小鼠 Tox3 基因重组慢病毒载体的构建及其在卵巢颗粒细胞中的表达

目的：构建重组慢病毒载体pCDH—Tox3-Flag,并检测其转染小鼠原代卵泡颗粒细胞后的表达情况。方法：利用DNA重组技术将小鼠Tox3~N克隆人慢病毒表达载体pCDH—MCS—T2A—copGFP—MSCV中,通过酶切、测序验证后,将重组慢病毒载体pCDH—Tox3-Flag、包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2．G共转染HEK293FF细胞,包装重组慢病毒LV—Tox3-Flag,并感染小鼠原代颗粒细胞,用反转录聚合酶链反应（RT—PCR）检测Tox3mRNA的转录水平,蛋白质印迹（Westernblot）法检测T0x3-Flag蛋白的表达情况。结果：经酶切及测序结果证实,构建了重组慢病毒载体LV—Tox3;RT—PCR及Westernblot结果显示慢病毒感染小鼠原代颗粒细胞后,Tox3基因能在细胞内正确转录、翻译并稳定表达TOX3蛋白。结论：成功建立Tox3基因慢病毒表达载体LV—Tox3-Flag,包装的慢病毒能够成功感染小鼠原代颗粒细胞,并使Tox3基因得到稳定表达,为后续研究Tox3基因在生殖相关疾病的生理与病理作用奠定了基础。     

人类免疫缺陷病毒I型Tat真核表达载体的构建及鉴定

目的构建人类免疫缺陷病毒Tat基因真核表达质粒,并研究该质粒在真核细胞中的有效表达。方法以含有HIV-1全长基因的质粒pNL4-3为模板,通过PCR扩增HIV-1 Tat第一外显子,应用基因工程技术将扩增的基因片段插入真核表达质粒pcDNA3.1(+),构建重组真核表达质粒pcDNA3.1-tat,经限制性内切酶酶切分析及测序鉴定正确后,应用脂质体转染技术转染入huh-7细胞。RT-PCR检测其基因转录情况,Western Blot鉴定其是否能够表达相应的目的蛋白质。结果成功扩增了Tat基因,酶切和测序证明正确构建了重组真核表达质粒pcDNA3.1-tat,RT-PCR和Western blot方法证实该质粒能在huh-7真核细胞中有效表达HIV-1 Tat目的蛋白质。结论成功构建了HIV-1 Tat基因的真核表达质粒载体,并在huh-7中表达,为在huh-7细胞模型中研究Tat的功能奠定了基础。     

RyR2-shRNA重组慢病毒载体的构建及其对离体心肌细胞RyR2基因表达的影响

目的构建携带RyR2-shRNA的慢病毒载体,并检测其对小鼠离体心肌细胞中RyR2的基因沉默效果。方法设计并合成针对小鼠RyR2基因的shDNA,克隆入含U6启动子和EGFP报告基因的慢病毒载体psiHIV-U6-eGFP,构建表达RyR2-shRNA的慢病毒载体,通过将慢病毒转移质粒和包装质粒共转染293T细胞,得到重组慢病毒载体颗粒,然后离体感染小鼠心肌细胞,采用Real-timePCR检测RyR2在mRNA水平的沉默效应。结果经测序证实RNAi慢病毒载体构建成功并成功包装。流式细胞仪测得重组慢病毒感染小鼠心肌细胞的阳性率达80%以上。Real-timePCR证实,重组慢病毒Lenti-siRyR2感染的小鼠心肌细胞中RyR2在mRNA水平基因抑制率达90%以上。结论成功构建了表达RyR2-shRNA的重组慢病毒表达载体,并在小鼠心肌细胞中实现有效的基因沉默效应。     

肾上腺髓质素基因腺病毒表达载体的构建及其对骨髓间充质干细胞增殖的影响

目的:构建表达大鼠AM基因的重组腺病毒载体,探讨其对MSCs增殖的影响.方法:设计AM基因上下游引物,以大鼠肾脏组织总RNA为模板,经RT-PCR扩增获得AM基因全部序列.片段回收后经酶切,定向插入腺病毒穿梭质粒,获得重组质粒pshuttle-CMV-AM.经双酶切、PCR及插入片段测序鉴定后,将正确重组体转化包含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183菌.同源重组后用选择性培养基筛选阳性克隆,提取质粒,将重组腺病毒质粒分别进行酶切、线性化、纯化,用脂质体转染293细胞.制备病毒上清并测定其滴度,并感染大鼠骨髓间充质干细胞,用MTT方法评估其对MSCs增殖的影响.结果:完成构建含有AM基因的重组腺病毒,RT-PCR及Western blot检测证实AM在MSCs中表达,并能够促进其增殖(缺氧组与缺氧 AM组相比,P＜0.01).结论:构建重组腺病毒载体,并在MSCs表达AM蛋白.     

携带有Foxp3基因慢病毒载体的构建及其转染大鼠T细胞的实验研究

[目的]构建携带有Foxp3基因的慢病毒载体,使之能高效地转染原代大鼠T细胞。[方法]采用PCR技术从携带有Foxp3基因的FL24796质粒扩增出Foxp3基因序列,并将其接入慢病毒载体pRRLSIN-LacZα中,经PCR、酶切和测序鉴定后,转染人293细胞和大鼠T细胞,并通过流式细胞技术观察病毒转染效果。[结果]经过PCR、酶切和测序鉴定,pLenti-Foxp3-EGFP慢病毒载体被成功构建,其转染T细胞的最佳感染复数为50︰1,所包装的病毒对大鼠T细胞的感染效率可达28.5%左右。[结论]成功地构建出携带有Foxp3基因的慢病毒载体,并能高效地转染进入原代大鼠T细胞。     

A型流感病毒NP基因的克隆表达与鉴定

目的 构建人A型流感病毒NP基因原核重组表达载体并在E.coli BL21(DE3)中表达.方法 从流感患者咽分泌物中提取总RNA,设计特异性引物,经RT-PCR得到NP基因开放阅读框cDNA后定向克隆到原核表达载体pET28b(+),构建含目的 基因的pET28b(+)-NP重组质粒,经酶切、PCR和测序正确后转化E.coli BL21(DE3),0.1mmol/L IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定.结果 ①成功构建了pET28b(+)-NP重组质粒;②在E.coli BL21(DE3)中表达了一分子量约55 kDa的融合蛋白,经Western blot鉴定正确.结论 重组质粒pET 28b(+)-NP构建成功并在E.coli BL21(DE3)中高效表达了人A型流感病毒NP蛋白,为后续该蛋白的功能研究奠定了基础.     

子宫颈癌细胞株表达kiss-1基因重组慢病毒的构建

目的 探讨体内表达kiss-1基因的方法 治疗子宫颈癌的可行性,构建可表达kiss-1基因的重组慢病毒.方法 采用RT-PCR方法 ,根据制备两端含有酶切位点的kiss-1基因的cDNA片段,通过常规分子生物学手段在确保信号肽酶的识别点的条件下,构建可以表达kiss-1基因的慢病毒包装专用质粒pLenti6/V5D-TOPO,与其他辅助质粒共同转染293细胞,获得能表达kiss-1的重组慢病毒.结果 测序证实克隆kiss-1的cDNA与Genebank提供的序列完全一致;经限制性内切酶物理图谱方法 证实已经成功地将kiss-1和cDNA重组到含NT4的信号肽和前导序列下游.经RT-PCR方法 证明重组慢病毒在人子宫颈癌Hela细胞中可以表达kiss-1基因.结论成功构建了能够表达kiss-1的重组慢病毒.     

一株新蛋白磷酸酶基因（Sy2）的原核表达载体构建及鉴定

目的用含有人Sy2酪氨酸磷酸酶基因的pOTB7质粒,构建Sy2原核表达重组子,并用该重组子转化原核细胞,表达出含Sy2的融合蛋白,为将来以此融合蛋白为抗原免疫Balb/c小鼠,制备单克隆抗体,进一步研究该基因的功能打好基础。方法用PCR扩增Sy2的PP2C结构域序列,限制性内切酶双酶切,构建到表达载体pET28a( )中,酶切、测序等鉴定后,重组子pET28a( )-Sy2转染原核细胞,用载体标签His抗体经SDS-PAGE、Western blot方法检测Sy2重组蛋白的表达。结果成功构建出pET28a( )-Sy2重组质粒,Western blot方法检测出融合蛋白的表达。结论成功构建原核表达载体并在原核细胞中表达成包涵体,这种包涵体可以作为抗原制备Sy2的单克隆抗体。     

长链非编码RNA ENSMUST00000127391重组慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建表达长链非编码RNA(long non-coding RNA,lnc RNA)ENSMUST00000127391(LINC127391)的重组慢病毒载体,并感染小鼠肾小球系膜细胞(mice mesangial cells,MMCs)使LINC127391在高糖的MMCs中表达。方法以MMCs的cDNA为模板利用PCR法扩增LINC127391全长,将其插入pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP载体,构建重组慢病毒载体pCDH-LINC127391。将重组目的质粒pCDH-LINC127391与包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G共转染到293T细胞,收获表达LINC127391的重组慢病毒上清液,检测病毒滴度。病毒液感染MMCs,通过实时定量PCR法检测LINC127391的表达情况。结果质粒酶切以及测序鉴定结果证明重组质粒pCDH-LINC127391构建成功,并测得病毒液滴度约为2×10~7efu/mL。病毒液感染MMCs后实时定量PCR检测发现LINC127391表达明显增加。结论成功构建了重组质粒pCDH-LINC127391。     

高致病性禽流感病毒H5N1亚型核蛋白NP真核表达载体的构建、表达与鉴定

目的构建高致病性禽流感病毒H5N1亚型核蛋白(NP)的真核表达载体,并在哺乳动物细胞中表达、鉴定其编码重组蛋白NP。方法采用RT-PCR法扩增NP基因,T-A克隆到pMD18-T载体中构建pMD18-T-NP质粒。经PCR、双酶切鉴定后,双酶切阳性质粒与pXJ40-HA载体,电泳后胶回收,连接目的片段,构建pXJ40-HA-NP质粒,经PCR、双酶切、测序分析鉴定为阳性的质粒即为NP蛋白的真核表达载体。转染293T细胞后,采用免疫印迹法(Western blot)鉴定重组NP蛋白的表达。结果成功构建了高致病性禽流感病毒H5N1亚型NP基因的真核表达载体,并在293T细胞中成功表达出分子量为56kD的重组蛋白。结论成功构建的NP蛋白真核表达载体为进一步研究其功能,研发高致病性禽流感病毒H5N1亚型的诊断、治疗方法和疫苗奠定了基础。     

人miR-1908慢病毒载体构建及在人脂肪前体细胞中的表达验证

目的 构建人miR-1908慢病毒表达载体,包被病毒并检测其在人脂肪前体细胞中过表达效果。方法 以人脂肪细胞基因组DNA为模板,PCR高保真扩增包含miR-1908区域上下游各100bp左右的基因组DNA,亚克隆入慢病毒表达载体,与包装质粒共转染HEK-293T细胞,包装病毒,收取病毒上清,纯化后感染人脂肪前体细胞,36 h开始观察荧光标记,72 h收取细胞,抽提RNA,Realtime PCR检测慢病毒感染下miR-1908的相应表达量。结果 成功构建人miR-1908慢病毒表达载体,包装获得的病毒感染人脂肪前体细胞的效率可达到70%以上,miR-1908过表达水平可接近2倍。结论 本研究成功构建了人miR-1908慢病毒过表达载体,包被的慢病毒可以在人脂肪前体细胞中实现过表达效果,为后续功能研究奠定了基础。     

负载ERRα基因片段慢病毒构建及表达

目的构建编码人雌激素相关受体α(hERRα)的慢病毒载体,并测定其滴度,观察hERRα基因在体外的表达情况及其对人肺癌细胞A549增殖的影响。方法采用PCR扩增hERRα基因片段,插入转移载体pW-PXLD,用磷酸钙法将pWPXLD-hERRα、psPAX2和pMD2.G共转染293T细胞包装慢病毒,浓缩后测定病毒滴度,再将病毒感染A549细胞,用蛋白印迹方法测定感染病毒的A549细胞中hERRα的表达。选择合适滴度的病毒感染A549细胞,采用cell-titer的方法检测感染病毒的A549细胞的活力。结果测序结果显示成功构建了重组质粒pWPXLD-hERRα,测定浓缩后的病毒滴度为1.8×108TU/mL,蛋白印迹方法检测到慢病毒感染的A549细胞中hERRα呈阳性表达;cell-titer glo检测结果表明过表达hERRα能促进细胞增殖。结论成功构建了负载hERR基因片段的慢病毒,hERRα能在感染的A549细胞中高效表达,并促进感染病毒的A549细胞增殖。     

人miR-146b慢病毒载体构建及人脂肪细胞中表达验证

目的 构建人miR-146b慢病毒表达载体,包被病毒并检测其在人脂肪细胞中过表达效果。方法 以人基因组DNA为模板,PCR高保真扩增包含miR-146b区域上下游各100bp左右的基因组DNA,亚克隆入慢病毒表达载体,与包装质粒共转染HEK-293T细胞,包装病毒,收取病毒上清,纯化后感染人脂肪前体细胞,36 h开始观察荧光标记,72 h收取细胞,抽提RNA,Realtime PCR检测慢病毒感染下miR-146b的相应表达量。结果 成功构建人miR-146b慢病毒表达载体,包装获得的病毒感染人脂肪细胞的效率可达到85%以上,miR-146b过表达水平可接近4倍。结论 本研究成功构建了人miR-146b慢病毒表达载体,包被的慢病毒可以在人脂肪细胞中实现过表达效果,为后续功能研究奠定了基础。     

含热休克蛋白70和绿色荧光蛋白双顺反子慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建并鉴定人热休克蛋白70(Hsp70)和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因双顺反子慢病毒表达载体,以探索Hsp70对细胞保护作用的影响。方法通过基因重组技术将人Hsp70连接到含EGFP的慢病毒载体中,包装并收集病毒,感染人胰腺癌细胞系Aspc-1细胞后,通过荧光显微镜观察EGFP的表达,同时利用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹(Westernblot)技术检测Hsp70基因的表达情况。结果酶切和测序鉴定Hsp70-IRES-EGFP双顺反子慢病毒载体构建正确,包装病毒感染细胞后荧光显微镜观察到细胞发绿色荧光,RT-PCR和western blot检测均表明感染病毒后细胞Hsp70的表达量明显增加。结论成功构建了Hsp70-IRES-EGFP双顺反子慢病毒载体,为后续研究Hsp70的功能和作用机制奠定了一定的基础。     

H5N1亚型禽流感病毒聚合酶酸性蛋白真核表达载体的构建与表达

目的构建甲型禽流感病毒H5N1亚型聚合酶酸性蛋白(PA)的真核表达载体,并表达其编码蛋白PA。方法采用RT-PCR法扩增PA基因,克隆至pMD18-T载体中构pMD18-T-PA质粒。双酶切pMD18-T-PA质粒与pXJ40-HA质粒后,胶回收并连接目的片段,构建真核表达载体pXJ40-HA-PA,鉴定后转染293T细胞。采用免疫印迹法(Western blot)鉴定重组PA蛋白的表达。结果成功构建了禽流感病毒H5N1亚型PA基因的真核表达载体,并在真核细胞中成功表达出分子量为75kD的重组蛋白。结论成功构建禽流感病毒H5N1亚型PA基因的真核表达载体,为后期进一步研究PA蛋白的功能奠定了基础。     

CCL21转染PANC-1细胞株及对其生物学行为的影响

目的观察CCL21重组慢病毒载体转染PANC-1细胞株及对其生物学行为的影响。方法构建的CCL21重组慢病毒载体转染胰腺癌细胞株PANC-1,通过PCR、Western blot进行验证。结果构建的重组CCL21-慢病毒成功转染胰腺癌细胞株并稳定表达,但转染后的胰腺癌细胞株PANC-1其生物学行为未发生明显变化。结论通过PCR、Western blot检测,构建的重组CCL21-慢病毒成功转染胰腺癌细胞株并稳定表达,但转染后的胰腺癌细胞株PANC-1其生物学行为未发生明显变化。     

Hsa miR-7慢病毒表达载体的构建及其在人卵巢癌细胞HO8910-PM中表达的有效性

目的：构建Hsa miR-7的慢病毒表达载体,感染人卵巢癌细胞HO8910-PM后检测微小RNA 7（miR-7）及其靶基因血管内皮生长因子受体（EGFR）的表达,为研究miR-7在HO8910-PM中的生物学功能奠定基础。方法：将聚合酶链反应（PCR）扩增得到的miR-7前体序列pre-miR-7和慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen1经酶切后连接产生pLVX-miR-7-IRES-ZsGreen1,经酶切及测序鉴定正确后在HEK293T细胞中包装病毒,病毒浓缩后感染HO8910-PM用实时荧光定量PCR（qPCR）方法检测感染后的HO8910-PM中pre-miR-7和miR-7的表达,qPCR及蛋白质印迹（Western blot）方法检测其靶基因EGFR的表达。结果：酶切及测序结果示慢病毒表达载体pLVX-miR-7-IRES-ZsGreen1构建正确,病毒浓缩液感染HO8910-PM后能有效提高pre-miR-7的表达（t=17.909,P=0.004）和miR-7的表达（t=35.320,P=0.024）,并能有效降低其靶基因EGFR的mRNA的表达（t=8.83,P=0.005）及蛋白的表达（t=22.14,P=0.002）。结论：成功构建了pLVX-miR-7-IRES-ZsGreen1慢病毒表达载体及稳定表达miR-7的HO8910-PM细胞亚系。     

构建siRNA慢病毒载体抑制A549细胞株VEGF受体KDR基因的表达

目的构建针对血管内皮生长因子(VEGF)受体KDR基因的siRNA慢病毒载体,鉴定其对肺癌细胞株A549基因干扰效果。方法设计合成针对KDR编码区的三条siRNA序列及阴性对照序列,克隆到PGCL-GFP载体,构建重组质粒,行PCR鉴定、DNA测序分析;转染人肺癌细胞株A549,Real-Time PCR及Western blot分别检测KDR mRNA、蛋白水平变化;细胞计数法绘制细胞生长曲线,流式细胞仪检测细胞周期。结果成功构建pGCL/KDR-siRNA重组质粒。A549干扰组KDR mRNA表达率下降,KDR蛋白表达量明显减少,细胞周期改变。结论构建的pGCL/KDR-siRNA表达载体可在mRNA和蛋白水平上有效抑制A549细胞株KDR基因的表达。