染的C57BL/6 CD177基因敲除（CD177 gene knock-out, CD177 KO）小鼠模型,为进一步进行相关研究奠定基础。方法屏障环境中饲养的无特定病原生物（specific pathogen free, SPF）C57BL/6野生型（wild type, WT）小鼠及CD177基因敲除小鼠各22只,雌雄各半,野生型及CD177基因敲除小鼠各自随机分成2组: 野生型小鼠Hp悉尼菌株（SS1）灌胃组（HpSS1 WT组）10只、野生型小鼠Hp49503株灌胃组（Hp49503 WT组）10只、CD177基因敲除小鼠Hp悉尼株灌胃组（HpSS1 KO组）10只、CD177基因敲除小鼠Hp49503株灌胃组（Hp49503 KO组）10只,另设WT及KO空白对照各1组,各自相应对照组小鼠每组随机各2只,共6组。每组小鼠均禁食12 h后按HpSS1组和Hp49503分组分别予各自菌株的菌液予灌胃。灌胃2周后颈椎脱臼法处死小鼠,取小鼠胃黏膜组织,分别行快速尿素酶实验、病理切片常规H-E染色及特殊组化Warthin-Starry银染色,观察Hp在小鼠胃腔内定植,胃黏膜炎症细胞构成及炎症变化等病理组织学变化情况。结果无论HpSS1株还是Hp49503株在C57BL/6 WT及CD177KO小鼠胃窦隐窝可观察到细菌定植,胃黏膜及胃黏膜下层可见炎症细胞浸润。结论成功建立了Hp感染诱发C57BL/6 CD177KO小鼠胃炎模型。     

Limk1在FMR1基因敲除小鼠脑组织的表达及意义

目的：通过免疫组化方法观察LIM-kinase 1（Limk1）在不同年龄组的FMR1基因敲除鼠（FMR1 knockout mouse,KO）和野生鼠（wild type mouse,WT）脑组织不同部位的表达差异.方法：取FVB品系新生和生后2、6周KO鼠（KO0d、KO2周和KO6周）,并分别与同龄WT鼠作对照.每组6只通过免疫组化染色,观察Limk1在不同年龄组的KO和WT小鼠脑组织各部位的表达差异.结果：Limk1在新生鼠的海马、皮层、丘脑、小脑表达丰富,以染色阳性纤维为主,染色阳性细胞少见.生后2周、6周小鼠的大脑皮质和海马仅见少量散在弱阳性细胞表达,但在丘脑未定带、腹后外侧核,小脑蒲肯野细胞和脑干前庭蜗神经核可见强阳性细胞表达.各年龄组KO与WT小鼠Limk1在脑区的分布特点基本一致.KO0d、KO2周及KO6周组小脑、蜗神经核Limk1强阳性表达脑区的平均光密度值以及KO2W及KO6W组丘脑部位的阳性细胞计数均高于同龄WT组,差异有统计学意义（P＜0.05）.结论：Limk1在KO与WT小鼠脑组织的表达均有着明显的时空特异性,FMRP能负性调控Limk1表达.     

P2Y12敲除在LPS诱导的急性肺炎肺损伤中的保护作用

目的研究G蛋白偶联P2Y受体12（P2Y12）敲除对脂多糖（LPS）诱导的急性肺炎肺损伤的保护作用。方法选取野生型（WT）小鼠（WT组）和P2Y12敲除（P2Y12 KO）小鼠（P2Y12 KO组）,通过LPS注射建立小鼠急性肺炎模型,比较2组小鼠经LPS处理0～7 d后的生存率。收集2组小鼠支气管肺泡灌洗液（BALF）和肺组织,采用生化分析仪和BCA法检测BALF中性粒细胞数量和蛋白含量,采用HE染色和ELISA法检测2组小鼠肺损伤情况和肺组织炎症因子[肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-6、IL-10、巨噬细胞炎性蛋白1Β（MIP1B）]的表达。结果与WT组相比,P2Y12 KO组小鼠经LPS处理0～7 d后存活率明显增加。LPS处理后6～48 h,与WT组比较,P2Y12 KO组BALF中性粒细胞数量和蛋白含量均明显降低（P<0.05或P<0.01）;HE染色结果显示,LPS处理24 h后,与WT组比较,P2Y12 KO组肺组织中性粒细胞募集明显减少（P<0.01）,并且肺部聚合纤维蛋白染色较浅,肺水肿程度明显降低（P<0.01）;ELISA实验结果显示,LPS处理24 h后,与WT组比较,P2Y12 KO组肺组织炎症因子TNF-α、IL-6、IL-10和MIP1b含量明显下降（P<0.01或P<0.001）。结论 P2Y12敲除可显著降低LPS诱导的小鼠肺部炎症反应并减少肺损伤。     

Fmr1基因敲除小鼠耳蜗的GABAα1受体的表达

目的 对4周龄Fmr1基因敲除小鼠耳蜗的GABAα1受体表达进行观察,探讨耳蜗GABAα1受体的表达是否受FMRP的影响.方法 使用PCR技术对Fmr1基因敲除小鼠鉴定后,对4周龄的Fmr1基因敲除小鼠和野生型小鼠进行耳蜗的GABAα1受体免疫组织化学的表达观察,数据采用多因素方差分析处理.结果 耳蜗HE染色结果:4周龄组KO鼠较WT鼠形态学观察无差异.4周龄KO小鼠的耳蜗中GABAα1受体表达的平均阳性细胞数均低于WT小鼠,P＜0.01,差异具有统计学意义.结论 GABAα1受体表达的降低可能与FMR1基因KO小鼠听源性惊厥发病有关.     

IL⁃17A对小鼠实验性牙周炎骨破坏作用研究

目的：通过构建白介素?17A（interleukin?17A,IL?17A）基因敲除小鼠实验性牙周炎模型,初探IL?17A参与调控牙周炎骨破坏的机制。方法：选用雄性IL?17A基因敲除（knock out,KO）的C57BL/6小鼠和相同基因背景的野生型（wild type,WT）C57BL/6小鼠,通过结扎和喂菌诱导小鼠实验性牙周炎,WT小鼠及KO小鼠均分为正常对照组和牙周炎组。确认结扎4周后处死小鼠收集上颌骨,进行Micro?CT断层成像、HE染色、抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate?resistant acid phosphatase,TRAP）染色、免疫组化和组织病理学分析。结果：在喂菌和结扎诱导的小鼠实验性牙周炎模型中,在Micro?CT的三维重建及近远中向截面上,KO小鼠较WT小鼠牙槽骨吸收减少,KO小鼠上颌第二磨牙牙槽嵴顶到釉牙骨质界的近中线性距离为（0.51 ± 0.11）mm,远中为（0.45 ± 0.04）mm,显著低于WT小鼠的近中（0.61 ± 0.09）mm和远中（0.65 ± 0.08）mm（P < 0.05）;KO小鼠骨体积分数比为41.88 ± 1.82,显著高于WT小鼠的36.55 ± 2.08（P < 0.05）;KO小鼠骨密度为84.39 ± 2.11,显著高于WT小鼠的76.90 ± 2.55（P < 0.05）;HE染色中可见牙槽骨吸收减少;TRAP染色中可见TRAP染色阳性细胞减少;免疫组化结果显示牙周组织核因子κB受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor κB ligand,RANKL）的表达降低。结论：牙周炎中IL?17A可能有促进牙周炎发生发展及促进牙槽骨吸收的作用。     

纳米级炭黑颗粒通过激活NLRP3炎性小体诱导小鼠急性肺炎反应

目的：探讨NLRP3炎性小体在纳米级炭黑颗粒致急性肺炎中的作用。方法：采用动物全身动态暴露系统建立C57BL/6小鼠低剂量分别连续动态吸入纳米级炭黑颗粒3 d及7 d模型,利用ELISA法检测血清及肺泡灌洗液中白细胞介素?1β（interleukin?1β,IL?1β）含量,并收集小鼠全血,行血常规检查。小鼠处死后解剖,通过HE法检测小鼠肺组织病理损伤情况,通过免疫组织化学染色法检测小鼠肺组织NLRP3蛋白表达,之后利用NLRP3基因敲除小鼠做进一步验证。结果：HE染色结果表明,短期暴露于纳米级炭黑颗粒,小鼠出现急性肺部炎症,主要表现为肺泡间隔增宽、炎性细胞浸润,且暴露组与对照组相比病理评分差异具有统计学意义,免疫组化结果表明,暴露组NLRP3阳性细胞数明显多于对照组,暴露组肺泡灌洗液中IL?1β水平明显高于对照组。结论：NLRP3炎性小体的激活参与了纳米级炭黑颗粒短期暴露引起的小鼠急性肺炎。     

Unc13基因胰岛β细胞条件性敲除小鼠模型的构建和鉴定

目的 构建Cre重组酶系统调控的Unc13基因胰岛β细胞条件性敲除小鼠,为Unc13基因在胰岛素分泌中扮演的角色和作用机制的体内实验研究提供更特异的动物模型。方法 运用CRISPR/Cas9技术构建Unc13^flox/flox转基因小鼠,将其与胰岛β细胞特异性表达Cre重组酶（Ins2-cre）工具鼠进行杂交,采用聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）和测序等方法对其子代小鼠的基因型进行鉴定,并对该基因敲除（knock out,KO）小鼠及其同窝野生（wild type,WT）小鼠的体质量、糖耐量、胰岛素分泌水平进行测定。结果 成功构建胰岛β细胞特异性Unc13基因条件性敲除小鼠（以下简称为Unc13 KO鼠）。进一步研究显示Unc13 KO鼠与WT鼠相比,体质量无明显变化,但糖耐量受损,胰岛素第一时相分泌下降。结论 成功构建了Unc13基因胰岛β细胞条件敲除小鼠动物模型,为探讨Unc13基因在糖尿病发生、发展中的作用提供研究平台。     

Fmr1基因敲除小鼠耳蜗的GABAa1受体的表达

目的 对4周龄Fmr1基因敲除小鼠耳蜗的GABAa1受体表达进行观察,探讨耳蜗GABAa1受体的表达是否受FMRP的影响。方法使用PCR技术对Fmr1基因敲除小鼠鉴定后,对4周龄的Fmr1基因敲除小鼠和野生型小鼠进行耳蜗的GABa1受体免疫组织化学的表达观察,数据采用多因素方差分析处理。结果耳蜗HE染色结果：4周龄组KO鼠较WT鼠形态学观察无差异。4周龄KO小鼠的耳蜗中GABAa1受体表达的平均阳性细胞数均低于WT小鼠,P〈0.01,差异具有统计学意义。结论GABAa1受体表达的降低可能与FMR1基因KO小鼠听源性惊厥发病有关。     

胆总管结扎所致肝损伤中Nrf2对细胞信号传导和基因表达的影响

目的 研究核因子相关因子 2（Nrf2）在胆汁淤积中的作用。方法 野生鼠（WT）和Nrf2基因敲除小鼠(KO)给予胆总管结扎手术,应用蛋白杂交技术观察丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号传导途径的变化;应用RNA酶保护测定（RPA）技术测定基因变化。结果 在BDL组血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）显著升高;纤维粘连蛋白的表达在KO鼠明显增多;p-JNK、p-stat3、p-AKT、p-p38在WT鼠的BDL组的活化强度较大。Nrf2的靶基因NQO1,谷胱甘肽S 转移酶(GST)的同工酶（GST-Ya,GST-pa）在WT鼠的BDL组明显上调,而在KO鼠中则被抑制。TGF-β1、TIMP-1、胶原蛋白1在KO鼠的BDL组上调幅度较大。结论 在胆总管结扎后胆汁淤积所致肝损伤中,Nrf2对MAPK信号传导和炎症、纤维化过程均有影响,部分通过上调抗氧化基因的表达起到细胞保护作用。     

α-细辛醚对FMR1基因敲除小鼠旷场行为的干预作用

目的探讨α-细辛醚对FMR1基因敲除小鼠的旷场行为的干预作用。方法通过对30日龄FMR1基因敲除小鼠连续腹腔注射不同剂量α-细辛醚5天,用药第5天进行旷场行为实验,观察能否改善KO鼠过度活动的表型。结果在旷场行为实验中,与WT鼠相比,未使用α-细辛醚的KO鼠的总运动长度及总跨格次数,中央格(区4)活动时间,中央格(区4)进入次数均比WT鼠多,P<0.05;使用α-细辛醚后,KO鼠α-细辛醚6~24 mg/kg剂量组与生理盐水(0 mg/kg)组比较,旷场实验运动长度及跨格次数均有减少(P<0.05)。结论 6~24mg/kgα-细辛醚能改善KO鼠活动过度的表型,可能对FMR1基因敲除小鼠有治疗作用。     

α7nAChR基因敲除HIV-1gp120转基因小鼠模型的构建

目的 通过构建双基因编辑小鼠模型（α7R-/-/gp120+）,为探索α7乙酰胆碱受体（α7 nAChR）介导gp120中枢神经毒性的作用和机制提供研究基础。方法 α7 nAChR基因敲除小鼠（α7R-/-）与HIV-1 gp120转基因小鼠（gp120+）杂交（F0）,从产生的F1小鼠中,选取基因型为α7R+/-/gp120+的小鼠进一步交配,得到F2小鼠。PCR法鉴定和筛选F3小鼠基因型,免疫组化分析双转基因动物模型蛋白表达;体外实验使用gp120蛋白和α7 nAChR抑制剂处理小胶质细胞,ELISA检测各组IL-1β与TNF-α表达情况。结 果 F3小鼠的PCR结果符合预期,其中有2只双基因编辑成功的小鼠。免疫组化结果显示双基因编辑小鼠（α7R-/-/gp120+）的脑组织缺乏α7 nAChR的同时高表达gp120蛋白。体外实验结果表明Gp120可促进小胶质细胞分泌IL-1β与TNF-α,而抑制α 7nAChR后IL-1β与TNF-α表达明显降低（P<0.001）。结论 α7R-/-/gp120+双基因修饰小鼠成功构建,且具有稳定遗传的特点,可为后续探索α7 nAChR介导gp120中枢神经毒性的作用和机制提供重要的动物模型。     

科技动态

Dat1基因敲除小鼠的行为学研究多巴胺(DA)运输体基因(Dat1)编码重吸收多巴胺能神经递质的蛋白质,起终止多巴胺能神经递质活动的功能。为了研究KO小鼠行为异常的行为和生化机制,Vladimir MPogorelov等人研究了野生型(WT)、Dat1杂合型(HZ)、和Dat1基因敲除(KO)3种雄性小鼠(3~5月龄)的行为学试验,这3种小鼠均来自C57BL/6J和129 Sv/J杂交Dat1小鼠,杂交15代。KO小鼠中Dat1表达消失,HZ小鼠有50%的Dat1表达。跟WT对照组相比,KO小鼠细胞外的DA增加2~5倍。尽管KO小鼠的旷野活动能力跟WT和HZ相似,但能力较之为强。HZ小鼠紧张度低,能…     

波形蛋白对EV71感染小鼠脑组织引起NLRP3炎性小体活化的影响

目的观察肠道病毒71型（EV71）感染的小鼠中枢神经系统中波形蛋白（VIM）介导NLRP3炎性小体的活化。方法取3~ 5 d龄的VIM基因敲除型乳鼠（VIM-/-）40只,随机分为EV71感染实验组和空白对照组,20只/组,实验组每只腹腔注射浓度为1× 108半数组织培养感染剂量（TCID50）病毒液10 μL,空白组腹腔注射无菌PBS 10 μL,再将同品质的野生型乳鼠（WT）40只以同样 方式分组处理。观察小鼠感染状态1周,提取小鼠脑脊液（CSF）和脑组织全蛋白、RNA及组织切片,通过Western blot、ELISA、 RT-PCR检测小鼠中枢神经系统的炎症小体激活状况,以及免疫组化技术考察小鼠中枢神经系统的损伤。结果与空白组比 较,VIM-/-实验组小鼠在感染EV71 后CSF 和脑组织中NLRP3 炎症小体及其下游产物IL-1β、caspase-1 含量无明显变化;而 WT实验组小鼠相较VIM-/-型实验组的NLRP3、IL-1β和caspase-1含量显著升高（P<0.05）;同时WT型实验组IL-1β和caspase-1 的mRNA拷贝数亦明显高于VIM-/-型实验组小鼠（P<0.05）;VIM-/-感染EV71 的脑组织神经元受损程度较WT小鼠明显轻微 （P<0.05）。结论EV71通过感染小鼠脑组织诱发VIM基因介导的NLRP3炎症小体活化,释放IL-1β和caspase-1,这可能是中枢 神经系统炎症和神经元损伤的原因之一。     

髓系特异性SOCS3 基因敲除小鼠的构建及应用

目的:通过Cre-loxP 基因敲除系统特异性敲除髓系SOCS3 基因,构建早期髓系来源抑制细胞（eMDSCs）高浸润荷瘤鼠模 型。方法: 通过将SOCS3fl/-小鼠与Lyz2-Cre 小鼠杂交繁育, 获得髓系特异性SOCS3 基因敲除小鼠,PCR 法鉴定小鼠基因型, Western 印迹验证基因敲除效果, 流式细胞术检测髓系特异性SOCS3 基因敲除小鼠骨髓中eMDSCs 比例及其对T 细胞的抑制 作用, 并在该小鼠基础上分别构建乳腺癌、肺癌和黑色素瘤3 种eMDSCs 高浸润荷瘤鼠模型, 流式细胞术检测肿瘤组织中 eMDSCs 浸润情况。结果:PCR 鉴定和Western印迹检测证实髓系特异性SOCS3 基因敲除小鼠构建成功,流式细胞术结果表明 髓系SOCS3 基因敲除小鼠骨髓中eMDSCs 比例显著升高（t=17.94,P＜0.001）,且该群eMDSCs 抑制T 细胞增殖（t=14.21, P＜0.001）、促进T 细胞凋亡（t=13.53,P＜0.001）。在黑色素瘤、乳腺癌、肺癌3 种髓系特异性SOCS3 基因敲除荷瘤鼠的肿瘤组织 中eMDSCs 数量显著增加（t=24.14、24.56、14.93,均P＜0.001）。结论:通过髓系特异性SOCS3敲除可成功构建eMDSCs 高浸润荷 瘤鼠模型。     

OPN诱导小鼠MSCs向表皮细胞分化促进创面愈合的研究

目的 以骨桥蛋白(osteopontin,OPN)基因敲除小鼠及野生型小鼠为研究对象,探讨骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)分化为表皮细胞的潜能及骨桥蛋白在分化过程中的作用.方法 体外实验:将分离培养的野生型(WT)和基因敲除型(KO)新生鼠(鼠龄1d)MSCs鉴定纯度后分别设为WT组和KO组,取其第3代分别在表皮转化培养体系中孵育,通过镜下观察、流式细胞术、免疫荧光染色、Western blot等方法,比较两组表皮细胞标志物(CK14)表达水平的差异.动物实验:实验分4组,WT组小鼠创周注射GFP-MSCs (WT/MSCs)组,WT小鼠创周注射PBS(WT/PBS)组,KO小鼠创周注射GFP-MSCs (KO/MSCs)组,KO小鼠创周注射PBS(KO/PBS)组,每组各8只雄鼠,鼠龄6～8周,体质量20 ～25 g,按分组将分离培养的GFP-MSCs和PBS注射到创周,观察创面愈合及GFP-MSCs向表皮细胞分化的情况.结果 分离培养的MSCs呈梭形或成纤维细胞样生长,流式细胞术检测MSCs的纯度超过91％;诱导分化第12、17天的两组细胞检测发现,WT组和KO组的细胞均表达CK14;第17天免疫荧光结果示WT组CK14的表达阳性率(0.936 3±0.009 5)明显高于KO组(0.647 5±0.023 1),(P＜0.01);Western blot检测结果也显示KO组的CK14表达量(0.3894±0.016 8)明显低于WT组(0.614 6±0.015 3),(P＜0.01).动物实验WT/PBS组创面愈合速度快于KO/PBS组(P＜0.05),WT/MSCs组的创面愈合速度快于WT/PBS组(P＜0.05),注射的GFP-MSCs向表皮细胞分化的能力WT/MSCs组强于KO/MSCs组(P＜0.05).结论 OPN在体内、体外均可诱导MSCs分化为表皮细胞,进而促进创面愈合.     

Slc4a11基因缺失在CHED发病中的作用

目的　探讨Slc4a11缺失在先天性遗传性角膜内皮营养不良（congenital hereditary endothelial dystrophy, CHED）发病中的作用及其与自噬信号通路的潜在调控关系。方法　利用CRISPR/Cas9技术构建Slc4a11基因敲除小鼠模型。以野生型小鼠（wild type, WT）和Slc4a11基因敲除小鼠（knockout, KO）为实验对象,通过Western印迹法、RT-qPCR、茜素红染色、H-E染色、透射电镜评估KO小鼠角膜表型特征的变化。通过Western印迹法和RT-qPCR检测自噬标志物LC3、beclin1、p62在角膜内皮的表达量。透射电镜观察两组小鼠角膜内皮细胞自噬情况。结果　Slc4a11基因敲除小鼠角膜显示与CHED相似的表型特征,包括角膜厚度增加;角膜内皮细胞体积增大,密度减小;后弹力层增厚;角膜内皮空泡形成。KO小鼠与WT小鼠相比,LC3、beclin1的mRNA和蛋白的相对表达量上升,差异有统计学意义（P<005）,而p62的mRNA和蛋白的相对表达量下降,差异有统计学意义（P<005）。KO小鼠角膜内皮细胞内自噬体明显多于WT小鼠。结论　利用CRISPR/Cas9技术构建的Slc4a11基因敲除小鼠角膜显示CHED特征的表型。同时Slc4a11缺失通过增强自噬信号通路参与CHED的发病机制。     

miR-125a-5p基因敲除C57BL/6J小鼠的构建

目的：构建miR-125a-5p基因敲除小鼠并进行基因鉴定,并探讨基因敲除小鼠体内miR-125a-5p对靶基因Foxp3的调控。方法：利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,以C57BL/6J小鼠为背景,对miR-125a-5p基因位点进行基因敲除,培育纯合miR-125a-5p基因敲除小鼠。采用裂解法提取鼠尾组织基因组DNA,进行PCR反应检测亲代纯合miR-125a-5p基因敲除小鼠基因型,并选用雌、雄均为纯合子的基因敲除鼠作为亲代种鼠进行配种繁殖。通过全自动蛋白表达分析系统检测小鼠脾脏组织Foxp3的蛋白表达。结果：成功构建miR-125a-5p基因敲除小鼠,琼脂糖凝胶电泳显示PCR产物为240 bp或0 bp单条带的为纯合型基因敲除（KO）小鼠,鉴定获得668 bp或428 bp单条带的为野生型（WT）小鼠,与预期的目的基因片段分子量大小一致,成功鉴定了miR-125a-5p基因敲除小鼠的基因型。选用雌、雄均为纯合子的基因敲除鼠进行配种繁育,获得了一批miR-125a-5p敲除纯合子基因型小鼠。与WT小鼠相比,miR-125a-5p基因敲除小鼠的脾脏组织中Foxp3表达降低（...     

QPRT基因功能缺失对肾脏发育的影响

目的：研究喹啉磷酸核糖基转移酶（quinolinic phosphoribosyl transferase,QPRT）基因功能缺失对胚胎肾脏发育的影响。方法：通过免疫组化确定QPRT在胎鼠肾脏组织的表达;构建QPRT基因缺陷型小鼠模型,取QPRT+/+（WT）型和QPRT-/-（KO）型小鼠的血清进行肾功能检测;称重法计算KO及WT组小鼠的体重、肾脏重量及肾脏系数;用HE染色观察小鼠及其子代肾脏病理组织学变化。结果：在妊娠13 d胎鼠肾脏组织,QPRT在发育中的输尿管芽中强烈表达。在基因敲除小鼠模型中,QPRT-/-小鼠的肾脏系数（肾重/体重）显著低于野生型小鼠（P<0.05）,且QPRT-/-小鼠的尿素氮、血肌酐、尿酸水平高于野生型组（P <0.05）。肾脏组织HE染色显示QPRT-/-仔鼠的肾脏实质部位局部呈现蜂窝状囊性扩张;QPRT+/-仔鼠见肾脏皮质间质局灶性疏松水肿;QPRT+/+仔鼠肾脏未见明显病理组织学变化。结论：QPRT基因功能缺失可能影响胚胎肾脏发育。